小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

摘要

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于评估纳米颗粒对神经毒性的潜在影响。本文介绍一系列实验设计，旨在检测小胶质细胞对纳米颗粒的反应，并通过将下丘脑神经元暴露于活化小胶质细胞的上清液中，评估其神经毒性。

摘要

空气污染物中的纳米颗粒可改变神经递质谱型，加剧神经炎症，并影响大脑功能。因此，本文所述检测方法将有助于阐明小胶质细胞在神经炎症及神经退行性疾病中的作用。利用作为大脑常驻免疫细胞的小胶质细胞作为替代性生物传感器，可为炎症反应如何介导神经元损伤提供新的见解。本文采用一种永生化的小鼠小胶质细胞系（BV2），并描述了一种以银纳米颗粒（AgNPs）为标准的纳米颗粒暴露方法。我们阐述了如何使小胶质细胞暴露于纳米颗粒，如何从上清液中去除纳米颗粒，以及如何利用活化小胶质细胞的上清液，通过下丘脑细胞存活率来评估其毒性。在AgNP暴露后，采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）验证BV2小胶质细胞的活化状态。上清液经过滤以去除AgNP，同时保留细胞因子及其他分泌因子于条件培养基中。随后将下丘脑细胞暴露于AgNP活化的小胶质细胞上清液中，并采用基于刃天青的荧光检测法测定神经元的存活率。该技术适用于将小胶质细胞作为神经炎症的替代性生物标志物，并用于评估神经炎症对其他细胞类型的影响。

引言

环境污染物，特别是纳米颗粒（NP）范围（1 - 20 nm 直径）的污染物，由于能够穿过血脑屏障，已被关联到肥胖症及其他神经退行性疾病 ^1-3暴露于高水平污染可能诱发中枢神经系统（包括下丘脑）的炎症反应 ¹一种可能的机制是纳米颗粒激活小胶质细胞（脑内免疫细胞）所致 ⁴. 先前的研究已使用 体内 用于研究纳米颗粒对脑健康影响的模型耗时长、成本高，且无法直接回答纳米颗粒如何影响小胶质细胞的问题。小胶质细胞在中枢神经系统中具有多种功能，包括维持脑微环境稳态，并通过释放分泌因子和细胞因子与周围神经元进行通讯。根据不同的刺激信号，小胶质细胞可被激活为M1型促炎状态或M2型抗炎状态。例如，M1型活化的小胶质细胞会释放肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子，而M2型活化的小胶质细胞则释放白细胞介素-4（IL-4）等抗炎细胞因子。为验证我们的替代模型 体外 用于测定空气污染物神经毒性的生物传感器，我们检测了小胶质细胞对20 nm银纳米颗粒（AgNPs）的反应。本文旨在描述如何实现这一目标 体外 小胶质细胞系可作为替代性生物传感器标志物，用于检测小鼠小胶质细胞对纳米颗粒的反应，以及小胶质细胞活化对下丘脑细胞的影响。该经验证模型的长期应用目标是评估现实环境中污染物对脑健康及神经退行性疾病的影响。本文提供了详细的描述 体外 用于检测小胶质细胞活化及下丘脑细胞存活率的96孔板检测方法，基于小胶质细胞条件培养基处理后的分析

采用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测经银纳米颗粒（AgNP）暴露后的小胶质细胞活化情况。为确定活化的小胶质细胞对下丘脑细胞的影响，使用过滤装置从微胶质细胞上清液（条件培养基）中去除AgNPs。该过滤装置可根据粒径大小保留细胞因子，同时排除AgNPs。简言之，收集经AgNPs处理或未处理的小胶质细胞上清液，加入滤膜装置中，在14,000 × g条件下离心15分钟。随后，我们能够评估小胶质细胞分泌的细胞因子对下丘脑细胞存活率的影响。通过基于刃天青的检测方法测定细胞暴露于含细胞因子的条件培养基后的细胞毒性，具体方法如前所述^5,6。代谢活跃的细胞可将刃天青还原，产生与活细胞数量成正比的荧光信号⁷。

