本文介绍了一种基于显微镜的技术，用于观察和量化吞噬细胞对病原体（如白色念珠菌 Candida albicans）以及大于0.5 µm的颗粒物（包括酵母聚糖和IgG包被的微珠）吞噬过程中早期的级联事件。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物体内具备多种防御机制，可抵御病原体的入侵。免疫系统中的专职吞噬细胞——如中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞——具有通过吞噬作用识别并清除入侵病原体的先天能力1。吞噬作用涉及细胞表面膜结构的有序重组以及肌动蛋白的重塑过程2,3。只有当吞噬作用的各个阶段均顺利完成时，吞噬细胞才能成功地将外来物质内化并彻底清除。这些阶段包括：细胞表面的模式识别受体（PRRs）对病原体的识别与结合；通过富含肌动蛋白的膜突起（伪足）形成吞噬杯以包裹颗粒物质；吞噬体的断裂，随后经历吞噬溶酶体成熟过程，最终导致病原体被杀灭3,4。
对吞噬作用各个阶段进行成像和定量分析，对于阐明该细胞过程的分子机制具有重要意义。本文报告了研究吞噬作用不同阶段的方法。我们描述了一种基于显微镜的技术，用于观察和量化吞噬细胞对颗粒物的结合、吞噬杯形成以及内化过程。由于吞噬作用发生在吞噬细胞上的天然免疫受体接触到大于0.5 µm的目标颗粒表面配体时，因此本文所介绍的实验方法包括使用致病性真菌Candida albicans以及其他颗粒物，如酵母聚糖和IgG包被的微珠。
引言
尽管人体持续暴露于细菌、病毒和真菌等病原体中，但我们的身体具备完善的免疫机制，能够提供抵御感染的保护作用。先天免疫系统是抵抗入侵病原体的第一道防线，主要依赖于吞噬细胞来识别并内化外来目标。
吞噬作用是一种在进化上保守的细胞过程，包括吞噬大于0.5 µm的不需要的颗粒物质。吞噬细胞在细胞表面表达多种免疫受体（也称为模式识别受体，PRRs），使其能够在吞噬前识别病原体上的病原体相关分子模式（PAMPs）3。病原体结合后，受体在细胞表面发生聚集，并触发吞噬杯的形成。这一过程导致由肌动蛋白驱动的膜重塑，膜结构向外突出并包围目标颗粒，最终将其完全包裹并掐断，形成独立的吞噬体空泡2,5。随后，吞噬体通过与晚期内体和溶酶体相继融合而成熟并酸化，形成吞噬溶酶体6。
尽管吞噬作用被描述为一种由受体介导且依赖肌动蛋白驱动的过程，但该过程也依赖于质膜中脂质成分（如磷脂酰肌醇和鞘脂）在时空上的动态修饰7,8。肌动蛋白的聚合由吞噬杯底部局部积累的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）所调控，而肌动蛋白的解聚则依赖于PI(4,5)P2向磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI(3,4,5)P3）的转化3,9。这两种脂质修饰均至关重要：前者促进伪足成功包裹靶标，后者促使颗粒沉入吞噬细胞的细胞质中10。
具有吞噬能力的细胞包括专职吞噬细胞（如巨噬细胞/单核细胞、粒细胞/中性粒细胞和树突状细胞）以及非专职吞噬细胞（如成纤维细胞和上皮细胞）11。所有吞噬细胞所执行的吞噬作用在组织维持和重塑过程中发挥核心作用，而专职吞噬细胞的吞噬作用则负责协调针对病原体的先天性和适应性免疫应答。专职吞噬细胞不仅能吞噬并杀灭病原体，还能将抗原呈递给适应性免疫系统的淋巴样细胞。这有助于促炎性细胞因子的释放以及淋巴样细胞的活化，从而有效阻断感染12。
传统的生化技术在揭示吞噬作用过程中不同细胞事件的分子机制方面发挥了重要作用，例如蛋白质的翻译后修饰以及蛋白质之间各种高亲和力的相互作用。然而，使用传统生化方法难以获取有关吞噬事件时空动态的信息。活细胞成像不仅使我们能够以时间敏感的方式监测细胞事件，还能在单细胞水平上获取相关信息。本文中，我们描述了一种利用共聚焦显微镜研究吞噬作用不同阶段，并对整个过程进行时空分析的方法。
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方案
1. DC2.4 和 RAW 264.7 细胞系的制备
注意：巨噬细胞样细胞系 RAW 264.7 和树突状细胞系 DC2.4 均来源于小鼠，以下条件用于培养这些细胞。
- 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加10%灭活胎牛血清（FBS）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）培养RAW 264.7细胞。
- DC2.4细胞的培养条件与RAW 264.7细胞相似，但使用添加L-谷氨酰胺的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基代替DMEM。
2. 荧光标记颗粒的制备：C. albicans、酵母聚糖、IgG包被的微珠
- 培养 白色念珠菌
- 接种 白色念珠菌 从冻存的甘油菌种中接种菌株 SC5314 至 25 ml YPD 培养基中，培养基中添加尿苷（2% Bacto-蛋白胨、1% 酵母提取物、2% 葡萄糖和 80 µg/ml 尿苷），30 °C 振荡培养过夜。
注意：避免培养 假丝酵母 培养物的光密度超过一个OD600 12分之 - 取1 ml的 C. albicans 在室温下以2,000 × g离心5分钟。
- 吸弃上清液，并用1 ml PBS重悬沉淀。
- 在室温下以2,000 × g离心5分钟，收集沉淀。
- 重复步骤 2.1.4。
- 计算感染复数（MOI） 白色念珠菌 与吞噬细胞数量相关，并按照第3节所述进行吞噬作用检测。一个OD600 1 相当于 2.5 × 107 白色念珠菌 每毫升。
注意：Candida-BFP 的生成方法见参考文献13.
