肝内结直肠转移的高级动物模型：成像技术与转移克隆特性

摘要

转移性克隆定植于远端部位的能力取决于其增殖能力，和/或在宿主微环境中不发生显著增殖而存活的能力。本文介绍了一种动物模型，可对转移性克隆的这两种肝脏定植方式进行定量可视化观察。

摘要

肝转移灶数量有限且进展速度较慢的患者可通过局部治疗手段获得有效治疗^1,2然而，关于肝转移的异质性目前所知甚少，亟需能够评估单个转移灶发育过程的动物模型。本文介绍了一种先进的肝转移模型，可实现对肝脏中单个肿瘤克隆发育过程的定量可视化，并能够估算其生长动力学参数和定植效率。我们构建了一系列单克隆来源的HCT116人结直肠癌细胞系，这些细胞稳定表达荧光素酶和tdTomato，并具有不同的生长特性。通过脾脏注射后行脾切除术，这些克隆中的大多数能够在肝脏形成转移灶，但其定植频率和生长速率各不相同。利用该模型 在体 内 成像系统（IVIS），可以可视化并定量分析转移灶的发育过程 体内 发光的和 离体 荧光成像。此外，漫透射发光成像断层扫描（DLIT）可提供肝转移灶的三维分布 体内. 离体 收获肝脏的荧光成像可对单个肝转移灶进行定量测量，从而评估肝脏定植频率及转移灶的生长动力学。由于该模型与临床观察到的肝转移相似，可作为筛选与肝转移相关基因以及测试潜在消融性或辅助治疗手段的平台，用于肝转移性疾病的研究。

引言

原发性结直肠癌（CRC）伴肝转移患者的预后较差。原发性非转移性结直肠癌（I - III期）患者的5年生存率估计为75 - 88%^3,4，而伴有肝转移（IV期）的患者5年生存率仅为8 - 12%^5,6。然而，转移性患者属于异质性群体，其转移灶数量和复发时间各不相同。临床观察表明，转移灶的数量（可能与定植能力或定植频率成正比）以及单个转移灶的大小（与局部生长速率成正比）是两个独立的预后因素^1,7。换句话说，转移性克隆在肝脏中成功定植依赖于两个主要特性：其在肝脏微环境中生长的能力，以及播散和存活的能力。

成功临床模型的设计若具备捕获和量化转移性克隆特性的能力，将极大促进我们对肝转移生物学的理解，并为潜在治疗策略的开发提供有效工具。实验性肝转移模型此前已有报道^8,9，但两者均无法对单个转移性克隆的特性进行定量捕获和描述 体内 和 离体.

本文介绍了一种新型且先进的肝转移模型，该模型包含生成具有不同肝脏定植效率和生长特性的肿瘤克隆。我们采用双标记方法，将荧光素酶与tdTomato荧光蛋白共同标记癌细胞，并建立具有内在转移能力差异的单克隆细胞系。在此实验模型中，数据表明肝转移瘤的发展可通过定植频率和倍增时间（Td）来描述，这与临床观察结果一致。该模型的定量特性使其易于应用于药物发现和诊断研究。

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方案

所有动物实验均经芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 # 72213-09），并在无菌条件下进行。

1. 准备工作

1. 配制500 mL HCT116肿瘤细胞培养用培养基：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。
2. 将用于脾脏注射模型的器械进行高压灭菌，包括3至4块手术巾、纱布、两把小型Adson镊子、持针器、两把剪刀、一个小夹钳和3个微型夹，于251 °F下灭菌20分钟。
3. 为小鼠准备术后麻醉药物，脾脏注射后经皮下给予。每只小鼠使用500 µL 0.9%生理盐水稀释2 - 4 µg的丁丙诺啡。
4. 准备150 µg/150 µL的萤火虫荧光素分装液，用于生物发光检测期间的腹腔注射。于-20 °C保存并避光 避光。

2. 萤光素酶/tdTomato标记的单克隆细胞系的建立 ^10,11

1. 解冻并维持 HCT116 人结直肠癌细胞和 293FT 人胚胎肾细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 DMEM 培养基，在 5% CO₂ 和 37 °C 条件下培养。
2. 制备高滴度慢病毒。
   1. 第 1 天（D 1），将传代....

结果

本实验的目的是建立一种稳定且易于重复的动物模型，具有对目标指标进行连续定量检测的潜力 体内 转移性肿瘤负荷，以及肝转移灶定植频率和生长动力学的评估。 图2-6，图注来自我们此前在知识共享CC-BY许可下的出版物¹⁰.

双标记肿瘤细胞单克隆的制备

首先，构建了一组具有不同转移能力的、带有发光和荧光标记的单克隆细胞系。在成功将发光蛋白（Luc2）和荧光蛋白（tdTomato）转染至亲本HCT116结直肠癌细胞后，通过将亲本HCT116-L2T细胞稀释至1个细胞/孔，获得了16个双标记的单克隆细胞系。200 µL 在 96 孔板（图1)¹⁰. 体外 使用逐渐增加的细胞数量对HCT.......

讨论

本报告中所介绍的动物模型基于两种主要方法。首先，为了能够观察具有不同肝定植和增殖倾向的转移性克隆，我们建立了一组高度异质性的单克隆细胞系，而非使用未经分选的已建立癌细胞系^12,13。这种以单克隆方式研究转移发展的策略得到了近期基因组数据的支持¹⁴，并已被成功用于模拟转移过程^10,15,16。其次，通过将荧光素酶和tdTomato标记物对亲本细胞系进行双标记，以增强对转移性生长在体内（in vivo）和离体（ex vivo）条件下的分析能力。发光和荧光标记使得能够详细进行解剖学观察，并可对转移性肿瘤的数量（视为肝定植的频率或效率）以及各个克隆的大小进行定量评估。后者可通过步骤2中描述的简单校准程序，轻松转换为实际的细胞数量，相关方法见图2¹⁰和图4¹⁰。利用这些数据，可以估算肝脏中每个转移灶的倍增时间（Td），并评估每种初始注射单克隆所形成的肝转移灶的生长动力学（图5）¹⁰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IVIS Spectrum 活体成像系统	Caliper Life Sciences	124262	活体成像系统
LivingImage 4.0 软件	Caliper Life Sciences	128165	成像软件
VAD-MGX 研究用麻醉机	Vetamac	VAD-MGX	吸入式麻醉机
DMEM	Gibco	11965-118	细胞培养试剂
DPBS	Gibco	14190250	细胞培养试剂
青霉素/链霉素溶液（10,000 单位青霉素；10,000 μg 链霉素）	Invitrogen	15140163	细胞培养试剂
HBSS	ThermoFisher	24020117	细胞培养试剂
布托啡诺注射液（0.3 mg/mL）	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	盐酸布托啡诺
Gemini 电凝系统	Braintree Scientific	GEM 5917	脾切除用手持式电凝设备
微型夹；直型；70 克压力；1.5 mm 夹宽；10 mm 钳口长度	Roboz 外科器械公司	RS-5426	止血夹：脾脏注射后止血器械
D-荧光素钾盐	Goldbio Technology	LUCK-1G	荧光素钾盐
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985062	低血清培养基
TC20 自动细胞计数仪	BIO-RAD	1450102	自动细胞计数仪
JMP10 软件	SAS Institute		数据分析软件
BD FACSAria II 细胞分选仪	BD Biocsiences		细胞分选仪