与其它方法（如共培养、Transwell 培养系统或体内实验）相比，该技术具有多项优势。本模型能够直接激活小胶质细胞，并确定其分泌因子是否对神经元具有毒性作用⁸。当前方案采用经直径为 20 nm 的纳米颗粒刺激的永生化 BV2 小胶质细胞，以及永生化的小鼠下丘脑细胞（命名为 mHypo-A1/2）⁹，以评估后续反应。尽管本方案已针对这些特定条件进行了优化，但其方法可进行调整，用于其他小胶质细胞诱导的细胞死亡模型，或与其他细胞类型（包括原代小胶质细胞和神经元）联合使用。

方案

1. 小胶质细胞培养的维持

1. 将细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基；DMEM）置于 37 °C 预热，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素/新霉素（PSN）。
2. 从 -80 °C 保存处取出第 18 至 25 代的冻存 BV2 小胶质细胞，迅速放入 37 °C 水浴中解冻。
3. 轻柔地将细胞转移至含有 10 ml 细胞培养基的 75 cm² 透气培养瓶中。
4. 将培养瓶置于 5% CO₂、37 °C 条件下培养。24 小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至融合度约为 70 - 80%。

2. 细胞计数与接种

1. 在37 °C水浴中预热DMEM和1x胰蛋白酶-EDTA溶液。
2. 吸除细胞培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2–5分钟。
3. 使用细胞刮刀将细胞从培养瓶中刮下，并重悬于5 ml DMEM中。将细胞悬液通过70 µm细胞筛网，转入50 ml离心管，重复吹打三次。
4. 使用血细胞计数板计数细胞，并将8,000个细胞/孔接种至黑色壁透明底培养板中，每孔终体积为200 µl，含10% FBS和1% PSN的DMEM。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。
5. 移除旧的DMEM，更换为200 µl含1% PSN的预温DMEM，以对小胶质细胞进行血清饥饿处理。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。

3. 激活小胶质细胞

1. 在不同的离心管中，将AgNPs（0.01、0.05或0.1 µg/ml）和载体/中性对照（柠檬酸钠，0.04 mM）用含1% PSN的无血清DMEM稀释至工作浓度。
2. 从每个孔中移除100 µl培养基，并加入100 µl相应的处理化合物。
3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。

4. 过滤条件培养基

1. 从每个孔中收集 200 µl 培养基上清液，转移至带有收集管（容量为 1.5 至 2 ml）的滤膜装置中（分子量截留值为 10 kDa）。
2. 在室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。
3. 弃去穿滤液（含颗粒的上清液），将滤膜倒置放入新的收集管中。
4. 在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。
   注意：所得滤过培养基（含有分泌的细胞因子）被浓缩了六倍。
5. 用新鲜的 DMEM（补充 10% FBS 和 1% PSN）将浓缩液体积补至 400 µl，并置于冰上保存。
   注意：为确保滤过培养基中的残留 AgNPs 已被去除，可根据约 390 - 420 nm 处的特征吸收峰建立 AgNP 浓度标准曲线¹⁰。简而言之，用无血清 DMEM 配制未滤过的 AgNPs 梯度样品（0、0.01、0.025、0.05、0.1 和 0.2 µg/ml，如步骤 3.1 所述）以及滤过后的阴性对照（柠檬酸钠，0.04 mM）。将 50 µl 滤过样品和标准品加入黑色壁透明底板中。使用分光光度计在 390 - 410 nm 处测定吸光度，并与 AgNP 浓度曲线进行比较。若滤过样品的吸光度值与阴性对照样品相同，则可认为残留 AgNPs 已被完全去除。
6. 取一半滤过后的培养基，按照商品化试剂盒说明书检测 TNF-α 的分泌水平。

