基于荧光的磷脂翻转酶活性检测方法

摘要

我们描述了一种基于荧光的检测方法，用于测量重组了视蛋白的大型单层脂质体中的磷脂翻转活性。

摘要

翻转酶以不依赖ATP的方式双向转运磷脂分子穿过膜双层。首个被鉴定并经生物化学验证的翻转酶是视紫红质的脱辅基蛋白——视蛋白。视紫红质是一种G蛋白偶联受体，定位于视网膜视杆细胞盘膜中，负责光信号的感知。视紫红质的翻转酶活性不依赖于其配体11-顺式-视黄醛， 即， 视蛋白（opsin）本身也具有翻转酶（scramblase）活性。尽管组成型和调控型磷脂翻转在细胞生理过程中发挥重要作用，但迄今为止除视蛋白外，仅发现少数几种磷脂翻转酶。本文介绍一种基于荧光的检测方法，用于测定视蛋白的翻转酶活性。将视蛋白重组至由磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol）及微量荧光标记的NBD-PC（1-棕榈酰-2-{6-[7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰基}-sn-甘油-3-磷酰胆碱）。通过检测位于囊泡内层的NBD-PC分子转移到外层的程度来测定翻转酶活性，当这些分子暴露于膜外时，其荧光会被不能跨膜的还原剂淬灭。我们所描述的方法具有普遍适用性，可用于鉴定和表征其他膜蛋白的翻转酶活性。

引言

视紫红质（rhodopsin）是一种典型的G蛋白偶联受体（例如参见文献¹），也是首个被鉴定并经生物化学验证的磷脂翻转酶（phospholipid scramblase）^2,3。翻转酶是一类磷脂转运蛋白，能够以双向、非ATP依赖的方式将跨双分子层磷脂的本征缓慢移动速率提升至生理所需的水平^4-6。其功能实例可见于内质网和细菌细胞质膜，在这些膜结构中，组成型的磷脂翻转对于维持膜稳态、细胞生长以及多种糖基化通路至关重要⁵。受调控的磷脂翻转则在凋亡细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）的过程中发挥关键作用，PS作为“吃我”信号被巨噬细胞识别⁷，同时在活化的血小板表面形成促凝血界面，催化凝血所需蛋白因子的生成。在视细胞外节盘膜中，视紫红质的翻转活性被认为可抵消由ATP依赖性、单向脂质翻转酶ABCA4所引起的双分子层两叶间磷脂分布失衡^4,8,910-12。

尽管翻转酶具有重要的生理功能，但其身份一直未被明确，直到视紫红质被报道为光感受器盘膜中的翻转酶²，TMEM16蛋白家族成员被鉴定为依赖Ca²⁺的翻转酶，参与质膜上磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻（参见文献¹³的综述），以及细菌蛋白FtsW被提出作为脂质II翻转酶，参与肽聚糖合成^14<....

方案

1. 脂质体和蛋白脂质体的制备

1. 脂质体的制备
   1. 使用玻璃注射器，向圆底烧瓶中加入 1,435 µl POPC（25 mg/ml，溶于氯仿）和 160 µl POPG（25 mg/ml，溶于氯仿），以获得总脂质为 52.5 µmol、摩尔比为 POPC:POPG = 9:1 的脂质混合物。
   2. 使用旋转蒸发仪在145 rpm转速下旋转蒸发30分钟以干燥脂质（此溶剂量无需使用水浴），随后将烧瓶转移至真空干燥器中，在室温（RT）下至少干燥3小时，或过夜。
   3. 用10 ml 50 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl（下文简称缓冲液A）水合干燥的脂质膜，轻轻旋转烧瓶直至形成均匀的浑浊悬浮液；
      注意：此阶段的脂质浓度预计为 5.25 mM，因截至目前不应有任何损失。
   4. 在室温下，将悬浮液置于水浴中超声处理10分钟，频率为40 kHz。溶液将变得略为澄清。
   5. 使用挤出器将悬浮液通过孔径为400 nm的膜重复挤出10次，随后进行第二轮挤出，通过孔径为200 nm的膜重复挤出4次。
      注意：所得大单层囊泡（LUVs）的平均直径约为175 nm。如有必要，可根据制造商说明书通过动态光散射检测LUVs的粒径和均一性。
   6. 按照第1.2节所述方法测定LUV悬液中磷脂的浓度。
      注意：由于挤出过程中的损失，浓度通常约为 3.6 mM。

