荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

细胞含有生物大分子是不断地与彼此交互的一许多。该协会产生了参与负责其在信号转导，基因表达和除其他细胞迁移的调节功能的细胞通路的复合物。发生在一个小区中的所有蛋白质 - 蛋白质相互作用包括称为相互作用组的网络。在酿酒酵母中的蛋白质的70％以上已被证明有相互作用伙伴^1。理解的细胞的相互作用组和它们的功能提供关于复杂性和生物多样性的相关信息。数种方法已经描述于鉴定和表征蛋白质 - 蛋白质相互作用。不同的高通过放的方法，如酵母双杂交^2，蛋白质片段互补测定法^{如图3所示} ，耦合到质谱和蛋白microarra亲和纯化⁴YS用于识别交互^5,6。一旦确定，就必须对其进行验证，这可能在逐案的基础而改变。通常，这些实验涉及破坏相互作用本身在该相互作用对， 例如的个别成员的水平，通过基因缺失或蛋白之一的表达，然后寻找在属性或改变的其它部件的功能细胞水平。随后，生物物理技术⁷用于在分子水平来表征蛋白质-蛋白质相互作用。为此，虽然量热法和荧光光谱被用于定量和机械地描述它们的蛋白质复合物的结构通过X射线晶体学，核磁共振和低温电子显微镜来确定。

在这项工作中，荧光各向异性用作技术来表征GTP酶EFL1和SBD之间的相互作用S蛋白。这些蛋白质通过来自60S核糖体亚基⁸的表面促进真核起始因子6的释放参与核糖体的合成。该SBDS蛋白在称为Shwachman-Diamond综合征⁹和充当EFL1减小为鸟苷二磷酸^10,11其亲和性的鸟嘌呤核苷酸交换因子的疾病的突变。在SBDS疾病的突变废除与EFL1的相互作用，从而防止其激活。

荧光各向异性在生物应用通常用于研究蛋白质 - 肽或蛋白质 - 核酸相互作用。它是基于荧光团与偏振光产生一个部分偏振的发射激发的原理。荧光各向异性由等式1定义:

在那里我_VV和_VH我是垂直_（VV）和水平_{（V H）}的荧光强度偏振的发射时，样品被激发与垂直偏振光^12。荧光各向异性是影响荧光团的旋转扩散速度的因素敏感，因而取决于温度，溶液的粘度和荧光团的表观分子大小。含有荧光团的增加，当它与另一蛋白和这种变化相互作用的蛋白质的表观大小然后可以作为各向异性的变化进行评估。更具体地说，在相对于它的荧光寿命溶液缓慢旋转的荧光团将有一个大I _VV值和小我_的VH的值，因此，将表现出相对大的各向异性。对于迅速相对于它们的荧光寿命滚入荧光团，我_VV和_VH我将类似和各向异性值将是¹²小图1）。此外，有一个良好的各向异性信号到噪声测量，有必要有一个与相似于感兴趣的分子的旋转相关时间荧光寿命的荧光团。否则，就不可能准确地记录游离蛋白在复之间以及在各向异性的差异。例如，荧光探针与接近4纳秒如荧光素或若丹明附着到100道尔顿的低分子量化合物一生各向异性为0.05。绑定到160 kDa的将其各向异性值提高到0.29的分子;可精确地测量的差。与此相反，参与结合反应，其增加的分子大小而变化，从65至1000 kDa的相同荧光探针只会造成0.28各向异性变化到0.3，这是太小而不能精确测量。在这种情况下，用400纳秒的使用寿命的探针会更适合^12。

