使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

摘要

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。

摘要

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）的近期发展证明，成熟的体细胞能够回归到未分化、多能的状态。目前，重编程已可利用多种类型的成年体细胞进行：角质形成细胞、尿液细胞、成纤维细胞， 等等。 早期实验通常使用皮肤成纤维细胞。然而，获取患者成纤维细胞需要进行有创的外科手术。因此，由于获取原代细胞较为方便，悬浮细胞（如血液和尿液细胞）被认为是重编程的理想材料。本文报道了一种从外周血单个核细胞（PBMCs）高效生成诱导多能干细胞（iPSC）的方案。通过离心法将转导后的PBMCs连续接种至新的基质包被培养板，该方案可简便地获得iPSC克隆。该方法同样适用于脐带血单个核细胞（CBMCs）。本研究提供了一种简单且高效的PBMCs和CBMCs重编程方案。 关键词：诱导多能干细胞，外周血单个核细胞，脐带血单个核细胞，重编程，细胞培养，离心接种

引言

几十年来，干细胞一直是临床治疗中最受关注的材料之一¹。干细胞的显著特性在于其多能性以及自我更新的能力。1981年，研究人员首次从小鼠胚胎中分离出胚胎干细胞（ESCs）²。然而，当该技术被应用于人类胚胎时，遇到了若干伦理问题。

2006年，山中伸弥博士及其团队首次将小鼠体细胞重编程为多能细胞，使干细胞领域重新焕发生机并再度引起广泛关注³通过递送若干特定因子，多能干细胞被成功 "诱导的" 来自成体体细胞，因此被命名为 "诱导性多能干细胞（iPSCs）" 2007年，该技术被应用于人类细胞⁴，获得具有胚胎干细胞（ESCs）完全特性的细胞，且避免了伦理争议。理论上，诱导多能干细胞（iPSCs）可由来自任何个体或患者的任何类型细胞生成。患者特异性的iPSCs正逐渐成为一种潜在工具，可用于模拟每位患者的疾病表型和表观遗传状态。通过基因编辑或其他可逆转致病状态的方法，患者特异性的iPSCs还可应用于个性化医疗⁵此外，由于iPSCs与供体具有相同的免疫特性，因此较少引发免疫排斥反应，使得自体移植更具可行性⁶因此，诱导多能干细胞（iPSCs）已成为疾病建模、药物筛选和再生治疗领域最具前景的平台。鉴于这些优势，研究人员正不断开发更为优化的方案，力求以最少的起始细胞数量、在最短时间内获得纯度更高、产量更多的iPSCs。在面向未来应用、寻找最高效重编程方案的过程中，一个关键考量因素是起始细胞的类型。早期的大多数iPSC诱导方案均针对贴壁细胞进行优化，因为最初的iPSC系是由皮肤成纤维细胞诱导而来的。⁴然而，这些细胞的分离与制备过程费时费力。此外，皮肤成纤维细胞的分离需要侵入性外科操作，这可能成为其广泛应用的主要局限。

因此，为了进一步利用诱导多能干细胞（iPSCs），需要一种易于获取的细胞来源。血液被认为是一种理想的细胞来源，因其采集过程具有较低的侵入性^7-9。在本研究中，我们对从外周血单个核细胞（PBMCs）生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案进行了简单改进。在使用携带山中因子的仙台病毒进行转导后，无需对特定细胞类型（如CD34+细胞）进行繁琐的扩增，而是将全血细胞或PBMCs通过离心依次接种到基质包被的培养板上。该方法缩短了转导后悬浮细胞贴壁所需的时间，并减少了那些无法自主贴壁的重编程细胞的丢失。

方案

伦理声明：本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC12TISI0861）。

1. 从血液中分离单核细胞

1. 单核细胞的分离（第 -5 天）
   1. 使用细胞分离管（CPT）采集至少 10 ml 的新鲜血液。
   2. 将血液转移至新的 50 ml 锥形管中，并以 1:4 的比例加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。
      ​注意：为获得更高的纯度，可使用更高的稀释比例。
   3. 在新的 50 ml 锥形管中加入 10 ml 密度梯度介质，小心地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质上方。在室温（RT）下以 750 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。
   4. 小心地将中间白膜层转移至新的 50 ml 锥形管中，加入 30 ml PBS，洗涤细胞。
   5. 在室温下以 515 × g 离心 5 分钟。
   6. 弃去 PBS，将细胞重悬于 0.5 ml 血细胞培养基中。
   7. 计数细胞，并将 1 × 10⁶ 个细胞接种至 24 孔板的每孔中。在周围孔中加入 PBS 以防止蒸发。
   8. 在转导前，将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下稳定培养 5 天。在第 3 至第 4 天期间，轻轻加入额外的 0.5 ml 新鲜血细胞培养基，避免扰动细胞。

