一种建立小鼠角膜缘干细胞缺乏症的简易机械方法

摘要

以下文章提供了一种简便且可重复的技术，用于有效建立可持续的小鼠角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）模型。该动物模型可用于测试和比较针对角膜缘干细胞疾病治疗方法的有效性。

摘要

角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）是一种角膜缘上皮干细胞功能障碍或缺失的状态，其后果是角膜上皮被结膜组织取代。患者会出现反复的角膜缺损、疼痛、炎症以及视力丧失。

此前，已有研究描述并比较了三种小鼠LSCD模型。其目标是建立一种稳定的小鼠LSCD模型，既能模拟人类疾病的表型，又能维持足够长的时间，以便研究疾病的病理生理机制并评估新的治疗方法。本文对此技术进行了更为详细的描述。

已设计一种带有旋转磨头的电动工具，用于清除角膜表面的铁锈环，或对翼状胬肉切除后的创面进行修整。该工具适用于构建理想的角膜缘干细胞缺乏（LSCD）模型。它是一种易于获取且操作简便的设备，具有精细的尖端，适合在小眼球（如小鼠）上进行操作。该工具的应用可避免对眼睛造成不必要的创伤，且不会像化学损伤模型那样导致意外的组织损伤。与钝性刮刀不同，该工具能够连同基底膜一并去除上皮组织。在本实验方案中，先对角膜缘区域进行两次刮擦，随后将整个角膜上皮从一侧角膜缘到另一侧角膜缘完全剃除。为避免损伤角膜基质，在上皮已被完全去除后，不再对角膜表面进行刷拭操作。

引言

角膜上皮对于维持角膜的透明性和完整性至关重要。它在整个生命过程中由位于角膜与结膜交界处狭窄区域——角膜缘中的上皮干细胞不断更新。这些具有自我更新能力的角膜缘干细胞在正常情况下以及损伤后对角膜上皮的再生起着关键作用。这些干细胞的部分或完全缺失将导致反复发作的角膜糜烂、疼痛、角膜瘢痕和新生血管形成、杯状细胞出现，若不加治疗，最终可致角膜盲。这种状况被称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），其病因可以是特发性、遗传性，或由化学伤、热烧伤、长期佩戴隐形眼镜及慢性炎症等获得性因素引起^1-6。

LSCD 的研究需要一种合适的动物模型，该模型不仅能够模拟人类的疾病状况，而且具有可重复性和可持续性，同时对其他角膜和眼部结构造成的损伤最小。这种模型对于评估治疗方法以及在分子和细胞水平上阐明疾病机制至关重要。如前所述¹，通过使用旋转磨头，可以轻松建立一种具有上述优点且持续至少三个月的小鼠 LSCD 模型。本研究的目的是建立一种简单、可重复且可持续的小鼠 LSCD 模型。

旋转钻头是一种便捷的工具，可均匀地去除上皮层，同时不损伤其下方的基质¹。该工具已被用于在伤口愈合研究中诱导中央角膜上皮缺损^{7, 8}。本文所介绍的在小鼠中建立角膜缘干细胞缺乏（LSCD）的技术此前尚未见报道。以往采用钝性刮匙刮除上皮的方法所造成的损伤均匀性较差——尤其是在角膜缘区域——且表型变异较大^{1, 9}，更易出现正常角膜上皮的修复¹。与钝性刮除工具不同，旋转钻头还可同时去除上皮基底膜^{7, 8, 10}。其他已报道的破坏干细胞的方法包括使用化学物质，如氢氧化钠、正庚醇和苯扎氯铵，这些物质不仅可能对眼球深层结构造成非预期损伤，还可能引发显著的炎症反应，进而导致角膜混浊或上皮鳞状化生^11-15。而旋转钻头则不会引起此类严重并发症。手术切除角膜缘上皮（单独或联合化学方法）^{10, 11, 16}操作难度较大，尤其不适用于眼表尺寸较小且角膜缘上皮较薄的动物（如小鼠）。此外，令人意外的是，角膜缘切除术仍可能残留部分角膜缘上皮¹⁰。

以下所述的技术将导致出现伴有新生血管化和结膜化的角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），其表现与患者中完全性LSCD的临床表现相似，并可持续至少三个月¹。该技术适用于旨在研究小鼠角膜缘干细胞缺乏症或伤口愈合病理生理学、免疫学及潜在治疗方法的研究人员。可能经过适当改良后，该操作也可应用于大鼠或兔¹⁰。由于旋转钻头可高效去除上皮层，因此该方法还可用于任何与角膜上皮擦伤/损伤相关的研究，以及相关治疗或分子生物学研究。

方案

所有动物实验操作均符合视觉与眼科研究协会关于动物在视觉研究中使用的声明。实验使用了14只4至6月龄的雄性/雌性C57BL/6J野生型小鼠：其中10只用于损伤模型，4只作为对照动物（未损伤角膜）。

1. 动物准备

1. 通过腹腔注射100 mg/kg的氯胺酮和5 mg/kg的赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。麻醉起效后，捏压脚趾以确认麻醉深度；小鼠应无反应。
2. 在进行实验前，使用裂隙灯检查眼睛，确认角膜无既往损伤。
3. 在眼部滴入一滴1%盐酸丁卡因。60至90秒后，测试角膜反射以确认感觉消失。也可使用0.5%盐酸丙帕卡因替代。
4. 确认角膜感觉丧失后，轻柔地在眼部及眼周毛发上滴加一滴5%聚维酮碘。1分钟后擦去药液，或将药液涂抹于眼周毛发，以防止毛发干扰工具尖端。