结果

我们描述了将视蛋白重构到大单层囊泡（LUVs）中，以利用基于荧光的检测方法表征其翻转酶活性。我们对结果进行分析，以确定视蛋白介导的磷脂翻转速率的下限，并确定视蛋白在囊泡中功能性重构时的寡聚状态。

为了确定最佳的重组条件，有必要通过实验确定用于膨胀大单层囊泡（LUVs）所需的去垢剂用量，以使囊泡能够接受蛋白质的插入。该实验如图2A所示。将POPC:POPG大单层囊泡分别用不同浓度的DDM处理3小时，随后在540 nm处测定样品的吸光度，该值反映浊度，因而可指示囊泡的尺寸变化。540 nm处测得的光密度（OD₅₄₀）曲线显示，当DDM浓度从4–6 mM逐渐增加时，囊泡发生膨胀，并在约7 mM时达到饱和；继续增加DDM浓度则导致囊泡开始溶解（表现为浊度降低及OD₅₄₀信号减弱）。去垢剂处理后加入NBD-PC，样品再继续孵育1小时，随后用聚苯乙烯珠去除去垢剂。通过向囊泡中加入连二亚硫.......

讨论

最初，我们利用翻转酶活性检测方法确定了视蛋白具有磷脂翻转酶活性²。该检测方法还使我们能够通过测试其特异性（我们使用了多种NBD标记的报告脂质，例如NBD-磷脂酰乙醇胺，其NBD标记位于酰基链上，如图1A中NBD-PC所示，或标记在头部基团上，如NBD-鞘磷脂或NBD-磷脂酰丝氨酸²）、囊泡脂质组成的影响（例如，作为囊泡组分的不同含量的胆固醇），以及视蛋白和视紫红质的不同构象状态是否均表现出翻转酶活性，从而对视蛋白的翻转酶活性进行表征。这些分析表明，视紫红质的翻转酶活性非常迅速（>每秒超过10,000个磷脂分子），对磷脂无特异性，且不依赖于视紫红质的构象状态或其是否含有发色团视黄醛^2,3。在此，我们提供了一种制备含视蛋白的蛋白脂质体的详细方法，并展示了如何检测这些样品的磷脂翻转酶活性。

所述的重建方案已针对给定的脂质组成以及使用DDM作为增溶去污剂通过亲和层析纯化后的视蛋白重建进行了优化。脂质组成以及去污剂可根据实验人员的需求进行更改，但针对改变条件后的理想重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰-rac-(1-甘油)（钠盐）	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-棕榈酰-2-{6-[7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰}-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D310 5 GM	DDM
荧光计比色皿	sigma	C0918-100EA	比色皿
荧光分光光度计	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
连二亚硫酸钠技术级，85%	Sigma	157953-5G	连二亚硫酸盐
GraphPad Prism 5 软件			Prism
Tris 碱	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml 挤出器	Northern Lipids, Inc.		挤出器
Whatman，排水盘，聚乙烯，25 mm	Sigma	28156-243	圆盘支架
Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜，0.4 µm，直径 25 mm	Sigma	WHA110607	400 nm 膜
Whatman Nucleopore 径迹蚀刻膜，0.2 µm，直径 25 mm	Sigma	WHA110606	200 nm 膜
磷酸钠	Sigma	S3264-500G
VWR 培养管，一次性，硼硅酸盐玻璃，13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	玻璃管
高氯酸	Sigma	30755-500ML
四水合钼酸铵	Sigma	A-7302	钼酸铵
(+)-L-抗坏血酸钠	Sigma	A7631-25G	抗坏血酸钠
Bio-Beads SM2 吸附剂	Bio Rad	1523920	聚苯乙烯微珠
2.0 ml 透明微量管	VWR Scientific	10011-742	复溶管
复溶玻璃管	VWR Scientific	53283-800	复溶玻璃管
Zetasizer	Malvern		DLS