2. 副流感病毒转导

1. 转导（第0天）
   1. 收集血细胞并转移至15 ml锥形管中，使用血细胞计数板进行计数。
   2. 每项转导准备3 × 10⁵个细胞，并在室温下以515 × g离心5分钟。
   3. 用吸管弃去上清液，将细胞重悬于0.5 ml血液细胞培养基中。
   4. 将细胞转移至未包被的24孔板的一个孔中。
   5. 将仙台病毒混合物在冰上解冻，并加入悬浮细胞中。根据生产商的建议添加仙台病毒。
   6. 用封板膜密封培养板，在30 °C下以1,150 × g离心30分钟。
   7. 离心后，将细胞在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）培养。
2. 细胞转移至饲养层基质（第1天）
   1. 次日，用玻连蛋白包被一块24孔板。将玻连蛋白溶液用PBS稀释至终浓度为5 µg/ml。每孔加入1 ml玻连蛋白溶液，在室温下孵育至少1小时。使用前移除包被液。包被后的培养板可在室温下保存3天。
   2. 将含有细胞和病毒的所有培养基转移至已包被的孔中。
   3. 用额外的0.5 ml新鲜血液细胞培养基收集残留细胞，并加入含细胞的孔中。
   4. 在35 °C下以1,150 × g离心培养板10分钟。
   5. 离心后，弃去上清液，加入1 ml iPSC培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）培养细胞。
3. 第二次细胞转移（第2天）
   1. 按照步骤2.2.1所述方法，用5 µg/ml玻连蛋白包被新24孔板的各孔。每个转导使用一个孔。
   2. 将细胞悬液从第一块板转移至新包被的玻连蛋白板。
      ​注意：若不需要，可弃去悬浮细胞。步骤2.3中所述操作可用悬浮细胞重复2–3次。若需重复操作，请收集细胞。
   3. 同时，向第一块板的孔中加入1 ml iPSC培养基以维持培养，并在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）孵育。
   4. 将贴壁细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养，并每日更换新鲜iPSC培养基。转导后第14–21天可见克隆形成。
   5. 将含有悬浮细胞的新包被板在35 °C下以1,150 × g离心10分钟。
   6. 离心后，将细胞在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）培养。
   7. 次日，弃去上清液并更换为新鲜iPSC培养基。
      ​注意：步骤2.3中所述操作可用悬浮细胞重复2–3次。若需重复操作，请收集上清液中的细胞并重复步骤2.3。
   8. 持续进行每日换液，直至贴壁细胞达到80%汇合度。

3. 重编程细胞的维持

1. 24孔板培养后的早期维持
   1. 转导后7-10天，当细胞达到汇合状态时，准备一个包被了玻连蛋白（vitronectin）的60 mm培养皿。用PBS稀释玻连蛋白溶液，使其终浓度为5 µg/ml。向培养皿中加入1 ml玻连蛋白溶液，并在室温下孵育至少1小时。
   2. 用PBS洗涤细胞，然后加入1 ml PBS/1 mM EDTA以使细胞脱离。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育2分钟。
   4. 收集细胞，在250 × g、室温下离心2分钟。弃去上清液，将细胞重悬于3 ml新鲜的iPSC培养基中。
   5. 将所有重悬的细胞接种至新包被的60 mm培养皿中。
   6. 向培养基中加入10 mM RHO激酶抑制剂，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养，直至细胞达到80%汇合度。
2. 用于克隆形成的细胞传代（亚克隆准备）
   1. 按照步骤3.1.2所述方法，准备一个包被了玻连蛋白的100 mm培养皿。
   2. 用PBS洗涤细胞，然后加入1 ml PBS/1 mM EDTA以使细胞脱离。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育2分钟。
   4. 收集细胞，在250 × g、室温下离心2分钟。
   5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并按每皿1 × 10⁴个细胞的数量进行准备。
   6. 在250 × g、室温下再次离心2分钟。
   7. 将1 × 10⁴个细胞重悬于6 ml iPSC培养基中，接种至包被好的100 mm培养皿，并向培养基中加入10 mM RHO激酶抑制剂。
   8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育一周，直至出现较大的细胞集落。
      ​注意：维持并扩增这些集落以用于亚克隆。亚克隆通常在少于5次传代内完成。
3. 使用iPSC集落解离液进行集落挑取
   1. 在集落挑取前一周，按照步骤3.2.7所述方法，将1 × 10⁴个细胞接种至一个包被了玻连蛋白的100 mm培养皿中。
   2. 通过加入2 ml玻连蛋白溶液并室温孵育至少1小时，制备一个包被了玻连蛋白的60 mm培养皿。
   3. 在显微镜下（40倍或100倍放大）观察，用记号笔标记边界清晰的集落。移除步骤3.3.2中新制备培养皿中的玻连蛋白溶液，并加入6 ml含10 mM RHO激酶抑制剂的iPSC培养基。
   4. 移除细胞的培养基，并用3 ml PBS洗涤细胞。
   5. 加入1 ml iPSC集落解离液，在室温下孵育30秒。
   6. 移除溶液后，将培养皿继续在室温下静置额外30秒。
   7. 使用P200移液器吸取200 µl培养基，通过吹打使目标集落脱离，并将分散的集落转移至新的100 mm培养皿中。
   8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育并维持细胞。
      注意：获得纯化的iPSC集落后，继续培养细胞直至达到第10代。表征分析在至少10次传代后进行。抗体稀释比例和引物信息见表1和表2。