2. 磨削角膜上皮

1. 佩戴外科手套和手术服。准备所需器械：无菌旋转钻头和一把无菌镊子。为便于操作，建议使用弯头镊子。操作过程中将器械放置于无菌敷布上。
2. 使用弯头镊子从鼻侧夹住眼睑，轻轻固定眼球并使其轻度突出。避免施加过大压力。
3. 在手术显微镜下，使用无菌旋转钻头围绕角膜缘区域进行360°剃除，重复两次。每圈操作速度控制在5至6秒。
   注意：钻头为固定转速。但要达到设定转速，必须将"末端螺母"完全拧紧。
4. 使用旋转钻头将角膜上皮从一侧角膜缘至对侧完全去除。为获得更佳效果，应以环形方式移动器械，并使器械与角膜表面保持一定平行度，利用其尖端侧面进行操作。注意避免对已去除上皮的区域重复刷擦，以防损伤基质层。操作时切勿对眼球施加压力。根据需要及时清洁刷头。
5. 在角膜表面滴加一滴无菌磷酸盐缓冲液，并用柔软的清洁纸巾轻轻擦去脱落的上皮组织。
6. 如有残留上皮，需进一步剃除。
7. 手术过程中应注意观察小鼠尾巴的状态。
   注意：若出现尾部活动，表明麻醉深度已不足，需追加注射。追加剂量应为初始注射量的三分之一至三分之二即可。切勿过量使用麻醉药物。
8. 在对另一只眼睛使用前，必须对所有器械进行灭菌处理。

3. 确认上皮完全去除

1. 在角膜上滴加一滴 1 mg/ml 荧光素钠。30 秒后清洁角膜，并在显微镜下使用钴蓝滤光片检查，以确认上皮已完全去除。
   注意：角膜上皮缺损区域呈绿色显示。

4. 术后护理

1. 将动物置于加热垫上，并在其恢复期间放置于安全处（例如，放入其笼中）。切勿将无意识的动物与有意识的动物同置一处。
2. 涂抹1%红霉素眼膏，以预防眼部干燥。术后每日继续使用该抗生素，持续一周。
3. 手术后皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，12小时后再次注射。此后每日注射两次，持续两天。
4. 观察动物30至45分钟，直至其完全从麻醉中恢复。
   注意：恢复期间腹侧呼吸肌的轻微运动表明动物状态良好。

结果

采用该技术后一个月内，100%的角膜出现浅层新生血管化（图1A。照片使用连接裂隙灯的相机在明场和钴蓝滤光片下拍摄）。在20只眼中的18只（90%）中，新生血管化累及整个角膜表面（图1A）。在20只眼中的2只（10%）中，四个角膜象限中的三个出现新生血管化，但仍延伸至角膜中央。)

为了验证鳞状上皮干细胞缺乏症（LSCD）的发展，进行了整体免疫染色¹。此步骤不属于本实验方案的一部分，可根据具体目标和研究兴趣进行调整。考虑了三种作为LSCD指标的变化：角蛋白（CK）12的缺失，这是一种正常角膜上皮细胞特有的中间丝蛋白^{17, 18}；角蛋白CK8的出现，这是一种单层上皮标志物²⁰，在正常角膜中不存在；以及角膜表面出现杯状细胞。为了评估角膜上皮表型，在损伤后三个月对整体样本进行CK12和CK8的双重免疫染色，方法如前所述^1...

讨论

本文介绍了一种可重复且相对简单的构建小鼠LSCD模型的技术。该模型有几个重要特点值得注意。首先，与使用化学物质的模型^{11, 12}不同，这种损伤主要局限于角膜表面上皮（及基底膜），对角膜基质层或其他眼内结构的损害极小。因此，炎症反应和瘢痕形成均较轻微，而这两种情况都可能使操作复杂化，并增加评估针对角膜缘干细胞干预措施效果的难度。Li et al.¹⁰近期一项有趣的研究比较了旋转钻头与不同手术和化学处理组合在兔体上建立LSCD模型的效果，结果也发现使用钻头更为安全且有效。其次，该模型的病理状态似乎至少可稳定维持三个月¹。建立该模型所用的旋转钻头是角膜临床工作者以及从事小鼠创伤研究的研究人员所熟悉的工具。与使用钝性刮匙相比，其优势在于造成的损伤更加均匀且可重复¹。

为更有效地破坏角膜缘干细胞，对角膜缘区域进行了两次处理。根据小鼠眼球操作经验，超过两次的处理常会磨损角膜缘血管并导致出血。若该技术应用于其他动物，此步骤可根据角膜上皮厚度进行相应调整。本研究中使用了带有0.5 mm磨头的电...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旋转磨头：AlgerBrush II 锈环去除器	Rumex International Co, 美国克利尔沃特	16-141	0.5 mm 磨头。其他公司亦有供应。
手术显微镜	Wild Heerbrugg, 瑞士	Wild M691
数码相机	Nikon, 泰国
Nikon FS-2 裂隙灯	Nikon, 日本
多克隆抗 CK12 抗体	Santa Cruz Biotechnology, 美国加利福尼亚州	SC-17101	1:100 浓度
单克隆抗 CK8 抗体	TROMA-I-s, 美国爱荷华州爱荷华城	AB_531826	1:50 浓度