我们介绍了成熟 Drosophila 卵母细胞的收集、制备和成像的实验方案。这些方法可用于观察减数分裂过程中染色体的行为以及纺锤体的组装与功能。
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摘要
摘要
人类卵母细胞中的染色体分离容易出错，导致非整倍体，这是流产和出生缺陷最主要的遗传原因。通过对模式生物卵母细胞中染色体行为的研究，有望揭示人类卵母细胞易发生非整倍体的分子基础。 黑腹果蝇 适用于遗传操作，已有超过一百年的研究历史，在群体和技术创新方面积累了丰富经验。可视化染色体行为和纺锤体组装 黑腹果蝇 卵母细胞具有特殊的挑战，主要由于包围卵母细胞的膜结构对抗体不可渗透。本文描述了减数分裂Ⅰ期纺锤体组装及染色体行为的卵母细胞采集、制备与成像实验方案 果蝇 卵母细胞，可借此对该重要模式生物中的染色体分离过程进行分子机制解析。
引言
减数分裂的研究有时被称为“遗传学中的遗传学”。这是因为在配子形成过程中，染色体的分离实现了染色体遗传和自由组合的基本特性。1916年，卡尔文·布里奇斯（Calvin Bridges）的工作为染色体遗传理论提供了重要证据 黑腹果蝇1。这一研究及其他经典遗传学研究在 果蝇 极大地促进了我们对遗传学的理解。减数分裂染色体的细胞学检查在 果蝇 卵母细胞的免疫荧光检测一直具有挑战性，这主要是因为晚期阶段的 果蝇 卵母细胞在纺锤体组装和染色体定向分离时，由于膜结构的存在，导致抗体无法穿透卵母细胞，从而阻碍了相关研究。
尽管存在这一挑战，Drosophila 卵母细胞仍是研究染色体行为和纺锤体组装的优良模型。这不仅得益于 Drosophila 中强大的遗传学工具，还因为其卵母细胞在减数分裂 I 期的中期发生停滞，此时染色体已定向排列，纺锤体也已完全形成。这使得研究人员能够在此细胞分裂的关键阶段收集并检测大量卵母细胞。此外，一种易于进行遗传操作的简单模式生物，可用于研究卵母细胞中染色体的分离过程，从而为理解人类生殖健康提供重要贡献。染色体数目异常是人类流产和出生缺陷最主要的遗传学原因2。大多数此类错误起源于卵母细胞，并与母亲年龄的增长呈正相关。美国女性的平均生育年龄持续上升，使这一问题成为重要的公共卫生挑战。
我们在此描述用于细胞学检查的方法 果蝇 卵母细胞，包括去除卵母细胞膜的操作演示。这些方法是对Theurkauf和Hawley首次描述的实验方案的改进3，邹 等4，以及 Dernburg 等5我们还包含了基于Gilliland首次描述的方案对不同发育阶段卵母细胞进行富集的方法 等6. 最后，我们添加药物治疗的说明 果蝇 卵母细胞。这些方法共同实现了对卵母细胞染色体分离和纺锤体组装的细胞学研究 果蝇.
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方案
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。果蝇培养和杂交使用温度控制的培养箱维持温度，除非另有说明。
1. 准备工作
- 准备果蝇。
- 富集早中期分裂相卵母细胞的收集方法
- 从健康且年轻的果蝇品系或杂交培养物中清除成虫。在 25 °C 下培养两天。
注意：通常两个健康的培养瓶已足够，但某些交叉培养可能需要更多。 - 两天后，从培养瓶中收集约100至300只雌蝇（此时雌蝇日龄为0至2天），雌蝇无需为处女蝇。在小试管壁一侧添加少量酵母糊，每管放入30只雌蝇和10至15只雄蝇。将加有酵母的试管置于25 °C条件下培养两天。
- 从健康且年轻的果蝇品系或杂交培养物中清除成虫。在 25 °C 下培养两天。
- 中期富集的卵母细胞收集
- 从品系或杂交培养物中收集约100至300只雌蝇。在试管壁一侧加入少量酵母糊，将30只雌蝇（不添加雄蝇）分别放入含酵母的试管中。于25 °C条件下培养3至5天。
- 富集早中期分裂相卵母细胞的收集方法
- 配制溶液。
注意：除非另有说明，溶液可在室温下长期保存。- 制备改良Robb缓冲液（5倍浓度）：500 mM HEPES、500 mM 蔗糖、275 mM 醋酸钠、200 mM 醋酸钾、50 mM 葡萄糖、6 mM 氯化镁和5 mM 氯化钙。使用10 N 氢氧化钠:氢氧化钾（11:8）调节pH至7.4。过滤除菌，勿高压灭菌。于-20 °C保存。根据需要解冻，用于配制每份卵母细胞实验所需的约200 ml 1倍浓度Robb缓冲液。
- 固定液溶液。