- 接种 白色念珠菌 从冻存的甘油菌种中接种菌株 SC5314 至 25 ml YPD 培养基中，培养基中添加尿苷（2% Bacto-蛋白胨、1% 酵母提取物、2% 葡萄糖和 80 µg/ml 尿苷），30 °C 振荡培养过夜。
- 酵母聚糖及IgG包被微珠的制备
注意：Zymosan 是一种含有 β-葡聚糖的真菌性碳水化合物颗粒制剂，来源于 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Zymosan 已知可诱导巨噬细胞和树突状细胞产生炎症信号，且已被广泛应用于吞噬作用研究。 13,14,15.- 短暂涡旋含有颗粒的离心管，并将足量样品分装至1.5 ml离心管中用于实验。
注意：通常我们使用1:10的比例（每1个细胞，加入10个酵母聚糖颗粒或IgG包被的微珠）。 - 加入1 ml预冷的PBS，于10,000 x g离心1分钟以收集颗粒。
- 吸弃上清液，将沉淀重悬于1 ml预冷的PBS中。
- 重复步骤 2.2.2–2.2.3
注意：继续进行步骤 2.2.5，或将试管在 4 °C 保存至使用。 - 将颗粒在超声波清洗器（120 V，50-60 kHz）中超声处理10秒，以避免颗粒聚集。
- 短暂涡旋含有颗粒的离心管，并将足量样品分装至1.5 ml离心管中用于实验。
3. 吞噬作用
注意：吞噬作用是一个复杂的过程，始于颗粒通过模式识别受体（PRRs）与颗粒表面配体的相互作用，结合到吞噬细胞的细胞表面。结合之后，在接触部位会组装肌动蛋白及其相关蛋白，形成吞噬杯。随后在吞噬体处发生肌动蛋白的解聚，最终导致颗粒被完全吞噬。下文将描述吞噬作用的不同阶段。
- 结合实验
注意：本实验的目的是监测吞噬作用的第一步，即靶颗粒上的配体与吞噬细胞上的受体之间的相互作用。- 接种约 5 x 104 将细胞接种于腔室载玻片中，使实验时细胞融合度达到60–70%。 alternatively，可将细胞接种于盖玻片（24孔或12孔板格式）或玻璃底96孔板中。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜2.
注意：细胞计数可使用血细胞计数板或类似技术进行。 - 将培养板（或培养皿）置于10 °C环境中10分钟。
- 使用移液器或抽吸装置轻柔地从每个孔中移除培养基。
注意：此步骤需谨慎操作，因为腔室盖玻片系统的每个孔均较小；移液器枪头或移液器产生的强气流容易扰动细胞。 - 将荧光标记的颗粒与细胞培养基（按上述方法配制）混合。加入 假丝酵母- 向细胞中加入BFP（MOI为10）、荧光标记的酵母聚糖或乳胶珠-兔IgG-FITC（每细胞10个颗粒）。每个腔室孔使用200 µl的终体积培养基，以确保所有细胞均被覆盖。
- 在10 °C条件下，以277 x g离心3分钟。
注意：此离心步骤有助于增加颗粒物与细胞之间的接触，并同步化结合过程。 - 立即将腔室载玻片转移至含5% CO₂的37 °C恒温湿润培养箱中2 5 分钟。
- 从培养箱中取出培养板，吸除培养基。
- 用预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。
注意：使用光学显微镜检查是否存在未结合的颗粒，必要时用PBS进一步洗涤更多次。必须从孔中彻底去除未结合的颗粒，以尽量减少分析过程中的背景噪声。 - 加入500 µl用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育30 min，对细胞进行固定。
警告：此步骤需使用4% PFA，具有高毒性、腐蚀性，且可能致癌。使用该液体时应采取适当防护措施。同时，需避免样品暴露于光照下。 - 向腔室中加入 500 µl PBS 洗涤细胞，然后轻轻吸去溶液。
- 重复步骤 3.1.9 两次。
注意：在此步骤中，每次移除上一管 PBS 后，应立即重新补充每支小瓶。 - 通过加入500 µl 50 mM NH₄Cl孵育终止固定4在 PBS 中孵育 10 分钟。
- 用 PBS 洗涤细胞两次，操作同 3.1.10 步骤所述。
- 加入250 µl结合缓冲液（含0.1%皂苷、0.2% BSA的PBS）于室温孵育30 min，以透化细胞。
- 加入用结合缓冲液按1:500稀释的荧光标记鬼笔环肽染色F-actin。室温孵育细胞1小时。
- 按照步骤 3.1.10 所述，用 PBS 洗涤细胞三次。
- 使用共聚焦显微镜（63倍物镜，402 nm 和 488 nm 激光）采集图像，并使用 ImageJ 分析图像16.
