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方法文章

肝内结直肠转移的高级动物模型：成像技术与转移克隆特性

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DOI：

10.3791/54657

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2016年11月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

转移性克隆定植于远端部位的能力取决于其增殖能力，和/或在宿主微环境中不发生显著增殖而存活的能力。本文介绍了一种动物模型，可对转移性克隆的这两种肝脏定植方式进行定量可视化观察。

摘要

肝转移灶数量有限且进展速度较慢的患者可通过局部治疗手段获得有效治疗1,2然而，关于肝转移的异质性目前所知甚少，亟需能够评估单个转移灶发育过程的动物模型。本文介绍了一种先进的肝转移模型，可实现对肝脏中单个肿瘤克隆发育过程的定量可视化，并能够估算其生长动力学参数和定植效率。我们构建了一系列单克隆来源的HCT116人结直肠癌细胞系，这些细胞稳定表达荧光素酶和tdTomato，并具有不同的生长特性。通过脾脏注射后行脾切除术，这些克隆中的大多数能够在肝脏形成转移灶，但其定植频率和生长速率各不相同。利用该模型 在体 内 成像系统（IVIS），可以可视化并定量分析转移灶的发育过程 体内 发光的和 离体 荧光成像。此外，漫透射发光成像断层扫描（DLIT）可提供肝转移灶的三维分布 体内. 离体 收获肝脏的荧光成像可对单个肝转移灶进行定量测量，从而评估肝脏定植频率及转移灶的生长动力学。由于该模型与临床观察到的肝转移相似，可作为筛选与肝转移相关基因以及测试潜在消融性或辅助治疗手段的平台，用于肝转移性疾病的研究。

引言

原发性结直肠癌（CRC）伴肝转移患者的预后较差。原发性非转移性结直肠癌（I - III期）患者的5年生存率估计为75 - 88%3,4，而伴有肝转移（IV期）的患者5年生存率仅为8 - 12%5,6。然而，转移性患者属于异质性群体，其转移灶数量和复发时间各不相同。临床观察表明，转移灶的数量（可能与定植能力或定植频率成正比）以及单个转移灶的大小（与局部生长速率成正比）是两个独立的预后因素1,7。换句话说，转移性克隆在肝脏中成功定植依赖于两个主要特性：其在肝脏微环境中生长的能力，以及播散和存活的能力。

成功临床模型的设计若具备捕获和量化转移性克隆特性的能力，将极大促进我们对肝转移生物学的理解，并为潜在治疗策略的开发提供有效工具。实验性肝转移模型此前已有报道8,9，但两者均无法对单个转移性克隆的特性进行定量捕获和描述 体内 和 离体.

本文介绍了一种新型且先进的肝转移模型，该模型包含生成具有不同肝脏定植效率和生长特性的肿瘤克隆。我们采用双标记方法，将荧光素酶与tdTomato荧光蛋白共同标记癌细胞，并建立具有内在转移能力差异的单克隆细胞系。在此实验模型中，数据表明肝转移瘤的发展可通过定植频率和倍增时间（Td）来描述，这与临床观察结果一致。该模型的定量特性使其易于应用于药物发现和诊断研究。

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方案

所有动物实验均经芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 # 72213-09），并在无菌条件下进行。

1. 准备工作

  1. 配制500 mL HCT116肿瘤细胞培养用培养基：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。
  2. 将用于脾脏注射模型的器械进行高压灭菌，包括3至4块手术巾、纱布、两把小型Adson镊子、持针器、两把剪刀、一个小夹钳和3个微型夹，于251 °F下灭菌20分钟。
  3. 为小鼠准备术后麻醉药物，脾脏注射后经皮下给予。每只小鼠使用500 µL 0.9%生理盐水稀释2 - 4 µg的丁丙诺啡。
  4. 准备150 µg/150 µL的萤火虫荧光素分装液，用于生物发光检测期间的腹腔注射。于-20 °C保存并避光 避光。