- 选项一：制备甲醛/庚烷固定液。配制固定缓冲液：1×磷酸盐缓冲液（PBS）加150 mM蔗糖。使用时，每份卵母细胞样品需新鲜配制，取687.5 µl固定缓冲液与312.5 µl 16%甲醛混合。
警告：在通风橱中使用甲醛溶液时需佩戴手套。废弃物应按照机构规定进行处理。 - 选项二：配制甲醛/卡可基酸盐固定液。配制固定混合液（Fix Mix）：250 mM 蔗糖、100 mM 醋酸钾（pH 7.5）、25 mM 醋酸钠（pH 7.0）和 25 mM EGTA（pH 8.0）。使用时每份卵母细胞样品新鲜配制，加入 400 µl 固定混合液、100 µl 二甲胂酸钾（1 M，pH 7.2）和 500 µl 16% 甲醛。
警告：二甲基亚砷酸钾含有砷。
- 选项一：制备甲醛/庚烷固定液。配制固定缓冲液：1×磷酸盐缓冲液（PBS）加150 mM蔗糖。使用时，每份卵母细胞样品需新鲜配制，取687.5 µl固定缓冲液与312.5 µl 16%甲醛混合。
- 配制 PBS/Triton X-100：将 1x PBS 与 1% 或 0.05% Triton X-100 混合。4 °C 保存。
- 制备PBS-Tween 20-牛血清白蛋白（BSA）溶液（PTB）：1× PBS，0.5% BSA（w/v），0.1% Tween-20。可在4 °C保存一周。
- 荧光 原位 杂交（FISH）溶液
- 配制20倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠（SSC）溶液：3 M 氯化钠和0.3 M 柠檬酸钠。
- 制备2倍浓度SSC-吐温-20（SSCT）：在2× SSC中加入0.1%吐温-20。每次卵母细胞制备前新鲜配制，约20 ml。
- 配制甲酰胺溶液：2x SSC、0.1% Tween-20 加甲酰胺。每份卵母细胞样品需新鲜配制 1 ml 20% 甲酰胺、0.5 ml 40% 甲酰胺和 2 ml 50% 甲酰胺。
注意：在通风橱中使用甲酰胺溶液时需佩戴手套。废弃物应按照机构规定进行处理。 - 制备杂交液：2x SSC、50% 甲酰胺和 10% 硫酸葡聚糖（w/v）。4 °C 保存。
- FISH 探针
- 订购寡核苷酸（参见 表1 用于序列的HPLC纯化及所需的5'荧光修饰（例如，Cy3 或 Cy5）。用 TE 缓冲液重悬至 50 ng/µl。
注意：务必始终避免寡核苷酸暴露于光照下。
- 订购寡核苷酸（参见 表1 用于序列的HPLC纯化及所需的5'荧光修饰（例如，Cy3 或 Cy5）。用 TE 缓冲液重悬至 50 ng/µl。
2. 晚期阶段的收集 果蝇 卵母细胞
- 作为 果蝇 细胞膜完整的卵母细胞会黏附于塑料和玻璃表面，因此在每次卵母细胞制备前，需用PTB预包被一个5 ml离心管和一支巴斯德吸管的内表面。
- 用二氧化碳麻醉约100至300只酵母喂养的果蝇，加入含有约100 ml 1x Robb's缓冲液的匀浆器中。脉冲搅拌三次（每次约1秒）。将卵母细胞保留在Robb's缓冲液中 <20 分钟，以避免激活。
注意：也可通过手工解剖雌性个体获取卵母细胞。该方法的优势在于所需雌性个体数量较少。然而，需注意将二氧化碳暴露时间限制在数分钟内，以避免因缺氧引起的假象7. - 通过大孔径滤网（约 1,500 µm）过滤至 250 ml 烧杯中，以去除大块组织部分。若滤网上仍残留较多完整腹部组织，需使用额外 Robb's 缓冲液重新研磨样品，并再次过滤。静置约 2 分钟，然后吸除上层液体，尽可能去除大块组织部分。
- 通过小孔径滤网（约 300 µm）过滤至 250 ml 烧杯中。用额外的 Robb's 液和包被的巴斯德吸管将残留的卵母细胞从第一个烧杯中冲洗出。静置约 3 分钟，卵母细胞将沉淀下来。吸除上清液，仅保留约 10 ml。
- 将10 ml液体尽可能倒入已包被的5 ml离心管中。静置后弃去上清，重复处理剩余液体。用额外的Robb's溶液和包被的巴斯德吸管将烧杯中剩余的卵母细胞冲洗出来。在5 ml离心管中静置约3–5分钟。
3. 药物处理（可选）
- 为每份卵母细胞样品准备另一只5 ml离心管，并用PTB包被。向每份卵母细胞样品的1 ml Robb's溶液中加入相应的溶剂（对照）或药物（表2）。
- 将卵母细胞分装至第二只已包被的5 ml离心管中。静置后吸除液体，向其中一管加入1 ml Robb's溶液加溶剂，向另一管加入1 ml Robb's溶液加药物。根据药物处理要求孵育适当时间（表2），然后静置。
