研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

摘要

已知脂质在细胞功能中发挥重要作用。本文介绍一种通过高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）分析中性粒细胞脂质组成的方法，重点检测胆固醇水平，以更深入理解中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制。

摘要

通过高效薄层色谱法（HPTLC）进行脂质分析是一种相对简单且成本较低的方法，可用于分析多种脂质。已有研究报道，脂质（例如在宿主-病原体相互作用或宿主细胞入侵过程中）在细胞过程中发挥着关键作用。本文介绍了一种利用HPTLC分析原代血液来源中性粒细胞中脂质组成（重点关注胆固醇水平）的方法，并与高效液相色谱法（HPLC）进行了比较。本研究旨在探讨脂质/胆固醇变化在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成过程中的作用。NET的释放是一种宿主防御机制，可阻止病原体在宿主体内扩散。因此，使用甲基-β-环糊精（MβCD）处理血液来源的人中性粒细胞，以诱导细胞内脂质改变。通过HPTLC和HPLC分析表明，MβCD处理可导致细胞脂质发生改变，并显著降低细胞内胆固醇含量。同时，免疫荧光显微镜结果显示，MβCD处理中性粒细胞可诱导NET的形成。综上所述，本文提供了一种详细的研究中性粒细胞脂质改变及NET形成的实验方法。

引言

脂质已被证实在线粒体稳态、细胞死亡、宿主-病原体相互作用以及细胞因子释放中发挥重要作用¹随着时间的推移，人们对脂质在宿主-病原体相互作用或炎症中作用的兴趣和认识不断增加，多项研究证实了某些脂质，尤其是类固醇胆固醇，在细胞应答中的核心作用。他汀类药物可通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）来阻断胆固醇的生物合成，其药理学治疗可通过降低血清中白细胞介素6和C反应蛋白水平而发挥抗炎作用。²富含胆固醇和糖鞘脂的结构可被多种病原体（如细菌和病毒）用作入侵宿主的门户^3,4,5,6. 鞘脂类（例如， 鞘磷脂）已被证明可被病原体利用以增强其致病性⁷在巨噬细胞中，分枝杆菌利用富含胆固醇的膜区进入细胞；胆固醇的耗竭可抑制分枝杆菌的摄取⁸此外，用病原体感染巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌， 一种引起土拉菌病（又称兔热病）的人畜共患致病因子⁹，导致了一种感染，而当细胞膜中的胆固醇被耗竭后，该感染即被消除

方案

本方案中采集外周血的步骤已获得当地人类研究伦理委员会的批准。所有人类受试者均提供了书面知情同意书。

1. 通过密度梯度离心法分离人血液来源的中性粒细胞

1. 分离人血液来源的中性粒细胞
   1. 在火焰附近将约 20 mL 血液小心地铺在 20 mL 泛影葡胺/右旋糖酐溶液上，避免混合。
   2. 以 470 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。
   3. 移除单个核细胞层和淡黄色的血浆层。将多形核细胞（PMN）层（第二层，细胞聚集层；图 1 和 图 2）转移至新的 50 mL 离心管中，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）补至 50 mL。
   4. 以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。
   5. 弃去上清液，将沉淀用 5 mL 无菌水重悬 5 秒，以裂解红细胞。
   6. 立即用 1× PBS 补至 50 mL，并以 470 × g 离心 10 分钟。
   7. 弃去上清液。沉淀应呈白色。若仍呈红色，重复步骤 1.1.5 和 1.1.6。
   8. 将沉淀用 1,000 µL RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基重悬。在光学显微镜下使用台盼蓝染色法通过血细胞计数板计数细胞数量。
   9. 用....

结果

通过密度梯度离心法分离人血液来源的中性粒细胞（图2）。为研究脂质改变对中性粒细胞的影响，使用10 mM MβCD处理细胞，以耗竭细胞内的胆固醇。随后，按照Brogden 等²³所述方法，采用Bligh和Dyer法从样品中提取脂质（图1，左图）。制备的脂质样品被点样至硅胶HPTLC板上，并采用三溶剂体系进行展开，该体系已优化用于分离和可视化多种脂质，包括胆固醇、胆固醇酯、鞘磷脂、磷脂、三酰甘油、游离脂肪酸、单酰甘油、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱（图3A）。该方法无法检测胆固醇的氧化衍生物（氧固醇）。另采用HPLC对胆固醇进行定量分析（图3B）。在检测胆固醇时，HPLC的回归值显著优于HPTLC（图4A对比图4B）。为可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），细胞经上述刺激物刺激后固定，并使用D.......

讨论

本文所述方法可用于通过高效薄层色谱（HPTLC）或高效液相色谱（HPLC）分析特定脂质（如胆固醇），并研究药理性脂质改变对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的影响（参见 Neumann et al.¹⁵）。

HPTLC 是一种相对经济且简单的方法，可用于分析大量样本中的多种脂质。该方法已广泛应用于多个研究领域，包括抗生素定量²⁵、溶酶体贮积病中的脂质贮存²⁶，以及上皮细胞中胆固醇和胆固醇葡萄糖苷水平的测定²⁷。本文所述方法经过修改和优化，用于从纯化的中性粒细胞群体中分离脂质；然而，经过轻微调整后，该方法也可用于组织样本中的脂质提取（参见 Brogden et al.²³）。利用该方法，可对脂质进行有效分离、鉴定，并以已知标准品为参照进行半定量分析。该方法中的一个关键步骤是使用指定名称的缓冲液，因为使用其他任何.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
中性粒细胞分离、NET染色与定量
Alexa Flour 633 山羊抗兔 IgG	Invitrogen	A-21070
抗MPOα抗体	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer 改良计数板	Celeromics	MF-0640010
共聚焦显微镜 TCS SP5 AOBS 带串联扫描仪	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493-1L	用水稀释1:10以获得1x工作液
Dy Light 488标记的高度交叉吸附抗体	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/组蛋白1抗体	Millipore	MAB3864
ImageJ	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
光学显微镜	VWR	630-1554
甲基-β-环糊精	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	溶于水，加热至65 °C，并加入1 N NaOH至溶液澄清
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	储存液浓度为16 µM，溶于1x PBS中
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭试剂	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
含CaCl和Mg的HBSS	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
台盼蓝	Invitrogen	15250-061	0.4%溶液
水	Carl Roth	3255.1	无内毒素
名称	公司	目录编号	备注
脂质分离与分析
1-丙醇	Sigma-Aldrich	33538
10 µL 注射器	Hamilton	701 NR 10 µl
乙醚	Sigma-Aldrich	346136
乙酸乙酯	Carl Roth	7336.2
Canullla 26 G	Braun	4657683
五水合硫酸铜(II)	Merck	1027805000
氯仿	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS 软件	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 封端柱 100-4.6 mm	Merck	152022
高效液相色谱仪 Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	参数取决于具体HPLC仪器
HPLC紫外检测器	Hitachi	5410
HPLC色谱柱温箱	Hitachi	5310
HPLC自动进样器	Hitachi	5260
HPLC泵	Hitachi	5160
甲醇	Carl Roth	7342.1
正己烷	Carl Roth	7339.1
磷酸	Sigma-Aldrich	30417
氯化钾	Merck	49,361,000
研钵	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC硅胶60板	Merck	105553
Vacufuge plus 基础装置	Eppendorf	22820001
Corning Costar 细胞培养48孔板，平底	Sigma	CLS3548
盖玻片	Thermo Fisher Scientific	1198882
载玻片	Carl Roth	1879
BD 结核菌素注射器 1 mL	BD Bioscience	309659