荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

摘要

蛋白质相互作用是细胞功能的核心。通常使用量热法和光谱技术来表征这些相互作用。本文中，我们描述了荧光各向异性作为一种研究Shwachman-Diamond综合征相关突变蛋白（SBDS）与延伸因子样1 GTP酶（EFL1）之间相互作用的工具。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用在生物体功能中起着至关重要的作用。一旦发现并验证了某种相互作用，就有必要在结构和机制层面对其进行表征。目前已有多种生物化学和生物物理方法可用于实现这一目的。其中，荧光各向异性是一种强大的技术，特别适用于荧光标记蛋白在发生蛋白质-蛋白质相互作用时其荧光强度保持不变的情况。在该技术中，使用适当波长的垂直偏振光激发荧光标记的蛋白质，这种偏振光会根据荧光基团相对于入射光束的方向选择性地激发其中一部分荧光基团。所产生的发射光也具有方向性，其在垂直和水平平面上的强度关系定义为各向异性（r），计算公式如下：r = (I_VV - I_VH) / (I_VV + 2I_VH)，其中 I_VV 和 I_VH 分别代表垂直和水平方向上的荧光强度。荧光各向异性对荧光基团的旋转扩散敏感，即与蛋白质相连的荧光基团所表现出的表观分子大小，而该参数在蛋白质-蛋白质相互作用发生时会发生改变。本文以荧光各向异性技术为例，研究了Shwachman-Diamond综合征相关蛋白（SBDS）与类延伸因子1 GTP酶（EFL1）之间的结合。传统上，蛋白质的荧光标记通常发生在蛋白的巯基（半胱氨酸）或氨基（N端氨基或赖氨酸）上。然而，SBDS蛋白含有多个半胱氨酸和赖氨酸，无法实现定点特异性标记。作为替代方法，采用染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷烷-2-基)荧光素（4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein），对在重组SBDS蛋白C末端通过基因工程引入的四半胱氨酸基序（Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）进行特异性标记。对实验数据的拟合分析提供了关于这两种蛋白质之间结合模式的定量和机制信息。

引言

细胞含有多种生物大分子，这些分子之间不断发生相互作用。这种相互作用形成了参与细胞信号转导、基因表达调控、细胞迁移等多种功能相关通路的复合物。细胞内发生的所有蛋白质-蛋白质相互作用构成了一个被称为相互作用组（interactome）的网络。 Saccharomyces cerevisiae 其超过70%的蛋白质已被证实具有相互作用伙伴 ¹理解细胞相互作用组及其功能可为生物体的复杂性和多样性提供重要信息。已有多种方法被用于鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用。不同的高通量方法，如酵母双杂交系统 ²，蛋白质片段互补分析 ³，亲和纯化 ⁴ 与质谱联用及蛋白质微阵列用于鉴定相互作用 ^5,6一旦确定，必须对其进行验证，而验证方法可能因具体情况而异。通常，这些实验涉及在相互作用配对成员的个体层面上破坏该相互作用本身， 例如， 通过基因敲除或过表达其中一种蛋白质，随后在细胞水平上观察另一种组分性质或功能的变化。随后，采用生物物理技术 ⁷ 用于在分子水平上表征蛋白质-蛋白质相互作用。为此，通过X-ray crystallography、核磁共振和冷冻电子显微镜确定蛋白质复合物的结构，而通过量热法和荧光光谱法对这些相互作用进行定量和机制性描述。

在本研究中，采用荧光各向异性技术来表征GTP酶EFL1与SBDS蛋白之间的相互作用。这些蛋....

