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方法文章

研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

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DOI：

10.3791/54667

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2017年3月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Chemistry, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Fish Disease Research Unit, University of Veterinary Medicine, 3Department of Clinical Sciences, Biomedical Center, Lund University, 4Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

已知脂质在细胞功能中发挥重要作用。本文介绍一种通过高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）分析中性粒细胞脂质组成的方法，重点检测胆固醇水平，以更深入理解中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制。

摘要

通过高效薄层色谱法（HPTLC）进行脂质分析是一种相对简单且成本较低的方法，可用于分析多种脂质。已有研究报道，脂质（例如在宿主-病原体相互作用或宿主细胞入侵过程中）在细胞过程中发挥着关键作用。本文介绍了一种利用HPTLC分析原代血液来源中性粒细胞中脂质组成（重点关注胆固醇水平）的方法，并与高效液相色谱法（HPLC）进行了比较。本研究旨在探讨脂质/胆固醇变化在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成过程中的作用。NET的释放是一种宿主防御机制，可阻止病原体在宿主体内扩散。因此，使用甲基-β-环糊精（MβCD）处理血液来源的人中性粒细胞，以诱导细胞内脂质改变。通过HPTLC和HPLC分析表明，MβCD处理可导致细胞脂质发生改变，并显著降低细胞内胆固醇含量。同时，免疫荧光显微镜结果显示，MβCD处理中性粒细胞可诱导NET的形成。综上所述，本文提供了一种详细的研究中性粒细胞脂质改变及NET形成的实验方法。

引言

脂质已被证实在线粒体稳态、细胞死亡、宿主-病原体相互作用以及细胞因子释放中发挥重要作用1随着时间的推移，人们对脂质在宿主-病原体相互作用或炎症中作用的兴趣和认识不断增加，多项研究证实了某些脂质，尤其是类固醇胆固醇，在细胞应答中的核心作用。他汀类药物可通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）来阻断胆固醇的生物合成，其药理学治疗可通过降低血清中白细胞介素6和C反应蛋白水平而发挥抗炎作用。2富含胆固醇和糖鞘脂的结构可被多种病原体（如细菌和病毒）用作入侵宿主的门户3,4,5,6. 鞘脂类（例如， 鞘磷脂）已被证明可被病原体利用以增强其致病性7在巨噬细胞中，分枝杆菌利用富含胆固醇的膜区进入细胞；胆固醇的耗竭可抑制分枝杆菌的摄取8此外，用病原体感染巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌， 一种引起土拉菌病（又称兔热病）的人畜共患致病因子9，导致了一种感染，而当细胞膜中的胆固醇被耗竭后，该感染即被消除10同样，宿主细胞被入侵的过程由 大肠杆菌 通过富含脂质的结构的途径被证明依赖于胆固醇4此外， 鼠伤寒沙门氏菌 上皮细胞感染实验表明，胆固醇对病原体进入细胞至关重要11. 胆固醇耗竭抑制了沙门氏菌的摄取11此外，Gilk最近的一项研究 等. 证明了胆固醇在摄取过程中起着重要作用 Coxiella burnetii12此外，Tuong 等发现25-羟基胆固醇在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞的吞噬作用中发挥关键作用13当使用药物处理巨噬细胞以耗竭胆固醇时，吞噬作用减弱14因此，胆固醇及其他脂质在感染与炎症过程中似乎发挥着重要作用，因为其含量的降低可减少多种病原体入侵的风险。10,11,12.