2. 萤光素酶/tdTomato标记的单克隆细胞系的建立 10,11

  1. 解冻并维持 HCT116 人结直肠癌细胞和 293FT 人胚胎肾细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 DMEM 培养基，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养。
  2. 制备高滴度慢病毒。
    1. 第 1 天（D 1），将传代次数在 3 至 10 之间的 10 - 12 × 106 个 293FT 细胞接种于 15 cm 细胞培养皿中，每皿加入 18 mL 含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% 非必需氨基酸的完全 DMEM（cDMEM）。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 。
    2. 第 2 天（D 2），使用以下转染液进行细胞转染：
      1. 每皿使用以下混合物：将 37.5 µg 插入荧光素酶（Luc2）和 tdTomato 构建体的 pFUG 慢病毒载体11（由芝加哥大学 Geoffrey Greene 博士惠赠）、25 µg pCMVΔ8.74 和 12.5 µg pMD2.G 溶于总共 1,062 µL 无菌 H2O 中，再加入 188 µL 的 2 M CaCl2。
      2. 将 1,250 µL 的 2× HEPES 缓冲盐溶液（HBS，含 50 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4 和 180 mM NaCl，pH 7.12）逐滴加入 DNA/CaCl2 溶液中，同时用移液器向溶液中吹入气泡以混匀。
      3. 室温孵育 20 分钟，然后加入 15.5 mL 室温 cDMEM 和氯喹，使氯喹终浓度为 25 µM。
    3. 吸除各皿中 293FT 细胞的培养基，替换为转染液。缓慢加入 16 mL 转染液，避免贴壁细胞脱落。
    4. 第 3 天（D 3），转染后 8 - 16 小时，吸除转染液，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，注意避免细胞脱落。更换为含 10 mM HEPES 的 18 mL 新鲜 cDMEM。
      注意：操作过程中应轻柔移动培养皿，吸除转染液及添加培养基时应沿皿壁缓慢加入，避免冲击细胞。
    5. 第 4 天（D 4），即转染后 48 小时，用移液器缓慢吸出各皿中的培养基，避免细胞脱落。将收集的培养基在 300 × g 条件下离心 5 分钟，以沉淀大颗粒细胞碎片。
    6. 使用 0.45 µm 低蛋白结合滤器过滤病毒上清液，然后使用 SW-28 转子在 4 °C 条件下以 50,000 × g 离心 2 小时。离心 结束后立即倾去上清液，并用吸水纸擦干管内壁。
    7. 用 50 µL 含 1% FBS 的低血清培养基（RSM）重悬病毒沉淀。分装后可于 -80 °C 保存以备后续使用（病毒原液）。
  3. 将慢病毒感染 HCT116 细胞，并建立一组 tdTomato 阳性克隆。
    1. 在病毒感染前一天，以 1 × 105 个细胞/孔的密度将 HCT116 细胞接种于 24 孔板中。
    2. 将 40 µL 重悬的病毒液（来自步骤 2.2.7）加入含 1% 青霉素/链霉素和 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的 4 mL RSM 中（1:100 稀释），配制成 cRSM 病毒稀释液。
    3. 感染当天，用 DPBS 洗涤细胞一次，然后每孔加入 250 µL 步骤 2.3.2 所得的稀释病毒液。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 4 小时后，每孔加入 1 mL cDMEM；继续在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 48 - 72 小时。
    4. 用 1 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA 的溶液重悬细胞，再加入 1 mL cDMEM 以中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至微量离心管中，在 300 × g 条件下离心 4 分钟形成细胞沉淀。用含 2% FBS 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤沉淀 3 次 。
    5. 将步骤 2.3.4 所得细胞沉淀用 FACS 缓冲液（含 2% FBCS 和 2 mM EDTA 的 PBS）重悬，制备成浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的单细胞悬液。
    6. 使用流式细胞分选仪分选 tdTomato 阳性 HCT116 细胞，设门选择 PE 阳性细胞（激发/发射波长：556/585 nm）。将分选出的细胞接种于 10 cm 培养皿中，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养，获得亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞（图 1A）。
    7. 将步骤 2.3.6 获得的亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞用 8 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA 的溶液消化 3 - 5 分钟，然后加入 8 mL cDMEM 中和胰蛋白酶。
      1. 将细胞转移至 50 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 4 分钟。弃上清，用 cDMEM 将亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞稀释至每 200 µL 含 1 个细胞（图 1B）。
    8. 将单个细胞（200 µL 稀释液）接种至 96 孔板中，每孔一个细胞，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养（图 1C）。
    9. 将单克隆细胞在培养瓶中继续培养，维持于 5% CO2 和 37 °C 条件下（图 1D）。