注意：成功的颗粒结合表现为颗粒与吞噬细胞接触处出现吞噬杯图1）。参见步骤 3.2.5。
- 接种约 5 x 104 将细胞接种于腔室载玻片中，使实验时细胞融合度达到60–70%。 alternatively，可将细胞接种于盖玻片（24孔或12孔板格式）或玻璃底96孔板中。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜2.
- 吞噬作用摄取实验
注意：本实验旨在利用共聚焦显微镜监测荧光标记颗粒被吞噬细胞完全内化的过程图2).- 接种约 5 × 104 将细胞接种于腔室载玻片中，使细胞在实验时融合度达到60–70%。 alternatively，可将细胞接种于盖玻片上（置于24孔或12孔板中）或玻璃底96孔板中。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜。2.
注：可使用血细胞计数板或类似技术对细胞进行计数。 - 将培养腔室载玻片（或培养板）置于 10 °C 环境中 10 分钟。
注意：冷却的目的是阻断内吞作用以及非特异性吞噬作用，从而实现同步化的吞噬作用。 - 执行步骤 3.1.3 至 3.1.5
- 将培养板转移至含5% CO₂的37 °C恒温湿润培养箱中2，并在不同时间点孵育。于感染后30、60和90分钟固定细胞。观察 C. albicans 感染后60分钟开始形成菌丝；感染90分钟后，吞噬细胞开始出现细胞死亡（焦亡）8.
注意：此为建议性操作，具体优化需根据细胞类型和所用颗粒物进行调整。 - 执行步骤 3.1.7 至 3.1.15，使用 ImageJ 分析图像16.
注意：成功的摄取表现为颗粒物完全内化至吞噬细胞的细胞质内图2用细胞表面标志物（如鬼笔环肽）对吞噬细胞进行染色有助于清晰界定细胞轮廓。此外，必须进行z轴层扫成像，以确定颗粒物是结合于细胞表面还是已被完全内化。
- 接种约 5 × 104 将细胞接种于腔室载玻片中，使细胞在实验时融合度达到60–70%。 alternatively，可将细胞接种于盖玻片上（置于24孔或12孔板中）或玻璃底96孔板中。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜。2.
- 吞噬作用的活体成像
注意：本实验方案中，我们描述了使用荧光标记的酵母聚糖（zymosan）结合共聚焦显微镜观察吞噬作用不同阶段的方法。我们采用稳定表达mCherry标记的F-actin的树突状细胞系DC2.48一种可显示活细胞中丝状肌动蛋白分布的生物传感器。由于吞噬作用是一个由肌动蛋白驱动的过程，对该细胞进行活体成像不仅能够捕捉F-肌动蛋白网络的运动与动态变化，还可可视化活细胞内不同的吞噬事件图3，视频1）。- 接种约 5 × 104 将细胞以适当的浓度接种于腔室载玻片中，使其在实验时融合度达到60-70%。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜。2.
注意：可使用血细胞计数板或类似技术对细胞进行计数。 - 将培养板置于冰上10分钟。
注意：冷却的目的是阻断非特异性摄取，并实现吞噬作用的同步化。 - 执行步骤 3.1.3 至 3.1.5
- 将显微镜载物台预热至 37 °C，并用 5% CO₂ 平衡腔室2等待30-45分钟，使温度和CO₂达到稳定。2 在开始成像前需先稳定。
注意：由于 CO2 温度水平对吞噬作用至关重要，因此在实验前开启显微镜加热器以平衡环境培养室的温度非常重要。 - 将含有细胞的腔室载玻片置于已平衡至37 °C和5% CO₂的显微镜培养箱中2.
