使用神经元形态发生研究 黑腹果蝇 幼虫树突状分支（da）神经元获益于 原位 通过免疫荧光可视化神经元和表皮蛋白。我们描述了一种通过去除幼虫体壁中的肌肉组织来改善da神经元及周围表皮细胞免疫荧光分析的实验方法。
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摘要
摘要
果蝇 幼虫树突分支（da）神经元是研究神经元形态发生机制的常用模型。da神经元在与其所支配的表皮细胞相互交流的过程中发育，因此对其分析得益于 原位 通过免疫荧光技术可视化神经元和表皮表达的蛋白质。传统的幼虫铺片制备方法在进行免疫荧光实验时会保留覆盖大部分体壁的肌肉组织，这为神经元和表皮蛋白的成像带来多种挑战。本文描述了一种去除肌肉组织的方法 果蝇 幼虫肌片。该方案能够对原本被肌肉组织遮蔽的蛋白质进行成像，提高信噪比，并有助于利用超分辨率显微镜研究da神经元的发育过程。
引言
Drosophila 幼虫的树突分支（da）神经元因其易于进行遗传操作且便于成像，为研究神经元发育提供了有价值的模型。这些感觉神经元在鉴定调控树突形态发生过程的众多信号通路方面发挥了重要作用1-3。
四类多极神经元（I - IV 类）支配幼虫表皮。这些神经元位于基底膜与表皮之间，其树突主要形成二维排列的结构4,5。在四类神经元中，IV 类多极神经元具有最高度分支的树突形态，并且与其他动物的感觉神经元类似，这些树突结构的发育需要内在因子以及来自邻近组织（特别是表皮）的外部信号共同参与6-9。
研究神经元及非神经元因素如何调控树突形态发生的过程，得益于通过免疫荧光技术在原位检测蛋白质表达的能力。in situ。幼虫的外表皮无法让抗体穿透，但这一障碍可通过成熟的幼虫体壁剥离解剖方法轻易克服10,11。然而，位于基底膜内侧的体壁肌肉组织为检测da神经元和表皮细胞带来了若干挑战。首先，覆盖大部分体壁的肌肉组织会严重遮挡来自神经元或表皮组织的荧光信号，显著降低样本的信噪比。其次，许多相关蛋白可能在肌肉组织以及神经元或表皮中均有表达，这种源自肌肉的荧光信号很可能进一步干扰对神经元或表皮荧光信号的检测。最后，显微成像技术的进步现已实现亚衍射极限分辨率的成像，在分辨神经元及其周围表皮细胞中蛋白定位方面尤为有用12,13。然而，超分辨率显微成像的效果依赖于高信噪比以及样本与盖玻片之间的紧密 proximity。除了降低信噪比外，幼虫体壁肌肉还将da神经元与盖玻片隔开，从而限制了超分辨率显微技术所能达到的成像分辨率提升。除免疫荧光分析面临的挑战外，肌肉组织还阻碍了对幼虫体壁感觉神经元进行电生理记录。因此，去除肌肉组织有利于对感觉神经元进行神经生理学操作14。
本文介绍了一种手动去除黑腹果蝇（Drosophila）幼虫肌肉组织的方法。我们证明，该方案能够实现对原本被肌肉组织遮蔽的蛋白质进行免疫荧光成像，提高IV类da神经元成像的信噪比，并可应用于超分辨率显微镜技术，从而更清晰地区分da神经元和表皮中蛋白质与细胞结构的空间关系。
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方案
注意：肌肉剥离的步骤（图1）是对先前描述的幼虫剥离制备方法的改进。本文简要概述了肌肉剥离前后步骤，更详细的描述请参见以往研究10, 11。
1. 在冷盐溶液中解剖幼虫
- 制备冷的 HL3.1 生理盐水15 或冷的无 Ca2+ HL3.1 生理盐水11（表 1）的工作液。将幼虫置于硅胶弹性体培养皿中，加入足量的冷盐水，以刚好覆盖皿底为宜。
注意：关于盐溶液的选择，请参见讨论部分。
| 1x HL3.1 生理盐水（pH 7.2） |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCl |
| 5 mM KCl |
| 1.5 mM CaCl2 （Ca省略）2+-无菌生理盐水） |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM NaHCO₃3 |
| 5 mM 海藻糖 |
| 115 mM 蔗糖 |
| 过滤除菌后，4 °C 保存 |
| 注：成分模拟昆虫血淋巴 |
表1. 冷生理盐水的成分。
- 将幼虫腹侧朝上放置。幼虫的腹面可通过腹部的齿状带识别，背面则可通过从头至尾延伸的初级幼虫气管识别。将幼虫沿前后方向拉直，并用昆虫针将头部和尾部固定在硅胶弹性体解剖皿中。使用精细解剖剪从一端开始，沿腹侧中线剪开，逐步向另一端推进。
注意：此朝向可保留常被研究的背侧多刺神经元簇。 - 将幼虫剪开后，像打开书本一样，用昆虫针将四个角固定在解剖皿上。用镊子夹住并移除包括中枢神经系统、肠道和气管在内的内部器官。调整昆虫针，使组织展开平整但不过度拉伸。
注意：肌肉在体节边界处附着于体壁。尽管肌肉覆盖了大部分体壁，但在背侧中线附近的狭窄区域则无肌肉覆盖。
2. 肌肉去除
- 找到幼虫的背中线，此处无肌肉组织。将单个镊子尖端置于肌肉组织下方，使其以尽可能扁平的方向插入。
- 从体节前缘附近的背中线开始，小心地将镊子尖端在肌肉与表皮之间滑动，注意尽量减少镊子与表皮的接触。
- 向上提起镊子，以断开肌肉与体壁之间的一个附着点。对其他感兴趣的半体节重复此操作。
注意：本方案旨在优化保留每个da神经元树突区域的后部。若需保留树突区域的前部，则最好从每个体节的后端插入镊子尖端。 - 重新调整昆虫针的位置，使幼虫片材在各个方向上被最大程度地拉伸。
- 在解剖皿中仍固定针的情况下，用预冷的新鲜配制的含4%多聚甲醛的PBS溶液固定片材25分钟。
- 用PBS冲洗5次。
- 用镊子小心地将肌肉组织从其余附着点处剥离，注意尽量减少与表皮的接触。