最近，我们已能够证明脂质的改变，特别是细胞内胆固醇的耗竭，可诱导人外周血中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）15。自2004年发现NETs以来，研究已表明其在捕获细菌以及阻止感染扩散方面发挥着关键作用16,17。NETs由DNA骨架与组蛋白、蛋白酶及抗菌肽共同构成16。中性粒细胞释放NETs可由入侵的病原体18,19或化学物质（如佛波酯-豆蔻酸-乙酸盐（phorbol-myristate-acetate, PMA）或他汀类药物）所诱导16,20。然而，该过程的具体细胞机制，尤其是脂质在此过程中的作用，目前仍不完全清楚。对脂质的分析有助于更深入理解多种细胞过程及相互作用的机制，例如NETs的释放。胆固醇和鞘磷脂是细胞膜及脂质微区的重要组成成分，它们可增强膜的稳定性，并促进参与蛋白质转运和信号转导事件的蛋白质聚集21。为了研究特定脂质的机制性作用，可使用两亲性药理学试剂，例如环状寡糖甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD），在体外（in vitro）改变细胞的脂质组成并降低胆固醇水平15。本文介绍了一种利用高效薄层色谱法（HPTLC）分析中性粒细胞在MβCD处理后脂质组成变化的方法。同时采用高效液相色谱法（HPLC）检测中性粒细胞群体中胆固醇水平的变化。此外，我们还描述了一种通过免疫荧光显微镜观察人外周血中性粒细胞在MβCD刺激下形成NETs的方法。

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方案

本方案中采集外周血的步骤已获得当地人类研究伦理委员会的批准。所有人类受试者均提供了书面知情同意书。

1. 通过密度梯度离心法分离人血液来源的中性粒细胞

  1. 分离人血液来源的中性粒细胞
    1. 在火焰附近将约 20 mL 血液小心地铺在 20 mL 泛影葡胺/右旋糖酐溶液上，避免混合。
    2. 以 470 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。
    3. 移除单个核细胞层和淡黄色的血浆层。将多形核细胞（PMN）层（第二层，细胞聚集层；图 1 和 图 2）转移至新的 50 mL 离心管中，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）补至 50 mL。
    4. 以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。
    5. 弃去上清液，将沉淀用 5 mL 无菌水重悬 5 秒，以裂解红细胞。
    6. 立即用 1× PBS 补至 50 mL，并以 470 × g 离心 10 分钟。
    7. 弃去上清液。沉淀应呈白色。若仍呈红色，重复步骤 1.1.5 和 1.1.6。
    8. 将沉淀用 1,000 µL RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基重悬。在光学显微镜下使用台盼蓝染色法通过血细胞计数板计数细胞数量。
    9. 用 RPMI 培养基配制浓度为 2 × 106/mL 的细胞悬液。从 20 mL 血液中可大约收获 2.5 × 107 个中性粒细胞。
  2. 用于脂质分析的中性粒细胞药物处理
    1. 取步骤 1.1.9 中的 5 × 107 个细胞。在 1.5 mL 反应管中，用纯 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）调整细胞数量，可选择加入或不加入 10 mM MβCD 或 25 nM PMA，总体积为 300 µL。
    2. 将反应管中的样品在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。
    3. 以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。
    4. 弃去上清液，将细胞沉淀用 300 µL HBSS 重悬。
    5. 以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。
    6. 将细胞沉淀用 1 mL 氯仿/甲醇（1:1）重悬，使用 26 号针头连接 1 mL 注射器反复抽吸 10 次进行匀浆，随后将样品于 -20 °C 保存。
  3. 用于免疫荧光定量 NET 的中性粒细胞药物处理
    1. 准备包被多聚-L-赖氨酸的 48 孔板，内含玻璃盖玻片。
      1. 在每个孔中放入一片 8 mm 玻璃盖玻片，加入 55 µL 无菌 0.01% 多聚-L-赖氨酸，室温（RT）孵育约 20 分钟。
    2. 用 200 µL 1× PBS 洗涤两次。每孔加入 200 µL 1× PBS，将板置于冰箱中保存，直至使用。
    3. 将步骤 1.1.9 得到的细胞悬液（2 × 105/100 µL）小心地在每孔盖玻片中心加入 100 µL。
    4. 每孔加入 100 µL 终浓度为 10 mM MβCD 或终浓度为 25 nM PMA 的溶液。
    5. 以 370 × g 离心 5 分钟，使用刹车。
    6. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。
    7. 以 370 × g 离心 5 分钟，使用刹车。
    8. 用 155 µL 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，用保鲜膜包裹，于 4 °C 过夜或室温固定 10 分钟。
      注：有关 MβCD 诱导 NET 形成的数据，请参见 Neumann et al.15。