荧光应用需要荧光团在任何所研究的分子的存在。研究蛋白质 - 蛋白质相互作用有三种类型的荧光团:1）中存在的蛋白质中的色氨酸残基，2）化学连接的荧光团和3）荧光融合伙伴，例如绿色荧光蛋白（GFP）及其deriva表3-6。大多数蛋白质具有在其结构色氨酸残基，从而来测量相互作用的最简单的方法是通过监视在相应的荧光光谱的变化或通过在色氨酸残基的荧光强度监视更改。然而，色氨酸残基可存在于两种蛋白质的分析复杂化。另一方面，对于荧光团以改变其荧光性质由于交互它需要被位于或结合位点附近，它可以与交互本身干涉。使用笨重的荧光，如GFP时，这种需要特别注意。如果没有这些荧光团可用于结合研究是必要的，那么，引入外源性荧光团所涉及的蛋白之一。许多化学合成的荧光团存在，并且可被共价连接到通过其反应性基团的蛋白质，如胺基（赖氨酸或N末端的侧链）和在半胱氨酸的硫醇基团。 F与异硫氰酸酯和琥珀酰亚胺酯luorophore衍生物与酰胺基团反应而碘乙酰胺和马来酰亚胺是硫醇反应性基团^13。在荧光应用中最常用的染料是荧光素的衍生物，和若丹明绿染料，香豆素，BODIPY荧光团和Alexa Fluor染料。市售的荧光团及其使用的详细列表可在参考文献^14,15找到。对于成功的标记，反应性基团必须在蛋白质的表面上暴露出来，但由于大量通常存在于多肽的反应性官能团的是很难得到的位点特异性修饰。在这项研究的目的蛋白质，SBDS，含有5游离半胱氨酸和33的赖氨酸，可能导致在多个位点标记。非均匀标签可能影响结合和不同的荧光分子可能结合后引起不同的荧光强度信号将复杂的数据分析。奥雅纳rcome这一问题，我们使用了闪光灯荧光团，4'，5'-双（1,3,2- dithioarsolan -2-基）荧光素到网站直接标记的SBDS蛋白。这是一arsenoxide染料与在一个基序知道作为由序列CCXXCC，其中X是除半胱氨酸^16,17之外的任何氨基酸的闪光标记为四个间隔半胱氨酸的高亲和性。这四半胱氨酸基序被添加到通过遗传工程N-或蛋白质的C末端与适当的接头，以防止蛋白质的总体折叠的破坏在一起。由闪光染料和Flash标签的一对最初设计为位点特异性标签的蛋白在活细胞中^17，但它也可以使用，因为它是这里例举标记纯化的蛋白在体外 。此外，酶的策略也已经被开发，以使蛋白¹⁸的位点特异性官能化。

在这个手稿中，我们描述的荧光各向异性的用处山工具来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。结合可以通过结合曲线形状的简单检查来评估而定量信息可以从实验数据的拟合而获得。

1. SBDS闪光标签蛋白表达纯化

注:对于各向异性的实验中，对应于半胱氨酸 - 半胱氨酸-Pro的基-Gly-半胱氨酸 - 半胱氨酸加入到人类SBDS通过PCR编码序列的C-末端序列的闪光标签。此构建物亚克隆到表达载体pRSET-A，并转化到大肠杆菌 C41细胞以表达编码N-末端六组氨酸标签（His标签）的蛋白质，人类SBDS编码序列和C-末端闪光标签^10。

1. SBDS-FLASH蛋白的表达
   1. 转化感受态大肠杆菌 C41细胞，使用标准的热休克协议¹⁹质粒PRSET-HisSBDS闪光。板中补充有100微克/毫升氨苄青霉素固体的Luria-BERTANI（LB）培养基中的细胞。的LB固体培养基组合物包括10个克NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨和1升20体积克琼脂的。
   2. 在37℃下培养转化的细菌，直到吸光度在600nm（A _600）达到在1升补充有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基的0.5-0.7。
   3. 通过加入0.5mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷至培养诱导蛋白质表达，并继续进行另外5小时孵育。
   4. 收集经离心细菌悬浮液3800×g离心在4℃下10分钟。去除上清。在这一点上，无论是存储的细胞沉淀在-20℃或立即用于蛋白质纯化。
2. SBDS-FLASH蛋白纯化
   注意:使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统或蠕动泵执行的所有层析步骤。镍^离子色谱-affinity用5ml的快速流动柱。阴离子交换层析用5ml的磺强阳离子交换柱。 3毫升/分钟的流速，使用分的所有的色谱步骤。
   1. 悬浮细胞在35毫升SBDS裂解的Buffer通过超声处理用10秒ON和30秒的循环4分钟关的总时间补充有1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和裂解（50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5，300mM NaCl的20 mM咪唑）中，在4 C。
   2. 离心样品以9000rpm×g离心在4℃下50分钟。
   3. 保持上清液弃沉淀以除去细胞碎片。
   4. 平衡用SBDS裂解缓冲液3倍柱体积（CV）的镍^离子亲和层析柱和引入澄清的上清液至色谱柱上的整体。
   5. 通过洗涤3的CV SBDS裂解缓冲液的除去未结合的蛋白质，并用3 CV SBDS洗脱缓冲液（50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5，300mM NaCl的，​​250mM咪唑）洗脱。
   6. 稀释洗脱的蛋白6倍，用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5，并通过一个0.22微米的纤维素膜除去通过过滤可能聚集体。
   7. 用3 CV低盐S列中的平衡的磺基阳离子交换柱缓冲液（50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5，50mM NaCl中），并引入来自前面步骤的蛋白质样品。
   8. 洗涤未结合的物质用3的CV低盐S柱缓冲液和洗脱蛋白在一个步骤中，用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5，1M NaCl洗涤。
   9. 稀释洗脱的蛋白3.3倍，用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5。离心3800 xg离心浓缩用超滤装置蛋白质15分钟。闪光灯冻结蛋白在液氮中，并储存在-80℃直至进一步使用。
   10. 验证的蛋白质通过SDS-PAGE分析和考马斯染色²⁰的纯度。

