小型动物模型中的动静脉环（AV环）用于研究血管生成与带血管组织工程

摘要

我们描述了一种显微外科手术方法，用于构建动静脉（AV）回路，作为血管化研究的模型 体内 在隔离且特征明确的环境中进行研究。该模型不仅适用于血管生成的研究，还特别适合用于构建具有轴向血管化且可移植的组织。

摘要

功能性血管网络是人体几乎所有组织和器官存活与生长的前提条件。此外，在癌症等病理情况下，血管化在疾病进展中起着主导作用。因此，迫切需要一种标准化且特征明确的体内模型，以阐明新生血管形成的机制，并为组织工程和再生医学开发不同的血管化策略。

我们描述了一种用于小型动物模型的显微外科方法，该模型可诱导形成由静脉和动脉构成的血管轴，二者通过动静脉（AV）吻合形成AV环路。随后将该AV环路转移至封闭式植入腔室中，以构建一个独立的微环境。 体内 仅通过血管轴与活体生物相连。利用三维成像技术（MRI、micro-CT）和免疫组织化学方法，可随时间推移对新生血管进行可视化观察。通过植入不同细胞、生长因子和基质，可在高度可控的环境中分析其在血管网络形成中的功能，且不受周围环境干扰。

除了血管生成和抗血管生成研究外，动静脉（AV）袢模型也非常适用于构建带血管化的组织。经过一定的预血管化时间后，所生成的组织可被移植至缺损部位，并通过显微外科技术与局部血管相连，从而确保工程化组织获得即时的血液供应和有效整合。通过改变支架材料、细胞类型、生长因子以及腔室结构，可以生成多种不同类型的组织，进而根据每位患者的具体需求进行个性化定制。

引言

人体内的大多数组织和器官都依赖于功能性的血管网络，以供应营养物质、进行气体交换并清除代谢废物。由于局部或全身性血管问题导致该系统功能障碍，可能引发多种严重疾病。此外，在组织工程或再生医学等研究领域，人工构建的组织或移植器官中若缺乏功能性血管网络，将无法实现成功的临床应用。

几十年来，研究人员一直在探究血管系统生长的确切机制，以更深入地理解病理状态，从而寻找新的治疗干预手段，并为血管疾病提供更有效的预防措施。第一步通常是通过研究细胞间相互作用，或分子对血管系统细胞的影响等基本过程 体外 二维或三维实验。传统的二维模型易于操作，已得到广泛应用，并极大地促进了对这些过程的深入理解。1980年，Folkman首次 等. 报道 体外 在明胶包被的培养板上接种毛细血管内皮细胞以诱导血管生成¹这立即引发了大量关于内皮细胞管形成实验的二维血管生成研究相继发表。²，迁移实验³ 不同类型细胞的共培养⁴以及其他方法。这些检测方法至今仍被使用，并被公认为标准方法 体外 方法

然而，这种实验设置并不总是适用于对……的研究 体内 细胞行为，因为大多数细胞类型需要三维环境才能形成相关的生理组织结构⁵可以证明，三维基质的结构对毛细血管形态发生具有决定性作用....

方案

所有实验均经德国埃尔兰根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物护理委员会及德国中弗兰肯区政府批准。实验所用为雄性Lewis大鼠，体重为300 - 350 g。

1. 大鼠动静脉环模型

1. 植入手术步骤（图2）
   1. 用于麻醉时，使用一个连接好的特殊塑料箱 通过 将导管连接至异氟烷蒸发器，并用盖子封闭。打开供气，调节流量计至0.8–1.5 L/min。
   2. 将大鼠放入诱导用塑料盒中并密封顶部。打开异氟烷挥发罐至5%。
   3. 在麻醉诱导期间密切观察大鼠。3 - 4 分钟后，大鼠将进入麻醉状态。
   4. 确认麻醉效果：翻正反射消失、眼睑反射消失、回缩反射消失、角膜反射阳性。
   5. 将大鼠从盒子中取出，称重以计算药物剂量。在麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。
   6. 给予止痛药和抗生素（例如，皮下注射7.5 mg/kg恩诺沙星（enrofloxacin），静脉注射12.5 mg/kg曲马多（tramadol）和100 mg/kg美他咪唑（metamizole）。术中给予按体重调整剂量的晶体液例如，30 ml/kg，皮下注射。
   7. 将大鼠置于37 °C的加热板上，仰卧位，在1 - 2%异氟烷吸入麻醉下进行操作 通过 口罩
   8. 正确监测麻醉状态，若麻醉过浅（大鼠出现移动....

结果

组织工程
为实现骨组织工程目的，多种不同的骨替代材料被植入小型动物大鼠的动静脉袢（AV loop）模型中^27,28,33,34。通过三维显微计算机断层扫描（micro-CT）可清晰显示血管化情况（图3A）。在植入加工后的牛松质骨（PBCB）支架材料时，动静脉袢组的血管化程度显著高于无血管化组。在植入腔内，血管网络持续生长并逐渐成熟，历时8周。在第4至第8周期间，观察到血管化组织持续向构建物中心生长，而在非血管化组中则未见此类增长³³。将PBCB支架在动静脉袢模型中预先血管化6周后，所接种的成骨细胞存活率显著优于对照组的成骨细胞。与对照组相比，在植入成骨细胞的动静脉袢组中可检测到骨特异性基因的表达²⁸。此外，另一种支架材料——烧结生物活性玻璃联合纤维蛋白凝胶——也被植入大鼠的动静脉袢中。3周后，micro-CT与组织学分析均证实已形成致密的新生血管网络²⁷。

讨论

十余年来，我们已成功将动静脉（AV）环路用于组织工程及血管生成研究。 体内 在小型动物模型中，我们证实该显微外科模型非常适用于不同组织的工程化构建，也可用于血管生成或抗血管生成研究。

该技术相对于现有/替代方法的重要性
工程化组织或器官需要具备功能性的血管网络，以在移植到缺损部位后为其存活和成功整合提供所需的营养物质和氧气⁴¹几十年来，人们已开发出多种不同的预血管化策略，这些策略可根据以下方面进行区分： 体外 与 体内 和外在的 与 内在方法

支架可被制备成管状结构，并接种血管内皮细胞或祖细胞等血管细胞 体外⁴²另一方面，对于 体内 预血管化，将支架植入高血管化区域，如皮下或肌肉组织²¹随后，这些外部血管化的构建物可被移植到缺损部位。然而，这些方法的缺点在于移植后无法与受体的血管进行显微外科连接。特别是对于大规.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / 聚酰胺 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / 聚乙醇酸交酯共聚物 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / 聚丙烯	Ethicon	8695H
铝喷雾	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
消毒剂	BODE Chemie GmbH
导管	B Braun Meslungen AG	4251612-02
造影剂	Flowtech	MV-122
戊巴比妥、甲苯磺酸甲苯磺隆、盐酸四卡因注射液	Intervet International GmbH
浓墨（印度墨水）	Lefranc & Bourgeois
恩诺沙星	Bayer AG
眼膏	Bayer AG
4% 甲醛	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
肝素	Ratiopharm GmbH
异氟烷	Abbott Laboratories	6055482
Lewis 大鼠，雄性	Charles River Laboratories
安乃近钠	Ratiopharm GmbH
罂粟碱 / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
曲马多 / Tramal	Grünenthal GmbH