小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

摘要

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于确定纳米颗粒对神经毒性的影 响。我们描述了一系列实验设计，旨在检测小胶质细胞对纳米颗粒的反应，以及下丘脑神经元暴露于活化小胶质细胞上清液后的神经毒性效应。

摘要

空气污染物中的纳米颗粒可改变神经递质谱型，加剧神经炎症，并影响大脑功能。因此，本文所述的检测方法将有助于阐明小胶质细胞在神经炎症及神经退行性疾病中的作用。利用作为大脑常驻免疫细胞的小胶质细胞作为替代性生物传感器，可为炎症反应如何介导神经元损伤提供新的见解。本文中，我们采用一种永生化的小鼠小胶质细胞系（BV2），并描述了一种以银纳米颗粒（AgNPs）为标准的纳米颗粒暴露方法。我们阐述了如何使小胶质细胞暴露于纳米颗粒，如何从上清液中去除纳米颗粒，以及如何利用活化后小胶质细胞的上清液，通过下丘脑细胞存活率来评估其毒性。在AgNP暴露后，采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）验证BV2小胶质细胞的活化状态。上清液经过滤以去除AgNP，同时保留细胞因子及其他分泌因子于条件培养基中。随后将下丘脑细胞暴露于经AgNP活化的小胶质细胞上清液中，并采用基于刃天青的荧光检测法测定神经元的存活情况。该技术适用于将小胶质细胞作为神经炎症的替代性生物标志物，并用于评估神经炎症对其他细胞类型的影响。

引言

环境污染物，特别是纳米颗粒（NP）范围（1 - 20 nm 直径）的污染物，由于能够穿过血脑屏障，已被关联到肥胖症及其他神经退行性疾病 ^1-3暴露于高水平的污染物可能引发中枢神经系统（包括下丘脑）的炎症反应 ¹一种可能的机制是纳米颗粒激活小胶质细胞（脑内免疫细胞）所致 ⁴. 先前的研究已使用 体内 用于研究纳米颗粒对脑健康影响的模型耗时长、成本高，且无法直接回答纳米颗粒如何影响小胶质细胞的问题。小胶质细胞在中枢神经系统中具有多种功能，包括维持脑微环境稳态，并通过释放分泌因子和细胞因子与周围神经元进行通讯。根据不同的刺激信号，小胶质细胞可被激活为M1型促炎状态或M2型抗炎状态。例如，M1型活化的小胶质细胞会释放肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子，而M2型活化的小胶质细胞则释放白细胞介素-4（IL-4）等抗炎细胞因子。为验证我们的替代模型 体外 用于测定空气污染物神经毒性的生物传感器，我们测量了小胶质细胞对20 nm银纳米颗粒（AgNPs）的反应。本文旨在描述如何实现这一目标 体外 小胶质细胞系可作为替代性生物传感器标志物，用于检测小鼠小胶质细胞对纳米颗粒的反应，以及小胶质细胞活化对下丘脑细胞的影响。该经验证模型的长期应用目标是评估真实环境污染物对脑健康及神经退行性疾病的影响。本文提供了详细的描述 体外 用于检测小胶质细胞活化及下丘脑细胞存活率的96孔板检测方法，基于小胶质细胞条件培养基处理....

方案

1. 小胶质细胞培养的维持

1. 将细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基；DMEM）置于 37 °C 预热，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素/新霉素（PSN）。
2. 从 -80 °C 保存处取出第 18 至 25 代的冻存 BV2 小胶质细胞，迅速放入 37 °C 水浴中解冻。
3. 轻柔地将细胞转移至含有 10 ml 细胞培养基的 75 cm² 透气培养瓶中。
4. 将培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育。24 小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至约 70–80% 汇合度。

2. 细胞计数与接种

1. 在37 °C水浴中预热DMEM和1x胰蛋白酶-EDTA溶液。
2. 吸除细胞培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2–5分钟。
3. 使用细胞刮将细胞从培养瓶中刮下，并重悬于5 ml DMEM中。将细胞悬液通过70 µm细胞筛网，转入50 ml离心管，重复吹打三次。
4. 使用血细胞计数板计数细胞，并将8,000个细胞/孔接种至黑色壁透明底培养板中，每孔终体积为200 µl，含10% FBS和1% PSN的DMEM。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。

结果

我们利用上述方案表明，小胶质细胞可作为大脑对纳米颗粒反应的替代性生物传感器。我们的研究结果包括小胶质细胞活化对下游神经元细胞死亡的毒性效应测定。图1展示了激活小胶质细胞并检测其分泌的细胞因子是否降低下丘脑神经元存活率的实验流程。暴露于银纳米颗粒（AgNP）后，TNF-α的分泌显著增加（图2）。当下丘脑神经元暴露于经AgNP活化的小胶质细胞的条件培养基时，细胞活力显著降低（图3）。图4概述了AgNPs激活小胶质细胞并导致下丘脑细胞死亡的潜在机制。

讨论

近期研究表明，环境暴露与肥胖及其他神经退行性疾病相关^11,12。然而，以往研究中使用的技术耗时且昂贵。经济成本、生理相关性递送系统的缺乏、大量使用in vivo动物模型所涉及的伦理问题，以及将研究结果转化为有意义的健康建议的困难，是阻碍纳米颗粒诱导神经毒性研究进展的主要挑战之一¹³。因此，使用in vitro小胶质细胞替代生物传感器已成为研究环境暴露下神经毒素影响的重要工具¹⁴。在上述方法中，我们提供了一种直接评估纳米颗粒（如AgNPs）如何激活小胶质细胞并诱导神经毒性的方法。需要注意的是，由于细胞未被固定或裂解，因此可对小胶质细胞或神经元进行包括基因表达分析和Western blot在内的其他下游应用。除了进行TNF-α ELISA检测外，还可利用上清液分析经刺激后小胶质细胞释放的多种细胞因子和分泌因子。

小胶质细胞的活化可由多种不同因素引起，包括环境暴露、感染、缺血和损伤，从而导致其形态学和生理学的改变。持续性的M1型小胶质细胞活化与多种神经退行性疾病相关，例如肥胖、阿尔茨海默.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞/试剂
小鼠小胶质细胞系 （BV2）	Interlab 细胞系集合（意大利热那亚）	ATL03001
成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems 公司	CLU172
杜尔贝科's 改良鹰's 培养基	Invitrogen	10313-039
胎牛血清	PAA Labs	A15-751
青霉素/链霉素/新霉素	Thermo Fisher Scientific	15640-055
胰蛋白酶-EDTA，Thermo	Fisher Scientific	25200056
银纳米颗粒 （20 nm）	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13262
小鼠 TNF-&ELISA Max Delux	Biolegend	430904
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4391
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	S4641
名称	公司<	strong>目录号	评论
设备
96 W 光学底板，黑色聚苯乙烯，经细胞培养处理，带盖，无菌	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置，带 Ultracel-10 膜	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 多模式微孔板	分子器件	M5
Falcon 50 ml 锥形离心机管	Corning， Inc	14-432-22
Falcon 细胞过滤器 70 μm	Corning， Inc	08-771-2
台式离心机 5430	Eppendorf	22620560