2. EFL1蛋白表达纯化

注:EFL1是在加1/10发散子²¹和酿酒酵母垫上 3'UTR在载体pRS426的调节下表达。重组蛋白编码融合到烟草蚀纹病毒蛋白酶人类EFL1同种型1（TEV）识别位点，并在C末端六组氨酸标签。

1. EFL1蛋白的表达
   1. 变换S.酵母 BCY123细胞使用标准乙酸锂协议²²质粒pRS426-EFL1TevHis。板的所有合成滴出媒体的转化的细胞，而不补充有2％（重量/体积）葡萄糖尿嘧啶（SD-URA）。对SD-URA培养基组合物包括8克酵母氮碱无氨基酸下，将11g酪蛋白氨基酸，55毫克硫酸腺嘌呤，55毫克酪氨酸，60毫克亮氨酸和60mg色氨酸为1升体积。
   2. 培养在30℃下转化的酵母，直至A ₆₀₀达到1.8在1升的SD-URA培养基补充有0.5％（重量/体积）的葡萄糖。
   3. 通过加入2.8％（重量/体积）的半乳糖的培养诱导蛋白质表达，并继续进行另外18小时的温育在30℃。
   4. 收集通过离心分离酵母悬浮液3800×g离心在4℃下10分钟。去除上清。在这一点上，无论是存储的细胞沉淀在-20℃或立即用于蛋白质纯化。
2. EFL1蛋白纯化
   注意:使用FPLC系统或蠕动泵被执行的所有层析步骤。镍^离子 -affinity色谱以3毫升/分钟的流速使用5ml的快速流动柱。尺寸排阻色谱法使用的125ml列预填充的Superdex 200树脂以1毫升/分钟的流速。
   1. 悬浮细胞在50ml补充有1mM的PMSF和1mM苯甲脒EFL1裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl pH值为8，300mM NaCl的20 mM咪唑，5mM的MgCl ₂的，10％甘油）中，并通过破坏细胞摩擦使用玻璃珠（直径= 0.5mm）的为2分钟开，15分钟关6分钟使用周期的总时间，在4℃的珠打浆机。
   2. 离心样品以9000rpm×g离心在4℃下50分钟。
   3. 保持上清液弃沉淀以除去细胞碎片。
   3 CV EFL1裂解液平衡的镍^离子亲和柱，并介绍所有的澄清上清上柱。
3. 通过洗涤3的CV EFL1裂解缓冲液的除去未结合的蛋白质，并用3 CV EFL1洗脱缓冲液（50mM的Tris-盐酸pH值为8，300mM NaCl的，250mM咪唑，5mM的MgCl ₂的，10％甘油）洗脱。
4. 用各向异性缓冲的1.5 CV（50毫摩尔Tris-盐酸pH值7.5，300mM NaCl的，5mM的MgCl ₂的，10％的甘油，5mM的β巯基乙醇）平衡尺寸排阻柱。
5. 浓缩到1ml 3800 xg离心从由离心超滤装置在Ni ²⁺亲和层析柱洗脱，所需体积的EFL1蛋白。引进的大小排阻柱样品。
6. 收集被洗脱的蛋白质并通过超滤浓缩至约30微米的最终浓度。闪冻在液氮中，并存储该蛋白质在-80℃直至进一步使用。验证次通过SDS-PAGE分析和考马斯染色²⁰蛋白质电子纯度。