方案

1. SBDS-FlAsH 标签蛋白的表达与纯化

注意：在各向异性实验中，通过 PCR 将对应于 Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 序列的 FlAsH 标签添加至人源 SBDS 编码序列的 C 末端。将该构建体亚克隆至表达载体 pRSET-A 中，并转化入 Escherichia coli C41 细胞，以表达包含 N 末端六聚组氨酸标签（His 标签）、人源 SBDS 编码序列及 C 末端 FlAsH 标签的蛋白¹⁰。

1. SBDS-FlAsH 蛋白表达
   1. 使用标准热激法将质粒 pRSET-HisSBDS-FlAsH 转化至感受态 E. coli C41 细胞中¹⁹。将细胞接种于添加了 100 µg/ml 氨苄青霉素的固体 Luria-Bertani (LB) 培养基上。LB 固体培养基的成分为每升含 10 g NaCl、5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨和 20 g 琼脂。
   2. 在添加了 100 µg/ml 氨苄青霉素的 1 L 液体 LB 培养基中，于 37 °C 培养转化后的细菌，直至 600 nm 波长处的吸光度（A₆₀₀）达到 0.5–0.7。
   3. 加入 0.5 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）诱导....

结果

进行任何各向异性实验时，必须排除荧光团荧光强度发生大幅变化的可能性，因为所观测到的混合物各向异性由公式5表示：

其中，F_i 表示各组分的分数荧光，r_i 为其相应的各向异性。各组分的分数荧光取决于其浓度及其相对荧光强度，后者由公式 6 定义：

讨论

大多数涉及蛋白质的生化实验不仅需要高纯度的蛋白质，还需要大量的蛋白样品，无论使用何种技术均是如此。因此，此类实验所用的蛋白质通常通过异源表达获得，本文所述案例即采用此方法。荧光光谱分析要求被研究分子中存在荧光团。芳香族氨基酸残基是蛋白质的内源性荧光团，然而，使用其信号研究蛋白质-蛋白质相互作用会使分析复杂化，因为这些残基在大多数蛋白质中普遍存在，受体蛋白和配体中都会含有。此外，色氨酸的荧光寿命太短，不适合用于荧光各向异性实验。因此，通常会向其中一个被研究的蛋白质添加外源性荧光团。为此，通过基因工程在蛋白质中引入四半胱氨酸基序，并利用染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素与其形成配位键，从而将荧光团连接至SBDS的C末端。选择哪一个蛋白质携带荧光团并非随意决定。由于本研究中两种蛋白质的分子量差异较大（SBDS为29 kDa，EFL1为127 kDa），我们预期标记后的SBDS在游离状态与和EFL1形成复合物之间的各向异性变化，会比标记后的EFL1在游离状态与结合SBDS后的变化更为显著。基于此考虑，将FlAsH标签引入SBDS而非EFL1。在建立荧光各向异性实验时，另一个需要考虑的重要参数是溶液的吸光度。样品在比色.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 玻璃珠	Biospec Products	11079105
Tris 碱	Formedium	TRIS01	超纯
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
染料 4’,5’-双(1,3,2 二硫砷杂环丙烷-2-基)荧光素	ThermoFischer Scientific	LC6090	该试剂盒包含用于标记 FlAsH 标签的染料
氨苄青霉素	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
无水 D(+)-葡萄糖	Formedium	GLU03
D(+)-半乳糖	Formedium	GAL03
L-亮氨酸	Formedium	DOC0157
L-色氨酸	Formedium	DOC0189
盐酸苄脒	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	苯甲基磺酰氟
NaCl	Formedium	NAC02	氯化钠
甘油	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	氯化镁
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	磷酸氢二钾
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	磷酸二氢钠
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基	Formedium	CYN0410
酵母提取物	Formedium	YEM03	微粒状
L-酪氨酸	Formedium	DOC0193
硫酸腺嘌呤	Formedium	DOC0230
酪蛋白氨基酸	Formedium	CAS03
胰蛋白胨	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
过滤装置	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa
膜滤器	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	混合纤维素酯膜滤器，亲水性，0.22 µm，47 mm，白色，无网格
Ni2+ 亲和柱	QIAGEN	30760	预装 5 ml Ni-NTA Superflow 的柱芯
强磺丙基阳离子交换柱	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
尺寸排阻柱	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
荧光比色皿	Hellma Analytics	111-057-40
分光光度计	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
摇床	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 台式，温度范围 室温-15° 至 60°C
离心机	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC 系统，电导率 UV-MM II 监测器，P500 泵，组分收集器
荧光分光光度计	Olis	No applicable	配备偏振工具箱的 Olis DM 45