4. 固定
- 吸去所有液体，并立即加入 1 ml 固定液。
- 方案 #1：甲醛/庚烷固定法（固定缓冲液加 5% 甲醛）。
- 在振荡器上固定 2.5 分钟。加入 1 ml 庚烷，涡旋振荡 1 分钟。静置约 1 分钟。
- 吸去所有液体，然后加入 1 ml 1× PBS。涡旋振荡 30 秒。静置约 1 分钟。
- 吸去所有液体，然后用 1× PBS 充满离心管。
注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。
- 方案 #2：甲醛/二甲胂酸盐固定法（固定混合液加 8% 甲醛和 100 mM 二甲胂酸盐）。
- 在振荡器上固定 6 分钟。静置 2 分钟。吸去液体，然后用 1× PBS 充满离心管。
注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。
- 在振荡器上固定 6 分钟。静置 2 分钟。吸去液体，然后用 1× PBS 充满离心管。
5. 去除膜结构（"滚动"）
- 使用包被的巴斯德吸管，将约 500 至 1,000 个卵母细胞加入到玻璃载玻片的磨砂（喷砂）区域。用镊子去除所有身体组织和其他多余物质。切勿让卵母细胞干燥；必要时添加 1× PBS。
- 将盖玻片置于卵母细胞上方，轻轻"滚动"卵母细胞，直至所有膜结构被去除（用盖玻片边缘在卵母细胞上拖动效果最佳）。定期在显微镜下检查操作进展，必要时补充更多 1× PBS。注意力度，过大的压力会破坏卵母细胞。
注意：仅进行免疫荧光染色时，继续执行步骤 6；如需进行 FISH（无论是否联合免疫荧光染色），则继续执行步骤 7。
6. 抗体染色 黑腹果蝇 卵母细胞
- 提取与封闭
- 将卷曲的卵母细胞冲洗至含有约 15 ml PBS/1% Triton X-100 的 15 ml 圆锥形离心管中。在此溶液中轻轻旋转孵育卵母细胞，时间不少于 1.5 小时且不超过 2 小时。此步骤有助于抗体渗透。
- 让卵母细胞静置约 2 分钟。吸除液体并尽可能去除细胞膜碎片，然后加入 PBS/0.05% Triton X-100。
注意：细胞膜碎片的沉降速度比卷曲的卵母细胞更慢。 - 让卵母细胞静置约 2 分钟，然后吸除液体，仅保留约 1 ml。将卵母细胞转移至带刻度的 1.5 ml 离心管中，并吸除剩余液体。加入 1 ml PTB 进行封闭，在旋转仪上孵育 1 小时。
- 抗体染色
- 针对胚胎进行二抗的预吸附处理。
注意：此步骤可消除二抗与果蝇（Drosophila）蛋白非特异性结合导致的背景染色。- 按照常规方法收集并固定果蝇（Drosophila）胚胎（约 25 µl）8。在 -20 °C 条件下保存于甲醇中。
- 去除胚胎中的甲醇，加入 800 µl 甲醇和 200 µl 1x PBS，旋转孵育 15 分钟。吸除 500 µl 上清液，并替换为 500 µl 1x PBS。再次旋转孵育 15 分钟。重复该洗涤步骤两次（总洗涤时间约为 1 小时），最后将胚胎置于 PTB 中。
注意：胚胎可立即使用，也可在室温下置于旋转仪上保存数小时。 - 去除液体，按每份卵母细胞样品加入 200 µl PTB，并加入适当稀释倍数的荧光标记二抗（注意最终体积为 300 µl；参见步骤 7.4）。在 4 °C 条件下旋转孵育过夜（推荐）或在室温下孵育 3 至 4 小时。
注意：预吸附后的抗体将在步骤 6.2.4 中使用。
注意：一旦加入荧光标记抗体，应尽可能将样品避光保存。
- 去除卵母细胞中的液体，加入 PTB 至 300 µl，并加入适当稀释倍数的一抗。在 4 °C 条件下旋转孵育过夜（推荐）或在室温下孵育 3 至 4 小时。
- 用 1 ml PTB 对卵母细胞洗涤 4 次，每次 15 分钟。
- 去除卵母细胞中的液体，加入 200 µl 胚胎上清液（含预吸附的二抗），然后补加 PTB 至总体积 300 µl。在室温下旋转孵育 3 至 4 小时（推荐）或在 4 °C 条件下过夜孵育。
- 用 1 ml PTB 洗涤卵母细胞一次，每次 15 分钟，吸除液体。然后加入 0.5 µl Hoechst 33342 和 500 µl PTB，在旋转仪上孵育 7 分钟。
- 用 1 ml PTB 洗涤卵母细胞两次，每次 15 分钟。
注意：卵母细胞可立即封片观察，或在 4 °C 条件下保存于 PTB 中，待成像时再取出使用。
- 针对胚胎进行二抗的预吸附处理。