3. 荧光信号强度随细胞数量的校准

  1. 将转染后的 HCT116 细胞（现称为 HCT116-L2T）以每孔 0、103、2 × 104、3 × 105、5 × 104、7 × 104、9 × 104 和 105 个细胞的密度，每种密度设三个复孔，接种于 96 孔板中。
  2. 孵育 5 小时后，使用 IVIS10 定量检测 tdTomato 荧光强度。
    1. 点击桌面上的图像软件图标以启动程序。点击 "Initialize" 按钮初始化成像系统。初始化完成后（约需数分钟），选择 "Fluorescence" 模式，设置曝光时间为 "4 second"， binning 为 "Medium"，F/stop 为 "2"，激发滤光片为 "535"，发射滤光片为 "580"。
    2. 将 96 孔板放置于成像仪载物台上，点击 "Acquire" 开始成像。成像完成后，点击工具栏中的 "ROI Tools"，并从狭缝图标中选择 12 × 8 模式。
    3. 创建 12 × 8 个狭缝区域以覆盖 96 孔板图像上的信号区域，然后点击“测量”标签。此时将弹出一个表格窗口，显示各 ROI 的测量值，单位为光子每秒每球面度每平方厘米（photons/s/sr/cm2）。
  3. 绘制散点图，横坐标（X 轴）为细胞数量，纵坐标（Y 轴）为信号强度。使用数据分析软件拟合回归曲线，计算对应单位荧光强度的细胞数量（图 2）10。

4. 肝转移动物模型

  1. 当 HCT116-L2T 细胞达到 70 - 80% 汇合度时，于脾脏注射前约 1 小时进行准备。使用含 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶消化 3 - 5 分钟，随后加入等体积的完全 DMEM（cDMEM）中和。务必充分吹打以避免细胞结团。
  2. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  3. 将细胞重悬于 1× DPBS 中，调整浓度至 1.2 - 2 × 106 个细胞/100 µL。务必充分吹打并彻底重悬细胞，以防止结团。
  4. 将细胞置于冰上直至注射，期间偶尔轻柔吹打混匀。
  5. 在麻醉小鼠前，通过皮下注射 500 µL 步骤 1.3 中所述的布托啡诺混合液，给予术前镇痛和液体负荷。术后每天两次追加相同剂量的布托啡诺混合液，直至疼痛症状消失（如活动减少、蜷缩姿态、不梳理毛发、触碰时发声）。
  6. 在麻醉舱中使用含 2% 异氟烷的氧气对 6 至 8 周龄雌性裸鼠进行麻醉。通过夹捏尾巴确认小鼠已完全进入麻醉状态。使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。 将每只麻醉后的小鼠转移至独立的鼻罩进行脾脏注射。在切口前，每只小鼠均应覆盖无菌手术巾。
  7. 在裸鼠左侧腹侧，通过皮肤外部观察可识别出脾脏为一紫色区域。使用显微手术剪在脾脏正上方的左侧腹壁皮肤做一 8 mm 的切口。
    1. 随后提起腹壁，做一小切口，使空气进入腹腔，促使内脏远离切口部位。将腹壁切口扩大至约 5 mm。
    2. 用棉签轻轻按压切口周围，暴露脾脏。如有需要，可轻柔移动胰腺脂肪组织以辅助暴露，注意避免损伤脾脏。
  8. 使用带 27 G 针头的 1 mL 注射器，缓慢将 100 µL 细胞悬液注入暴露的脾脏尖端。注射过程应持续至少 30 - 60 秒，以避免肝外肿瘤形成。
  9. 注射结束、拔针前，在脾脏注射部位放置一个微型夹，防止细胞悬液泄漏。
  10. 微型夹保留 5 分钟。
  11. 注射后 5 分钟，使用手持电凝设备行脾切除术以实现止血。从腹前侧开始解剖脾门。在处理较大血管时，应先用电凝对血管近端及其邻近脂肪组织进行预凝固，以防止大量出血。
    注：止血方法包括：直接用电凝凝固出血点、对出血点压迫 3 - 5 分钟，或使用 5-0 丝线缝扎止血。
  12. 以两层缝合方式关闭每只小鼠的腹壁切口。首先使用 5-0 可吸收编织缝线（例如，vicryl）行单个水平缝合关闭腹壁；随后使用 4-0 不可吸收单丝缝线（例如，prolene）行单个水平缝合关闭皮肤。
  13. 每次操作之间，通过喷洒 70% 异丙醇清洁所有器械，以维持无菌条件。
    注：确保动物在苏醒过程中保持温暖。术后密切观察所有小鼠，直至其能够自主活动并恢复常规行为。通常恢复时间为 3 - 5 分钟。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。