- 解除固定针，将片材从解剖皿转移至1.5 ml微量离心管中。随后的所有洗涤、封闭及免疫荧光染色步骤均按先前所述方法进行11。
3. 固定幼虫剥离标本
- 首先使用精细解剖剪剪去头部和尾部，以使样品尽可能平整。将鱼片组织内表面朝向盖玻片，用抗荧光淬灭封片剂将其固定在盖玻片上。
- 将显微镜载玻片置于盖玻片上，轻轻按压以均匀分散封片剂。翻转载玻片，用指甲油密封盖玻片边缘。制好的载玻片可在 -20 °C 下保存至少一个月。
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结果
我们展示了肌肉去除步骤在免疫荧光实验中的应用价值，该方法可提高信噪比，用于共可视化定位节状连接蛋白Cora（Coracle）和Dlg（Discs-large），以及利用膜标记CD4-tdTomato标记的IV类da神经元。
Cora 之前已被用于鉴定包裹 class IV da 神经元树突的表皮细胞区域，是目前研究中发现的多种与 da 神经元树突形态发生及功能相关的表皮因子之一4,6-9,16。我们对去除肌肉（无肌）和保留肌肉（有肌）的幼虫展开组织进行免疫染色，使用抗 DsRed 抗体标记神经元（红色），抗 Cora 抗体标记（绿色）。针对每种条件，均利用激光扫描共聚焦显微镜对 class IV da 神经元的后侧树突区域进行成像。两种条件下的图像均采用相同的成像参数获取。此外，我们还通过提高激光功率对保留肌肉的样本进行成像，以补偿肌肉组织带来的信号干扰。
在去肌肉样本中，C...
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讨论
本文介绍了一种从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫肌片中手动去除肌肉组织的实验方案。该方案对先前报道的幼虫解剖技术进行了改进10,11。将幼虫在硅胶弹性体培养皿中解剖后，定位背侧中线。使用镊子的一个尖端，以其最扁平的方向，小心地插入背侧中线附近肌肉组织与表皮之间。轻轻向上拉动镊子，使目标幼虫节段中每一节的肌肉组织与其一个附着点分离。随后，将幼虫肌片在冷甲醛中固定，再用镊子进一步将肌肉从其余附着点处剥离。
尽管在固定后进行整个肌肉去除操作颇具吸引力，但我们发现，一旦固定，被拉伸的肌肉即使从锚定点脱离后仍会保持扁平状态，并紧贴表皮，导致在不损伤下方组织的情况下难以操作。此外，根据我们的经验，固定后的肌肉组织较脆，容易撕裂，难以从体壁上完整去除。相比之下，若在固定前先将肌肉从一个锚定点分离，固定过程中肌肉会向剩余的锚定点收缩，留下易于用镊子夹取的组织残端，从而更方便地从幼虫体壁上将其拉出。
为了最大限度地保存样本，在去除肌肉的过程中必须格外小心，尽量减少镊子与表皮的接触。因此，与先前描述的解...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Gary Laevsky 在显微镜技术方面的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01GM061107 和 R01GM067758，授予 E.R.G.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 镊子 | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| 微型剪刀，8 cm，直头，5 mm 刀片，0.1 mm 尖端 | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 3097358-1004 | 用于解剖板 |
| Austerlitz 昆虫针，0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 光源 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | 用于共聚焦显微镜 |
| Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Life Technologies | P36970 | 用于结构照明显微镜 |
| 显微盖玻片，22 x 22 mm，No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus 显微载玻片，25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 小鼠抗-Coracle 抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | 上清液，稀释比例 1:50 |
| 小鼠抗-Discs large 抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | 上清液，稀释比例 1:50 |
| 兔抗-dsRed 抗体 | Clontech | 632496 | 稀释比例 1:1,000 |
| 山羊抗兔抗体，Alexa Fluor 568 标记 | ThermoFisher Scientific | A-11011 | 稀释比例 1:1,000 |
| 山羊抗小鼠抗体，Alexa Fluor 488 标记 | ThermoFisher Scientific | A-11001 | 稀释比例 1:500 |
参考文献
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重印与许可
