Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

摘要

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）被用作替代生物传感器，以确定纳米颗粒如何影响神经毒性。我们描述了一系列实验，旨在测定小胶质细胞对纳米颗粒的反应以及下丘脑神经元暴露于活化小胶质细胞的上清液以确定神经毒性。

摘要

空气污染物中发现的纳米颗粒可以改变神经递质谱，增加神经炎症，并改变大脑功能。因此，此处描述的测定将有助于阐明小胶质细胞在神经炎症和神经退行性疾病中的作用。使用小胶质细胞（大脑的常驻免疫细胞）作为替代生物传感器，为炎症反应如何介导神经元损伤提供了新的见解。在这里，我们利用永生化的小鼠小胶质细胞系，命名为 BV2，并描述了一种使用银纳米颗粒 （AgNPs） 作为标准的纳米颗粒暴露方法。我们描述了如何将小胶质细胞暴露于纳米颗粒，如何从上清液中去除纳米颗粒，以及如何使用活化小胶质细胞的上清液来确定毒性，使用下丘脑细胞存活率作为衡量标准。AgNP 暴露后，使用肿瘤坏死因子 α （TNF-α） 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 验证 BV2 小胶质细胞活化。过滤上清液以去除 AgNP，并使细胞因子和其他分泌因子保留在条件培养基中。然后将下丘脑细胞暴露于来自 AgNP 激活的小胶质细胞的上清液中，并使用基于刃天青的荧光测定法测定神经元的存活率。该技术可用于利用小胶质细胞作为神经炎症的替代生物标志物并确定神经炎症对其他细胞类型的影响。

引言

Environmental pollutions, specifically those of the nanoparticle (NP) range (1 - 20 nm diameter), have been linked to obesity and other neurodegenerative diseases due to the ability to cross the blood brain barrier ^1-3. Elevated exposure to pollution may induce inflammation in the central nervous system including the hypothalamus ¹. One potential mechanism in which this occurs could be through nanoparticle induced activation of microglia (brain immune cells) ⁴. Prior studies have used in vivo models to study the effects of NPs on brain health which are time-consuming, expensive, and do not directly answer the question of how N....

方案

1. Microglial Cell Culture Maintenance

1. Warm cell culture medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin/neomycin (PSN) to 37 °C.
2. Obtain frozen stock of BV2 microglial cells at passage 18 - 25 from storage at -80 °C. Rapidly thaw cells in 37 °C water bath.
3. Gently transfer cells to a 75 cm² vented flask containing 10 ml cell culture media.
4. Incubate flask in 5% CO₂ at 37 °C. Aspirate media after 24 hr and replace with fresh media. Grow cells until approximately 70 - 80% confluency.

结果

We show that microglia function as a surrogate biosensor for brain response to nanoparticles using the protocol above. Our results include measurement of the toxic effects of microglial activation on downstream neuronal cell death. Figure 1 demonstrates a workflow of the protocol to activate microglia and determine if secreted cytokines reduce viability of hypothalamic neurons. TNF-α secretion was significantly increased following AgNP exposure (Figure 2).......

讨论

最近的研究支持环境暴露会导致肥胖和其他神经退行性疾病 ^11,12。然而，先前研究中使用的技术既耗时又昂贵。经济考虑、生理相关的递送系统、广泛使用 体内 动物模型的伦理问题以及难以将研究结果转化为有意义的健康建议是阻碍研究 NP 诱导的神经毒性取得进展的一些主要挑战 ¹³。因此，使用 体外 小胶质细胞替代生物传感器已成为环境暴露于神经毒素的重要工具 ¹⁴。在上述方法中，我们提供了一种直接的方法来确定纳米颗粒（如 AgNPs）如何激活小胶质细胞并诱导神经毒性。应该注意的是，由于细胞没有固定或裂解，其他下游应用，包括基因表达和蛋白质印迹，可以在小胶质细胞或神经元上进行。除了进行 TNF-α ELISA 外，上清液还可用于分析来自受刺激小胶质细胞的一系列细胞因子和分泌因子。

小胶质细胞活化可能是许多不同因素的结果，包括环境暴露、感染、缺血和损伤，导致形态和生理变化。慢性 M1 小胶质细胞激活与肥胖、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病有关 ^5,15-19。此外，小胶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞/试剂
小鼠小胶质细胞系 （BV2）	Interlab 细胞系集合（意大利热那亚）	ATL03001
成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems 公司	CLU172
杜尔贝科's 改良鹰's 培养基	Invitrogen	10313-039
胎牛血清	PAA Labs	A15-751
青霉素/链霉素/新霉素	Thermo Fisher Scientific	15640-055
胰蛋白酶-EDTA，Thermo	Fisher Scientific	25200056
银纳米颗粒 （20 nm）	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13262
小鼠 TNF-&ELISA Max Delux	Biolegend	430904
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4391
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	S4641
名称	公司<	strong>目录号	评论
设备
96 W 光学底板，黑色聚苯乙烯，经细胞培养处理，带盖，无菌	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置，带 Ultracel-10 膜	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 多模式微孔板	分子器件	M5
Falcon 50 ml 锥形离心机管	Corning， Inc	14-432-22
Falcon 细胞过滤器 70 μm	Corning， Inc	08-771-2
台式离心机 5430	Eppendorf	22620560