2. 人源性中性粒细胞的脂质分离与分析

  1. 根据布莱格和戴尔法从人外周血来源的中性粒细胞中分离脂质22 和 Brogden 等23
    1. 取1.2.6步骤中的中性粒细胞，置于冰上。
    2. 在冰上，将中性粒细胞（存在于甲醇和氯仿溶液中）用移液器转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的15 mL螺口玻璃管中，并通过振荡1分钟进行匀浆。使用玻璃管可防止脂质结合到塑料表面；使用PTFE瓶盖可避免橡胶/塑料带来的污染。
    3. 加入2 mL甲醇，1分钟后加入1 mL氯仿。再次振荡1分钟。
    4. 将玻璃管在室温下以50 rpm转速旋转30分钟。
    5. 在7 °C、1,952 × g条件下离心10分钟，使蛋白质组分沉淀。
    6. 小心地将上清液倾入一个新的15 mL玻璃螺口管中，留下含有蛋白质的沉淀。将沉淀于-20 °C保存，用于后续定量分析。
    7. 加入1 mL氯仿，静置1分钟，加入1 mL双蒸水，将含有样品的玻璃螺口管颠倒混匀30秒。
    8. 在 7 °C、1,952 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上层相，直至但不包括浑浊层。
    9. 如有需要，可重复步骤 2.1.8 进行额外的纯化。
    10. 在真空浓缩仪中于60 °C下干燥样品，并于-20 °C保存备用。
  2. 高效薄层色谱法（HPTLC）半定量分析多种脂质（包括胆固醇、磷脂和鞘磷脂）的含量
    1. 配制以下四种电泳运行缓冲液和染色液。
      1. 溶液1：混合乙酸乙酯（26.6%）、1-丙醇（26.6%）、氯仿（26.6%）、甲醇（26.6%）和氯化钾（9.6%）。通过将0.25 g KCl溶解于100 mL HPLC级水中制备KCl溶液。
      2. 溶液2：混合正己烷（73%）、乙醚（23%）和柠檬酸（2%）。
      3. 溶液3：100% 正己烷。
      4. 将蒸馏水（90 mL）与7.5 g硫酸铜混合，配制染色液，然后加入10 mL磷酸。
    2. 在每个独立的玻璃室中分别加入每种溶液至5 mm高度。在每个室中添加任意类型的滤纸以提高运行速度。
    3. 将一块20 × 10 cm的HPTLC硅胶60玻璃板在第一种展开剂中预展开，直至展开剂前沿到达板的顶端。随后在110 °C下干燥10分钟。
      注意：这些平板可用铝箔包裹后保存以备将来使用，使用前在110 °C下干燥10分钟。
    4. 将步骤2.1.10中获得的脂质沉淀物溶于200 µL氯仿/甲醇（1:1）溶液中，于37 °C孵育15分钟以充分溶解。
    5. 使用直尺和软铅笔标记所需数量的样品加样位置，并至少标记一个标准品位置。分别在约4 cm和6 cm处标记第一种和第二种电泳溶液的电泳距离。
    6. 为上样，每次加载新样品前，先用氯仿/甲醇（1:1）冲洗10 µL注射器3次。每份样品取10 µL逐滴上样，尽量将样品集中于尽可能小的区域。每个样品至少需设置两个重复。
    7. 将凝胶板垂直放入第一个含有运行溶液1的电泳槽（步骤2.2.1.1）中，确保凝胶板与玻璃槽壁平行，以获得均匀的迁移速度。
    8. 当溶剂前沿到达第一个标记线时，取出薄层板，干燥后放入第二种溶液中。对第二和第三种展开溶液重复类似步骤；将薄层板置于溶液中，直至溶剂前沿到达薄层板顶端，然后取出并在室温下干燥1分钟。
    9. 将平板放入硫酸铜溶液中放置7秒。取出平板，彻底干燥后，在170 °C下烘烤7分钟。待平板冷却。
    10. 使用薄层色谱和凝胶分析软件以及图像处理软件，按照 Brogden 之前所述的方法进行扫描和分析 等23.
  3. 高效液相色谱法（HPLC）定量胆固醇含量
    1. 将一根100 × 4.6 mm色谱柱连接至5 µm/4.6 mm保护柱芯，并加热至32 °C。以甲醇为流动相，流速为1 mL/min，压力为65 bar，采用在202 nm处检测的紫外检测器定量各样品中的胆固醇含量。
    2. 在分析样品前，彻底清洗高效液相色谱仪，执行以下步骤：清洗泵、清洗进样针、冲洗样品瓶、排出注射器中的气泡，以及清洗泵的排空阀。所有步骤均用水清洗。最后，以5 mL/min的流速用甲醇进行系统排空5分钟。
    3. 为建立胆固醇标准曲线，需在氯仿/甲醇（1:1）溶液中配制至少4个浓度梯度的胆固醇溶液，浓度范围为0.05 mg/mL至2 mg/mL24.
    4. 将步骤 2.1.10 获得的样品重悬于 500 µL 氯仿/甲醇（1:1）中，置于带螺口红色聚四氟乙烯/白色硅胶盖的棕色 1.5 mL 玻璃瓶中。
    5. 使用步骤 2.3.3 中制备的标准品定量胆固醇浓度。
      注意：填写采样方案时，需至少包含一个标准品和一个阴性对照，随后为待测样本。
    6. 以曲线下面积表示结果，并使用任意统计软件对适当样本进行比较。
      注意：结果也可根据标准曲线进行定量，并以每毫升、每克或每细胞数的总胆固醇含量表示。标准曲线方程应使用步骤 2.3.3 中获得的数值计算得出。