7. 荧光原位杂交（从上述第5步继续）
- 将卷曲的卵母细胞冲洗至含有约15 ml 2x SSCT的15 ml锥形管中。静置约2分钟使卵母细胞沉淀。除去上清液至仅剩约0.5 ml，并尽可能去除所有膜结构。
注意：膜的沉降速度比卷曲的卵母细胞慢。 - 将卵母细胞转移至0.5 ml离心管中，去除残留液体。依次加入并移除500 µl的20%、40%和50%甲酰胺溶液，每种溶液中均旋转孵育10分钟。
注意：甲酰胺浓度越高，卵母细胞沉降速度越慢。 - 吸除液体，加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1至5小时。
注意：延长孵育时间可提高探针渗透效果。 - 移除液体，残留不超过约100 µl的卵母细胞，加入36 µl杂交溶液、2 µl探针（50 ng/µl）和2 µl水，或2 µl的2nd 探针（表1).
- 91 °C 孵育 3 分钟（仅 FISH）或 80 °C 孵育 20 分钟（FISH 结合免疫荧光），随后在 37 °C 水浴中过夜孵育。
注意：这些步骤可在热循环仪中进行。 - 不要移除液体。加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1小时。
- 静置，弃去上清液，加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1小时。
- 静置，弃去上清液，加入500 µl 20%甲酰胺溶液，室温下振荡孵育10分钟。
- 用500 µl 2x SSCT快速洗涤三次（静置，弃上清，加入液体，颠倒混匀数次，重复操作）。静置后弃去液体，加入500 µl PTB，4小时内进行振荡孵育。
8. FISH 后的抗体染色
- 移除卵母细胞中的液体，加入PTB补足至300 µl，再加入10 µl与FITC偶联的抗α-微管蛋白抗体。也可根据上述方案使用其他抗体。室温下振荡孵育过夜。
- 用500 µl PTB洗涤卵母细胞一次，每次15分钟，移除液体后，加入0.5 µl Hoechst 33342和500 µl PTB，振荡孵育7分钟。
- 用500 µl PTB洗涤卵母细胞两次，每次15分钟。
注意：卵母细胞可立即封片观察，或暂时保存在4 °C的PTB中，待成像时取出。一旦加入荧光抗体，应尽可能将卵母细胞避光保存。
| 重复名称 | 染色体 | 寡核苷酸序列* |
| 359 | X | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodeca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2+3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4(+Y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| *359序列来自Eric Joyce的个人交流，其他序列来自Sullivan 等8 | ||
表1：用于黑腹果蝇着丝粒重复序列的FISH探针。
| 药物 | 溶剂 | 储存浓度 | 终浓度 | 处理时间 | 效应 |
| colchicine | ethanol | 125 mM | 150 µM | 10 分钟或 30 分钟 | 破坏动粒外微管（10 分钟）9 或全部微管（30 分钟） |
| paclitaxel | DMSO | 10 mM | 10 µM | 10 分钟 | 稳定微管 |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 mM | 25 µM | 20 分钟 | 抑制 Aurora B 激酶10 |
表2：药物处理。
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结果
我们在此所述的方法将能够收集到晚期阶段的 果蝇 代表减数分裂三个阶段的卵母细胞（图1）。减数分裂前期的卵母细胞可通过核膜的存在加以区分，核膜表现为核周体周围区域无微管蛋白信号。图1A）。前中期是核膜破裂后纺锤体组装的时期。在前中期，核质体呈现独特的形态，通常变得细长，并具有4个th 除主核仁染色体团外的染色体（图1B）。前中期以中期结束，此时 果蝇 卵母细胞在自然状态下会停滞直至排卵。在中期卵母细胞中，核质收缩成圆形图1C).