5. 下丘脑细胞培养的维持

1. 将添加了10% FBS和1% PSN的DMEM细胞培养基预热至37 °C。
2. 取保存于-80 °C、第18至25代的下丘脑（mHypo-A1/2）细胞冻存液，在37 °C水浴中快速解冻。
3. 轻柔地将细胞转移至含有10 ml细胞培养基的75 cm²透气培养瓶中。
4. 将培养瓶置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育。24小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至融合度约为70–80%。

6. 确定下丘脑细胞毒性

1. 将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C水浴中预热。
2. 吸除下丘脑细胞的培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液。在37 °C孵育2–5分钟。按照上述第2步所述，使用细胞刮刀从培养瓶中收集细胞。
3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将下丘脑细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于黑色壁透明底板中，每孔终体积为200 µl DMEM，其中添加10% FBS和1% PSN，于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。
4. 使用多通道移液器吸除100 µl旧培养基，加入100 µl过滤后的浓缩条件培养基，使其终浓度为1×。
5. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
6. 加入22 µl刃天青试剂，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育20分钟。
7. 使用多功能酶标仪检测荧光信号（激发波长560 nm，发射波长590 nm），以评估细胞活力。结果以相对荧光单位（RFU）表示。

结果

我们通过上述方案表明，小胶质细胞可作为大脑对纳米颗粒反应的替代性生物传感器。我们的结果包括小胶质细胞活化对下游神经元细胞死亡的毒性效应的测定。图1展示了激活小胶质细胞并确定其分泌的细胞因子是否降低下丘脑神经元存活率的实验流程。暴露于银纳米颗粒（AgNP）后，TNF-α的分泌显著增加（图2）。当下丘脑神经元暴露于AgNP活化的小胶质细胞的条件培养基时，细胞存活率显著降低（图3）。图4概述了AgNP激活小胶质细胞并导致下丘脑细胞死亡的潜在机制。

讨论

近期研究表明，环境暴露与肥胖及其他神经退行性疾病相关^11,12。然而，以往研究中使用的技术耗时且昂贵。经济成本、生理相关性递送系统的局限性、大量使用in vivo动物模型所涉及的伦理问题，以及将研究结果转化为具有实际意义的健康建议的困难，是阻碍纳米颗粒诱导神经毒性研究进展的主要挑战之一¹³。因此，使用in vitro小胶质细胞替代生物传感器已成为研究环境暴露下神经毒素影响的重要工具¹⁴。在上述方法中，我们提供了一种直接评估纳米颗粒（如AgNPs）如何激活小胶质细胞并诱导神经毒性的途径。需要注意的是，由于细胞未经过固定或裂解，因此可对小胶质细胞或神经元进行包括基因表达分析和Western blot在内的其他后续实验。除了进行TNF-α ELISA检测外，还可利用上清液分析经刺激后小胶质细胞释放的多种细胞因子及分泌因子。

小胶质细胞的活化可由多种不同因素引起，包括环境暴露、感染、缺血和损伤，导致其形态学和生理学发生改变。持续性的M1型小胶质细胞活化与多种神经退行性疾病相关，例如肥胖、阿...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞/试剂
小鼠小胶质细胞系 （BV2）	Interlab 细胞系集合（意大利热那亚）	ATL03001
成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems 公司	CLU172
杜尔贝科's 改良鹰's 培养基	Invitrogen	10313-039
胎牛血清	PAA Labs	A15-751
青霉素/链霉素/新霉素	Thermo Fisher Scientific	15640-055
胰蛋白酶-EDTA，Thermo	Fisher Scientific	25200056
银纳米颗粒 （20 nm）	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13262
小鼠 TNF-&ELISA Max Delux	Biolegend	430904
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4391
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	S4641
名称	公司<	strong>目录号	评论
设备
96 W 光学底板，黑色聚苯乙烯，经细胞培养处理，带盖，无菌	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置，带 Ultracel-10 膜	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 多模式微孔板	分子器件	M5
Falcon 50 ml 锥形离心机管	Corning， Inc	14-432-22
Falcon 细胞过滤器 70 μm	Corning， Inc	08-771-2
台式离心机 5430	Eppendorf	22620560