5. 在体实验 生物发光成像

  1. 每周进行成像，以测量和量化生物发光随时间的变化。
  2. 将小鼠放入麻醉舱中，使用2%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉。通过轻捏小鼠尾巴确认其是否完全进入麻醉状态。在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  3. 接着，向每只小鼠腹腔注射150 µL步骤1.4中预先配制好的萤火虫荧光素。
  4. 将小鼠放入IVIS成像仪中，通过独立的鼻罩给予异氟烷麻醉。将小鼠仰卧放置，并使用间隔物分隔，以尽量减少对相邻小鼠信号的干扰。每次最多可同时成像五只小鼠。
  5. 在荧光素注射后3分钟测量并分析生物发光强度。
    1. 在按照步骤 3.2.1 初始化 IVIS 后，选择 "发光的", "1 秒" 曝光时间，以及 "培养基" 分箱
    2. 点击 "获取" 点击按钮开始成像。确保每次成像均在注射荧光素后相同时间（3 分钟）进行。
    3. 图像采集完成后，将出现图像窗口和工具面板。点击 "ROI 工具" 并选择 "1", "2", "3", "4"，或 "5" 从圆圈图标，对应成像小鼠的数量。
    4. 为定义感兴趣区域（ROIs），在小鼠腹腔内发光信号的信号区域周围绘制圆形，然后点击 "测量" ROI的辐射效率任意单位（光子/秒/平方厘米2/球面度)/(µW/cm2)). 确保另设一个背景区域的ROI圆圈。
  6. 注射后四周，在动物处死前，使用IVIS进行漫透射发光成像断层扫描（DLIT），通过个体肿瘤克隆生物发光强度的实时三维重建，评估肿瘤负荷及分布情况。
    1. 将小鼠麻醉并注射荧光素，具体操作如步骤 5.2.4 所述。每次对一只小鼠进行 DLIT 成像。
    2. 在初始化IVIS后，按照3.2.1步骤所述，选择 "成像向导", "生物发光"，然后单击 "下一步"选择 "DLIT" 并点击 "下一步"选择 "萤火虫" 探针与点击反应 "下一步"选择 "小鼠" 图像主体， "自动" 曝光参数， "C-13 cm" 视野，以及 "0.5 cm" 受试者身高，然后点击 "下一步". 点击 "获取" 开始成像按钮。
    3. 图像采集完成后，选择 "DLIT 三维重建" 标签和该 "分析" 标签并单击 "重建" 生成三维重建图像。
    4. 点击 "工具" 和 "3D动画"选择 "沿 Y 轴逆时针旋转" 在3D动画窗口中，单击 "记录" 和 "保存" .mov 格式的文件

6. 离体 荧光成像

  1. 在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，或根据机构指南 在脾脏注射后4至6周进行处死。
  2. 取出肝脏。从左侧至右侧肋腹部做一横向切口。用镊子夹住剑突，分离镰状韧带、肝静脉和下腔静脉。
    1. 分离右侧肝肾韧带、肝十二指肠韧带和左侧肝肾韧带，在分离肝十二指肠韧带时注意避免损伤尾状叶。肝脏取出后，移除胆囊，因其会产生自发荧光。记录是否存在其他肝外肿瘤。
  3. 肉眼观察并记录肝脏肿瘤的数量和大小，并将取出的肝脏置于DPBS中。
    注：肿瘤在肉眼下可见为白色病灶（代表性示例见图4）。
  4. 在将肝脏放置于成像板之前，用纸巾轻轻吸去表面多余液体。
  5. 使用IVIS测量每个肿瘤克隆的荧光强度。
    1. 选择"荧光"模式，曝光时间为"4秒"，binning设为"中等"，F/stop设为"2"，激发滤光片设为"535"，发射滤光片设为"580"。点击"采集"按钮开始成像。
    2. 图像采集完成后，定位图像窗口和工具面板。点击"ROI工具"，从圆形图标中选择"1"。定义感兴趣区域（ROI）时，在图像上圈选各个肿瘤克隆的信号区域，然后点击"测量"以获得辐射效率的任意单位值（(光子数/s/cm2/球面度)/(µW/cm2)）。确保额外设置一个背景区域的ROI圆圈。
  6. 假设肿瘤为球形，计算总肿瘤体积。肿瘤体积 = 4 × π × r3 / 3（r = 半径）。计算肿瘤克隆形成细胞的比例（Fc），即肝脏中肿瘤数量除以脾脏注射的细胞数量。
  7. 根据步骤3.3的线性近似计算每个克隆的总细胞数（=X）。计算细胞分裂次数（=Y），Y = log2X，倍增时间Td计算为Td（天）= 28 / Y。

