本文介绍了一种基于显微镜的技术，用于观察和量化吞噬细胞对病原体（如白色念珠菌 Candida albicans）以及大于0.5 µm的颗粒物（包括酵母聚糖和IgG包被的微珠）吞噬过程中早期的级联事件。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物体内具备多种防御机制，可抵御病原体的入侵。免疫系统中的专职吞噬细胞——如中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞——具有通过吞噬作用识别并清除入侵病原体的先天能力1。吞噬作用涉及细胞表面膜结构的有序重组以及肌动蛋白的重塑过程2,3。只有当吞噬作用的各个阶段均顺利完成时，吞噬细胞才能成功地将外来物质内化并彻底清除。这些阶段包括：细胞表面的模式识别受体（PRRs）对病原体的识别与结合；通过富含肌动蛋白的膜突起（伪足）形成吞噬杯以包裹颗粒物质；吞噬体的断裂，随后经历吞噬溶酶体成熟过程，最终导致病原体被杀灭3,4。
对吞噬作用各个阶段进行成像和定量分析，对于阐明该细胞过程的分子机制具有重要意义。本文报告了研究吞噬作用不同阶段的方法。我们描述了一种基于显微镜的技术，用于观察和量化吞噬细胞对颗粒物的结合、吞噬杯形成以及内化过程。由于吞噬作用发生在吞噬细胞上的天然免疫受体接触到大于0.5 µm的目标颗粒表面配体时，因此本文所介绍的实验方法包括使用致病性真菌Candida albicans以及其他颗粒物，如酵母聚糖和IgG包被的微珠。
引言
尽管人体持续暴露于细菌、病毒和真菌等病原体中，但我们的身体具备完善的免疫机制，能够提供抵御感染的保护作用。先天免疫系统是抵抗入侵病原体的第一道防线，主要依赖于吞噬细胞来识别并内化外来目标。
吞噬作用是一种在进化上保守的细胞过程，包括吞噬大于0.5 µm的不需要的颗粒物质。吞噬细胞在细胞表面表达多种免疫受体（也称为模式识别受体，PRRs），使其能够在吞噬前识别病原体上的病原体相关分子模式（PAMPs）3。病原体结合后，受体在细胞表面发生聚集，并触发吞噬杯的形成。这一过程导致由肌动蛋白驱动的膜重塑，膜结构向外突出并包围目标颗粒，最终将其完全包裹并掐断，形成独立的吞噬体空泡2,5。随后，吞噬体通过与晚期内体和溶酶体相继融合而成熟并酸化，形成吞噬溶酶体6。
尽管吞噬作用被描述为一种由受体介导且依赖肌动蛋白驱动的过程，但该过程也依赖于质膜中脂质成分（如磷脂酰肌醇和鞘脂）在时空上的动态修饰7,8。肌动蛋白的聚合由吞噬杯底部局部积累的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）所调控....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. DC2.4 和 RAW 264.7 细胞系的制备
注意：巨噬细胞样细胞系 RAW 264.7 和树突状细胞系 DC2.4 均来源于小鼠，以下条件用于培养这些细胞。
- 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加10%灭活胎牛血清（FBS）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）培养RAW 264.7细胞。
- DC2.4细胞的培养条件与RAW 264.7细胞相似，但使用添加L-谷氨酰胺的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基代替DMEM。
2. 荧光标记颗粒的制备：C. albicans、酵母聚糖、IgG包被的微珠
- 培养 白色念珠菌
- 接种 白色念珠菌 从冻存的甘油菌种中接种菌株 SC5314 至 25 ml YPD 培养基中，培养基中添加尿苷（2% Bacto-蛋白胨、1% 酵母提取物、2% 葡萄糖和 80 µg/ml 尿苷），30 °C 振荡培养过夜。
注意：避免培养 假丝酵母 培养物的光密度超过一个OD600 12分之 - 取1 ml的 C. albicans
- 接种 白色念珠菌 从冻存的甘油菌种中接种菌株 SC5314 至 25 ml YPD 培养基中，培养基中添加尿苷（2% Bacto-蛋白胨、1% 酵母提取物、2% 葡萄糖和 80 µg/ml 尿苷），30 °C 振荡培养过夜。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
基于显微镜的方法用于监测吞噬作用的不同阶段。本研究展示了DC2.4细胞吞噬多种荧光颗粒过程中各个事件的发生情况。利用本文所述技术，我们探究了鞘脂类分子在吞噬作用早期阶段的作用。为此，采用了在Sptlc2基因上存在遗传缺陷的DC2.4树突状细胞，该基因编码鞘脂生物合成途径中催化第一步且为限速步骤的酶。与野生型细胞相比，Sptlc2-/- DC2.4 细胞中鞘脂类（包括神经酰胺、鞘磷脂和葡萄糖基神经酰胺）的水平显著降低8Sptlc2-/- DC2.4 细胞在结合以及摄取方面存在缺陷 C. albicans，酵母聚糖和IgG乳胶珠8。在 图1，显示了荧光标记的酵母聚糖颗粒在DC2.4细胞中的结合情况（详见第3.1节）。Sptlc2-/- DC2.4细胞对酵母聚糖的结合显著少于对照组DC2.4细胞（p = 0.0008； 图1A）。与 Sptlc2 细胞相比，对照组细胞结合的酵母聚糖颗粒数量显著更高<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
巨噬细胞和树突状细胞等专业吞噬细胞通过吞噬并清除入侵的病原体，使吞噬作用成为宿主防御系统的重要组成部分。在此过程中，吞噬细胞的细胞表面会发生广泛的膜重组和细胞骨架重排8,19,20。为了更好地理解这一动态过程，对吞噬作用不同阶段进行可视化观察至关重要。本文介绍了一种基于显微镜的方法，用于监测吞噬作用的各个步骤。
活体成像技术的主要意义在于其能够在分子水平上显著地监测宿主与病原体之间的相互作用界面。通过可视化微生物感染的关键步骤，活体成像为深入理解针对病原体的免疫反应的基本特性提供了重要见解8,10,21,22除了吞噬作用外，本文所述技术还可拓展.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢麻省理工学院怀特黑德研究所Keck设施的Wendy Salmon和Nicki Watson提供成像支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-巯基乙醇 | AppliChem | A1108 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 细胞信号技术公司 | 9998 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐） | 赛默飞世尔科技 | D3571 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 赛默飞世尔科技 | BP-231-1 | |
| DMEM（Dulbecco）’s 最小必需培养基’s 培养基） | Gibco | 11965 | |
| PBS，1×（磷酸盐缓冲盐水） | Corning Cellgro | 21-031-CV | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC偶联的IgG包被乳胶微球 | Cayman | 500290 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液) | 赛默飞世尔科技 | 25030081 | |
| 4% PBS 甲醛溶液 | Affymetrix | 19943 1 升 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | 赛默飞世尔科技 | 15-140-122 | |
| 鬼笔环肽-阿利沙利488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 细胞 | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所） | Gibco | 61870 | |
| 皂苷 | Sigma Aldrich | S7900 | |
| 台盼蓝溶液（0.4% (w/v) PBS 溶液） | Corning cellgro | MT25900CI | |
| 胰蛋白酶-EDTA（1×）（0.05%） | 赛默飞世尔科技 | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps 去垢剂溶液 | 赛默飞世尔科技 | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技 | Z23374 | |
| 腔室型1.0硼硅酸盐盖玻片系统（8个腔室） | 赛默飞世尔科技 | 155361 | |
| 带网格的Glasstic载玻片10 | Hycor | 87144 |
参考文献
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