3. NETs 的可视化与定量分析

  1. 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的可视化
    注意：NETs 的可视化基于 Neumann 之前发表的研究工作 等15.
    1. 用 200 µL 1x PBS 将步骤 1.3.8 中的固定样品洗涤 3 次。
    2. 每孔加入100 µL含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS溶液，室温孵育45分钟，进行封闭和透化处理。
    3. 加入100 µL一抗：小鼠单克隆抗DNA-组蛋白1抗体（用含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS将原液稀释至2.2 mg/mL，按1:5,000比例稀释）或抗髓过氧化物酶（MPO）多克隆抗体（兔抗MPO；用含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS按1:300比例稀释）。4 °C孵育过夜。
    4. 用 200 µL 的 1x PBS 洗涤 3 次。
    5. 加入100 µL二抗（荧光标记的山羊抗小鼠抗体，1:1,000稀释于BSA-PBS-Triton X-100中；山羊抗兔抗体，1:1,000稀释于BSA-PBS-Triton X-100中），室温避光孵育1小时。
    6. 用200 µL 1x PBS洗涤3次。
    7. 用镊子取下盖玻片，将其有样本的一面朝下，置于含有3 µL含DAPI封片剂的载玻片上。
    8. 使用配备 HCX PL APO 40X 0.75-1.25 油浸物镜的共聚焦倒置荧光显微镜观察样品15.
  2. NET释放细胞核的定量分析
    1. 打开图像处理软件（例如， ImageJ）并将感兴趣的图片拖放到工具栏中。
    2. 点击 "插件，" "分析，" 和 "细胞计数仪"
    3. 按压 "初始化" 计数器窗口中的按钮并选择计数器类型（例如， 单击红色的 7 选择释放 NET 的细胞，单击黄色的 8 选择不释放 NET 的细胞，如图所示 图 6B-i 和 ii).
      注意：NET阳性细胞的判定标准：细胞核呈绿色阳性染色，且细胞核密度降低（失去分叶状结构）或细胞核圆形结构消失，同时伴随细胞核体积增大，或出现明显的细胞外突起。
    4. 点击符合上述标准的每个细胞，并将计数的细胞数量记录到分析软件的数据表中。
    5. 使用计数的NET释放细胞和非释放细胞的数量，计算NET释放细胞的百分比。

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结果

通过密度梯度离心法分离人外周血来源的中性粒细胞（图2）。为研究脂质改变对中性粒细胞的影响，使用10 mM MβCD处理细胞，以耗竭细胞内的胆固醇。随后，按照Brogden 等23描述的方法，采用Bligh和Dyer法从样品中提取脂质（图1，左图）。将制备好的脂质样品点样于硅胶HPTLC板上，并采用三相溶剂系统进行展开，该系统已优化以分离和可视化多种脂质，包括胆固醇、胆固醇酯、鞘磷脂、磷脂、三酰甘油、游离脂肪酸、单酰甘油、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱（图3A）。该方法无法检测胆固醇的氧化衍生物（氧固醇）。另采用高效液相色谱法（HPLC）对胆固醇进行定量分析（图3B）。在定量分析中，HPLC测定胆固醇的回归值显著优于HPTLC（图4A 与 图4B 对比）。为可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs...