3. SBDS-FLASH的标签与Flash荧光染料4'，5'-双（1,3,2 dithioarsolan -2-基）荧光素

1. 混合SBDS-FLASH蛋白3纳摩尔与4'的3纳摩尔，5'-双（1,3,2- dithioarsolan -2-基）在各向异性缓冲液5微升体积的荧光素染料。
2. 让反应继续进行，在4℃下8小时。透析针对各向异性缓冲器样品过夜，以除去游离的染料。
3. 使用朗伯 - 比尔定律量化标记蛋白的％。测量在280nm和在用适当体积的石英比色皿分光光度计508处的吸光度。注:考虑以下摩尔吸光系数（M ^-1厘米^-1）:
   
4. 计算使用公式2中标记SBDS-FLASH蛋白的浓度。
   
5. 通过从先前的步骤代替计算值:C _SBDS闪光计算使用公式3总SBDS蛋白的浓度。
   
6. 计算使用公式4标记的蛋白质的百分比。
   

4.荧光各向异性实验

注:各向异性实验在装备有使用在设备中的软件提供的各向异性程序执行了极化工具箱和数据收集分光光度计进行。激发波长为494纳米的为8纳米的光谱带宽，并使用530±25nm的带通滤波器的发射被记录下来。测量在25℃下在200微升比色杯中进行用一个5毫米的路径长度^10。

1. 在荧光比色皿，将200微升30纳米SBDS闪各向异性缓冲液和滴定2微升30微米EFL1的。调匀，让站在反应3分钟测量各向异性值之前。
2. 重复步骤4.1至40微升EFL1的总体积已被添加。

5.数据分析

1. 利用非线性最小二乘回归算法拟合数据到合适的装订模式。对于最常见的结合模型方程表示在表1中。
2. 评价，通过检查拟合²³的残差描述了蛋白质之间的相互作用的最佳模式。支持额外的实验选择的模型。

表1普通的蛋白质-蛋白质相互作用结合模型和描述它们的数学方程。0 / 54640table1large.jpg"目标="_空白">请点击这里查看此表的放大版本。

执行任何各向异性实验它，因为物质的混合物所观察到的各向异性由等式5表示的，以排除在荧光团的荧光强度大的变化是很重要的:

其中F i表示各成分及r的分数荧光i是对应的各向异性。各组分的分数荧光取决于两者，它的浓度和它的相对荧光，这是由公式6定义:

其中X i表示第的摩尔分数E I TH实物和Ø 我是第 i 个物种的量子产率。

因此，如果荧光强度沿滴定极大地改变，最好是，任一测量复合物形成中，而不是各向异性信号的荧光信号的变化的函数，或者通过拟合两者的荧光强度和各向异性纠正观察到的各向异性值数据。 SBDS-FLASH的荧光确实结合后EFL1不显着的变化（ 图2），表明荧光各向异性是足够用于测定两种蛋白质之间的结合。

SBDS-FLASH的时增加EFL1浓度的滴定图2.荧光发射。变化的荧光团的荧光发射是negligible和沿滴定随机的。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光各向异性结合从EFL1的滴定至SBDS闪光所得曲线的一个例子示于图3。定性地，曲线图的形状清楚地显示了两种蛋白质相互作用通过在加入的增加在各向异性信号所证明EFL1。此外，各向异性值达到稳定表明在滴定结束时，所有的争端解决附属机构闪存蛋白存在于与EFL1复杂。这是可能的话，定量地描述这些蛋白质之间的相互作用，并使用非线性最小二乘回归到一个推定的结合模型拟合数据，将获得相应的解离平衡常数。装修到一个结合位点模型没有appropriately描述实验数据（ 图3A）。这不仅从结合曲线拟合跟踪而且来自我们明显和非随机的拟合（理论和实验数据之间的差）的残差的偏差是显而易见的。这与单结合位点模型由双曲线，而不是作为对在图3中呈现的实验数据中观察到一个S形曲线数学上描述的事实吻合。在另一方面，模型作为两个相同或两个不同的结合，例如网站更好地描述实验数据的配合展会的残差没有系统性偏差支持双站点关联模型（ 图3B-C）。在不存在任何其他的实验信息的难以建立其中两个模型的对应EFL1和SBDS之间的结合机制。尽管如此，SBDS和EFL1都是单体蛋白质，因此它是difficULT设想一两个相同的结合位点的模式。

图3.荧光各向异性结合EFL1和SBDS闪光之间的相互作用的等温线在每个上重复的连续行对应于拟合数据以不同的结合模型:（A）的单中心，（B）的两个相同的位点和（C）两个非一致的位点。下图表示适合相应的模型的残差。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可披露的，他们也没有竞争的经济利益。