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结果

本实验的目的是建立一种稳定且易于重复的动物模型，具有对目标指标进行连续定量检测的潜力 体内 转移性肿瘤负荷，以及肝转移灶定植频率和生长动力学的评估。 图2-6，图注来自我们此前在知识共享CC-BY许可下的出版物10.

双标记肿瘤细胞单克隆的制备

首先，构建了一组具有不同转移能力的、带有发光和荧光标记的单克隆细胞系。在成功将发光蛋白（Luc2）和荧光蛋白（tdTomato）转染至亲本HCT116结直肠癌细胞后，通过将亲本HCT116-L2T细胞稀释至1个细胞/孔，获得了16个双标记的单克隆细胞系。200 µL 在 96 孔板（图1)10. 体外 使用逐渐增加的细胞数量对HCT...

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讨论

本报告中所介绍的动物模型基于两种主要方法。首先，为了能够观察具有不同肝定植和增殖倾向的转移性克隆，我们建立了一组高度异质性的单克隆细胞系，而非使用未经分选的已建立癌细胞系12,13。这种以单克隆方式研究转移发展的策略得到了近期基因组数据的支持14，并已被成功用于模拟转移过程10,15,16。其次，通过将荧光素酶和tdTomato标记物对亲本细胞系进行双标记，以增强对转移性生长在体内（in vivo）和离体（ex vivo）条件下的分析能力。发光和荧光标记使得能够详细进行解剖学观察，并可对转移性肿瘤的数量（视为肝定植的频率或效率）以及各个克隆的大小进行定量评估。后者可通过步骤2中描述的简单校准程序，轻松转换为实际的细胞数量，相关方法见图210和图410。利用这些数据，可以估算肝脏中每个转移灶的倍增时间（Td），并评估每种初始注射单克隆所形成的肝转移灶的生长动力学（图5）10...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢芝加哥大学的 Geoffrey L. Greene 博士提供 Luc2-tdTomato 质粒和 HCT116 细胞系，感谢动物资源中心的 Ani Solanki 先生在小鼠管理方面的协助，以及 Lara Leoni 博士在DLIT实验中的帮助。荧光和生物发光强度的定量分析在芝加哥大学的综合小型动物影像研究资源中心使用 IVIS Spectrum 系统（PerkinElmer，美国马萨诸塞州霍普金顿）完成。本研究得到 Ludwig 癌症研究基金会（Virginia 和 D.K. Ludwig 基金）、肺癌研究基金会（LCRF）、前列腺癌基金会（PCF）以及癌症中心支持基金（P30CA014599）的资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IVIS Spectrum 活体成像系统Caliper Life Sciences124262活体成像系统
LivingImage 4.0 软件Caliper Life Sciences128165成像软件
VAD-MGX 研究用麻醉机VetamacVAD-MGX吸入式麻醉机
DMEMGibco11965-118细胞培养试剂
DPBSGibco14190250细胞培养试剂
青霉素/链霉素溶液（10,000 单位青霉素；10,000 μg 链霉素）Invitrogen15140163细胞培养试剂
HBSSThermoFisher24020117细胞培养试剂
布托啡诺注射液（0.3 mg/mL）Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-5盐酸布托啡诺
Gemini 电凝系统Braintree ScientificGEM 5917脾切除用手持式电凝设备
微型夹；直型；70 克压力；1.5 mm 夹宽；10 mm 钳口长度Roboz 外科器械公司RS-5426止血夹：脾脏注射后止血器械
D-荧光素钾盐Goldbio TechnologyLUCK-1G荧光素钾盐
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985062低血清培养基
TC20 自动细胞计数仪BIO-RAD1450102自动细胞计数仪
JMP10 软件 SAS Institute数据分析软件
BD FACSAria II 细胞分选仪BD Biocsiences细胞分选仪

参考文献

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IVIS HCT116
肝内结直肠转移的高级动物模型：成像技术与转移克隆特性
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