结果

本方案介绍了一种对从血液中分离的外周血单个核细胞（PBMCs）进行重编程的简单方法。通过连续贴壁培养与离心相结合的方式，成功获得了诱导多能干细胞（iPSCs）。利用该方法，无需分离或扩增特定细胞类型，仅使用少量全血细胞即可生成iPSCs。我们仅用1×10⁴个细胞在小型细胞培养板中即成功生成了iPSCs。

重编程前，使用密度梯度介质分离血细胞。在分离后第5天对血细胞进行转导。图1A展示了悬浮细胞重编程方法的示意图。分离后，外周血单个核细胞（PBMCs）在未包被的孔中用含有Yamanaka因子的仙台病毒进行转导。次日，通过离心收集悬浮细胞，并将其接种至包被有纤连蛋白的培养板上，而留在未包被孔中的贴壁细胞则被弃去。在纤连蛋白包被的培养板上出现的贴壁细胞被保留并进一步扩增。贴壁细胞使用iPSC培养基进行每日换液维持。对剩余的悬浮细胞重复进行离心接种操作。

讨论

由于胚胎干细胞（ESCs）存在多种缺陷，人们迫切需要一种替代工具。因此，山中伸弥（Yamanaka）开发的诱导多能干细胞（iPSCs）受到国际广泛关注。自山中伸弥发现仅通过向成体体细胞中导入四个基因即可诱导产生多能性以来，已近十年。由于iPSCs具有 "诱导的" 由成熟体细胞获得，可避免曾与胚胎干细胞（ESCs）相关的伦理问题。与胚胎干细胞不同，诱导多能干细胞（iPSCs）可由个体自身细胞产生，因此可用于个性化医学研究及其他领域，如药物筛选、疾病建模或再生医学。

2007年，首个由人类皮肤成纤维细胞生成的诱导多能干细胞（iPSC）被成功获得。多个研究团队已成功对该细胞类型进行重编程，但获取这类原代细胞需要侵入性外科手术，因此并非生成各类疾病特异性iPSC或设计再生医学策略的理想来源。人们需要其他更易获取的替代细胞类型，例如角质形成细胞、尿液单核细胞和血细胞。然而，这些细胞难以扩增，且其中一些细胞的污染风险较高¹⁰。

本研究中，我们介绍了一种能够从全血细胞（如外周血单个核细胞，PBMCs）成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料器皿
100 mm 培养皿	TPP	93100
6 孔板	TPP	92006
50 ml 离心管	SPL	50050
15 ml 离心管	SPL	50015
10 ml 一次性移液管	Falcon	7551
5 ml 一次性移液管	Falcon	7543
12 孔板	TPP	92012
24 孔板	TPP	92024
PBMC 分离材料
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	血细胞培养基
CC110	STEMCELL Technologies	8697	血细胞培养基添加剂（100倍浓缩）
iPSC 重编程与培养材料
CytoTune-iPSC Sendai 重编程试剂盒	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 培养基	STEMCELL Technologies	5940	iPSC 培养基
纤连蛋白（Vitronectin）	Life Technologies	A14700
ROCK 抑制剂	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express（TrypLE）	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	克隆解离溶液
质量控制材料
18 mm 盖玻片	Superior	HSU-0111580
4% 多聚甲醛	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
牛血清白蛋白	Vector Lab	SP-5050
抗 SSEA4 抗体	Millipore	MAB4304
抗 Oct4 抗体	Santa Cruz	SC9081
抗 TRA-1-60 抗体	Millipore	MAB4360
抗 Sox2 抗体	Biolegend	630801
抗 TRA-1-81 抗体	Millipore	MAB4381
抗 Klf4 抗体	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）抗体	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36934
载玻片，涂层	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
氯仿	Sigma Aldrich	366919
异丙醇	Millipore	109634
乙醇	Duksan	64-17-5
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒	Thermo Scientific	K1622
i-Taq DNA 聚合酶	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE 缓冲液	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
琼脂糖	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA 标准分子量标记	Enzynomics	DM003
碱性磷酸酶	Millipore	SCR004
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-1	漂洗缓冲液
氯化钠	Duchefa Biochemie	S0520.1000	漂洗缓冲液
Tween-20	BIOSESANG	T1027	漂洗缓冲液
盐酸	Duksan	1129	漂洗缓冲液