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讨论

本文所述方法可用于通过高效薄层色谱（HPTLC）或高效液相色谱（HPLC）分析特定脂质（如胆固醇），并研究药理性脂质改变对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的影响（参见 Neumann et al.15）。

HPTLC 是一种相对经济且简单的方法，可用于分析大量样本中的多种脂质。该方法已广泛应用于多个研究领域，包括抗生素定量25、溶酶体贮积病中的脂质贮存26，以及上皮细胞中胆固醇和胆固醇葡萄糖苷水平的测定27。本文所述方法经过修改和优化，用于从纯化的中性粒细胞群体中分离脂质；然而，经过轻微调整后，该方法也可用于组织样本中的脂质提取（参见 Brogden et al.23）。利用该方法，可对脂质进行有效分离、鉴定，并以已知标准品为参照进行半定量分析。该方法中的一个关键步骤是使用指定名称的缓冲液，因为使用其他任何...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了德国汉诺威兽医大学“动物与人畜共患感染”博士项目以及动物健康研究院（AfT）提供的博士后奖学金资助，获资助者为Ariane Neumann。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
中性粒细胞分离、NET染色与定量
Alexa Flour 633 山羊抗兔 IgGInvitrogenA-21070
抗MPOα抗体DakoA0398
BSASigma-Aldrich3912-100G
Marienfeld-Neubauer 改良计数板CeleromicsMF-0640010
共聚焦显微镜 TCS SP5 AOBS 带串联扫描仪LeicaDMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10xSigma-AldrichP5493-1L用水稀释1:10以获得1x工作液
Dy Light 488标记的高度交叉吸附抗体Thermo Fisher Scientific35503
ExcelMicrosoft2010
DNA/组蛋白1抗体MilliporeMAB3864
ImageJNIH1.8http://imagej.nih.gov/ij/
光学显微镜VWR630-1554
甲基-β-环糊精Sigma-AldrichC4555-1G
PFACarl Roth0335.3溶于水，加热至65 °C，并加入1 N NaOH至溶液澄清
PMASigma-AldrichP8139-1MG储存液浓度为16 µM，溶于1x PBS中
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP4707
PolymorphprepAXIS-SHIELDAN1114683
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭试剂InvitrogenP7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂InvitrogenP7581
RPMI1640PAAE 15-848
含CaCl和Mg的HBSSSigmaH6648
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ml
台盼蓝Invitrogen15250-0610.4%溶液
水Carl Roth3255.1无内毒素
名称公司目录编号 备注
脂质分离与分析
1-丙醇Sigma-Aldrich33538
10 µL 注射器Hamilton701 NR 10 µl
乙醚Sigma-Aldrich346136
乙酸乙酯Carl Roth7336.2
Canullla 26 GBraun4657683
五水合硫酸铜(II)Merck1027805000
氯仿Carl Roth7331.1
CP ATLAS 软件Lazarsoftware2.0
Chromolith HighResolution RP-18 封端柱 100-4.6 mmMerck152022
高效液相色谱仪 ChromasterHitachiHITA 892-0080-30Y参数取决于具体HPLC仪器
HPLC紫外检测器Hitachi5410
HPLC色谱柱温箱Hitachi5310
HPLC自动进样器Hitachi5260
HPLC泵Hitachi5160
甲醇Carl Roth7342.1
正己烷Carl Roth7339.1
磷酸Sigma-Aldrich30417
氯化钾Merck49,361,000
研钵LAT Garbsen5 ml
SDSCarl RothCN30.3
HPTLC硅胶60板Merck105553
Vacufuge plus 基础装置Eppendorf22820001
Corning Costar 细胞培养48孔板，平底SigmaCLS3548
盖玻片Thermo Fisher Scientific1198882
载玻片Carl Roth1879
BD 结核菌素注射器 1 mLBD Bioscience309659

参考文献

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