我们在此介绍调控产卵速度的方法 果蝇 雌性个体以富集处于早中期或中期的卵母细胞。来自早中期富集样本的卵母细胞常显示出拉长的核体结构（图2A）而富含中期的细胞群体或来自未交配 果蝇...
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讨论
分期 果蝇 卵母细胞
尽管在前中期卵母细胞中经常观察到拉长的核体，但使用核体形状来区分前中期和中期卵母细胞可能存在困难。在前中期过程中，核体最初呈圆形，随后拉长，接着在卵母细胞接近中期阻滞时又回缩为圆形。这意味着许多前中期卵母细胞并不具有拉长的核体。此外，如果检测的是突变体或药物处理的卵母细胞，核体形状可能受到影响，从而无法使用该方法对卵母细胞进行分期。由于目前尚无其他可用于区分这两个阶段的标记物，我们采用上述方法调控雌性Drosophila产卵速度，以富集处于前中期或中期的卵母细胞。其原理在于：如果卵母细胞在前中期停留的时间相对固定，而在中期则进入不确定时长的阻滞状态，直至产卵为止，那么较快的产卵速度将导致前中期卵母细胞的比例更高，而较慢的产卵速度则有利于中期卵母细胞的富集。正如Gilliland et al.6，所述，收集处女雌蝇或在短于2天的时间段内收集雌蝇所需付出的额外努力，并不能显著提高前中期卵母细胞的数量。此外，使用本方案制备的卵母细胞无法利用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Christian Lehner 提供 CENP-C 抗体，以及 Eric Joyce 在 FISH 实验方面的建议。McKim 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号 GM101955）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 锥形管 | Various | ||
| 16% 甲醛 | Ted Pella, Inc. | 18505 | 危险品；开启后一个月内丢弃 |
| 250 ml 烧杯 | Various | ||
| 5 ml 管 | Various | ||
| 活性干酵母 | Various | 与水混合制成类似花生酱稠度的糊状物 | |
| 与 FITC 偶联的抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | F2168 | 克隆株 DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | 危险品 |
| 搅拌器 | Various | ||
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A4161 | |
| 氯化钙 | Various | ||
| 秋水仙素 | Sigma | C-9754 | 危险品 |
| 盖玻片 | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| 硫酸葡聚糖 | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| 乙醇 | Various | ||
| 镊子 | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont 高精度 5 号镊 |
| 甲酰胺 | Sigma | 47670-250ML-F | |
| 载玻片 | VWR | 48312-003 | |
| 葡萄糖 | Various | ||
| 带刻度的 1.5 ml 管 | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | 可从多家供应商获得 |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| 氯化镁 | Various | ||
| 甲醇 | Various | ||
| 大孔筛网（~1,500 µm） | VWR | AA43657-NK | 多种规格及其他供应商，12 或 14 目 |
| 小孔筛网（~300 µm） | Spectrum labs | 146 424 | 多种规格，例如，146 422 或 146 486 |
| 旋转混合仪 | Various | ||
| 巴斯德吸管 | Various | ||
| 乙酸钾 | Various | ||
| 二甲胂酸 | Sigma | C0125 | 危险品；也可用二甲胂酸钠替代 |
| 氢氧化钾 | Various | ||
| 乙酸钠 | Various | ||
| 氯化钠 | Various | ||
| 柠檬酸钠 | Various | ||
| 氢氧化钠 | Various | ||
| 蔗糖 | Various | ||
| 紫杉醇（paclitaxel） | Sigma | T1912 | 危险品 |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| 涡旋振荡器 | Various |
参考文献
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
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