- 进行活体成像17,18.
注意：激光功率的设置（增益、针孔） 等等。) 可能因所使用的显微镜类型和荧光探针的不同而有所变化。因此，我们建议查阅显微镜的操作手册，以确定适用于您活体成像的最佳条件 17,18.- 使用共聚焦激光扫描显微镜（及配套软件）进行活体成像。采用63倍、1.4数值孔径的油镜物镜，针孔大小为1-1.1艾里单位。
- 开始成像时，先使用明场找到腔室载玻片上的一个代表性区域。然后，在软件中点击“Position”选项选定视野。在Track 1中检测GFP时，使用488 nm激光的滤光片组，分光镜设置为582 nm，用于检测488 nm至582 nm波长范围内的信号。
- 在第二通道中，选择适用于 mCherry（RFP）的滤光片组，使用 578 nm 的分光镜，并检测 578 至 600 nm 波长范围内的信号。采用 488 nm 和 578 nm 激光器，激光功率设为 50%，增益输出设为 600–700。每 30 秒采集一次图像，持续 90 分钟。
- 接种约 5 × 104 将细胞以适当的浓度接种于腔室载玻片中，使其在实验时融合度达到60-70%。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育过夜。2.
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结果
基于显微镜的吞噬作用不同阶段监测方法。展示了DC2.4细胞对多种荧光颗粒吞噬过程中各个阶段的事件。利用本文所述技术，我们研究了鞘脂类在吞噬作用早期阶段的作用。为此，采用了在Sptlc2基因上存在遗传缺陷的DC2.4树突状细胞，Sptlc2是催化鞘脂生物合成途径中第一步且为限速步骤的酶。与野生型细胞相比，Sptlc2-/- DC2.4 细胞中鞘脂类（包括神经酰胺、鞘磷脂和葡萄糖基神经酰胺）的水平显著降低8Sptlc2-/- DC2.4 细胞在结合以及摄取方面存在缺陷 C. albicans，酵母聚糖和IgG乳胶珠8在 图1，显示了荧光标记的酵母聚糖颗粒在DC2.4细胞中的结合情况（详见第3.1节）。Sptlc2-/- DC2.4细胞对酵母聚糖的结合显著低于对照DC2.4细胞（p = 0.0008； 图1A)。对照组细胞结合的酵母聚糖颗粒数量显著高于 Sptlc2 细胞。-/-
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讨论
巨噬细胞和树突状细胞等专业吞噬细胞通过吞噬并清除入侵的病原体，使吞噬作用成为宿主防御系统的重要组成部分。在此过程中，吞噬细胞的细胞表面会发生广泛的膜重组和细胞骨架重排8,19,20。为了更好地理解这一动态过程，对吞噬作用不同阶段进行可视化观察至关重要。本文介绍了一种基于显微镜的方法，用于监测吞噬作用的各个步骤。
活体成像技术的主要意义在于其能够在分子水平上显著地监测宿主与病原体之间的相互作用界面。通过可视化微生物感染的关键步骤，活体成像为深入理解针对病原体的免疫反应的基本特性提供了重要见解8,10,21,22除了吞噬作用外，本文所述技术还可拓展...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢麻省理工学院怀特黑德研究所Keck设施的Wendy Salmon和Nicki Watson提供成像支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-巯基乙醇 | AppliChem | A1108 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 细胞信号技术公司 | 9998 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐） | 赛默飞世尔科技 | D3571 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 赛默飞世尔科技 | BP-231-1 | |
| DMEM（Dulbecco）’s 最小必需培养基’s 培养基） | Gibco | 11965 | |
| PBS，1×（磷酸盐缓冲盐水） | Corning Cellgro | 21-031-CV | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC偶联的IgG包被乳胶微球 | Cayman | 500290 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液) | 赛默飞世尔科技 | 25030081 | |
| 4% PBS 甲醛溶液 | Affymetrix | 19943 1 升 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | 赛默飞世尔科技 | 15-140-122 | |
| 鬼笔环肽-阿利沙利488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 细胞 | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所） | Gibco | 61870 | |
| 皂苷 | Sigma Aldrich | S7900 | |
| 台盼蓝溶液（0.4% (w/v) PBS 溶液） | Corning cellgro | MT25900CI | |
| 胰蛋白酶-EDTA（1×）（0.05%） | 赛默飞世尔科技 | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps 去垢剂溶液 | 赛默飞世尔科技 | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技 | Z23374 | |
| 腔室型1.0硼硅酸盐盖玻片系统（8个腔室） | 赛默飞世尔科技 | 155361 | |
| 带网格的Glasstic载玻片10 | Hycor | 87144 |
参考文献
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