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方法文章

小型动物模型中的动静脉环（AV环）用于研究血管生成与带血管组织工程

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DOI：

10.3791/54676

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2016年11月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), 2Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, 3Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

本文内容

摘要

我们描述了一种显微外科手术方法，用于构建动静脉（AV）回路，作为血管化研究的模型 体内 在隔离且特征明确的环境中进行研究。该模型不仅适用于血管生成的研究，还特别适合用于构建具有轴向血管化且可移植的组织。

摘要

功能性血管网络是人体几乎所有组织和器官存活与生长的前提条件。此外，在癌症等病理情况下，血管化在疾病进展中起着主导作用。因此，迫切需要一种标准化且特征明确的体内模型，以阐明新生血管形成的机制，并为组织工程和再生医学开发不同的血管化策略。

我们描述了一种用于小型动物模型的显微外科方法，该模型可诱导形成由静脉和动脉构成的血管轴，二者通过动静脉（AV）吻合形成AV环路。随后将该AV环路转移至封闭式植入腔室中，以构建一个独立的微环境。 体内 仅通过血管轴与活体生物相连。利用三维成像技术（MRI、micro-CT）和免疫组织化学方法，可随时间推移对新生血管进行可视化观察。通过植入不同细胞、生长因子和基质，可在高度可控的环境中分析其在血管网络形成中的功能，且不受周围环境干扰。

除了血管生成和抗血管生成研究外，动静脉（AV）袢模型也非常适用于构建带血管化的组织。经过一定的预血管化时间后，所生成的组织可被移植至缺损部位，并通过显微外科技术与局部血管相连，从而确保工程化组织获得即时的血液供应和有效整合。通过改变支架材料、细胞类型、生长因子以及腔室结构，可以生成多种不同类型的组织，进而根据每位患者的具体需求进行个性化定制。

引言

人体内的大多数组织和器官都依赖于功能性的血管网络，以供应营养物质、进行气体交换并清除代谢废物。由于局部或全身性血管问题导致该系统功能障碍，可能引发多种严重疾病。此外，在组织工程或再生医学等研究领域，人工构建的组织或移植器官中若缺乏功能性血管网络，将无法实现成功的临床应用。

几十年来，研究人员一直在探究血管系统生长的确切机制，以更深入地理解病理状态，从而寻找新的治疗干预手段，并为血管疾病提供更有效的预防措施。第一步通常是通过研究细胞间相互作用，或分子对血管系统细胞的影响等基本过程 体外 二维或三维实验。传统的二维模型易于操作，已得到广泛应用，并极大地促进了对这些过程的深入理解。1980年，Folkman首次 等. 报道 体外 在明胶包被的培养板上接种毛细血管内皮细胞以诱导血管生成1这立即引发了大量关于内皮细胞管形成实验的二维血管生成研究相继发表。2，迁移实验3 不同类型细胞的共培养4以及其他方法。这些检测方法至今仍被使用，并被公认为标准方法 体外 方法

然而，这种实验设置并不总是适用于对……的研究 体内 细胞行为，因为大多数细胞类型需要三维环境才能形成相关的生理组织结构5可以证明，三维基质的结构对毛细血管形态发生具有决定性作用6 以及细胞-细胞外基质（ECM）相互作用和三维培养条件可调控肿瘤血管生成中关键因子的表达73D基质可提供复杂的力学信号，能够结合效应蛋白并建立组织尺度的溶质浓度梯度。此外，它被认为是模拟 体内 复杂组织中的形态发生与重塑步骤5在这些系统中，可以同时研究血管生成和血管发生。其中，血管生成是指从已有的血管中萌发出毛细血管的过程8，血管发生指的是 从头合成 通过内皮细胞或其前体细胞形成血管9,10血管成熟过程被称为“动脉生成”（arteriogenesis） 通过 平滑肌细胞的募集11典型的血管生成 体外 模型包括内皮细胞从已接种于凝胶表面的单层细胞中出芽，或从嵌入凝胶中的微球表面的单层细胞中出芽，或通过构建内皮细胞球体实现出芽12在血管生成模型中，单个内皮细胞被包埋于三维凝胶中。它们与邻近的内皮细胞相互作用，形成血管样结构和网络。 从头合成 通常与支持细胞联合使用12.

然而，即使是复杂的3D 体外 模型无法模拟 体内 鉴于存在大量的细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用，无法完全设定所有参数13. 高度的物质 体外 活性并不自动表现出相同的效果 体内 和 反之亦然14为了对血管化过程进行全面分析，迫切需要开发 体内 更佳模拟体内情况的模型。多种多样的 体内 文献中描述了多种血管生成检测方法，包括鸡胚尿囊绒毛膜检测（CAM）、斑马鱼模型、角膜血管生成检测、背部气囊模型、背部皮肤折叠室以及皮下肿瘤模型14然而，这些检测方法通常存在一些局限性，例如在CAM检测中细胞形态快速变化、难以区分新生毛细血管与已存在的毛细血管，或在角膜血管生成检测中可用空间有限等问题。15此外，还使用了非哺乳动物系统（例如斑马鱼模型16），这会导致异种移植中的问题17在皮下肿瘤模型中，由于邻近组织对血管化过程有显著贡献，因此无法单独分析仅源自肿瘤本身的血管生成。此外，周围组织可能在塑造肿瘤微环境方面发挥决定性作用。18.

不仅在研究血管生成或血管发生时，迫切需要一种标准化且特征明确的 体内 模型，也为组织工程和再生医学中不同的血管化策略研究提供了平台。如今，复杂人工器官或组织的构建已成为可能 体外 和 体内3D生物打印提供了一种按需制造复杂三维功能性活体组织的 fabrication 技术19此外，生物反应器还可用于组织的构建20 或者甚至可以将生物体自身用作生物反应器21然而，人工生成组织成功应用的主要障碍在于工程化构建物内部缺乏血管化。移植后与宿主血管系统的即时连接是其存活的关键前提，尤其对于大规模的人工组织或器官而言更是如此。

不同 体外 或 体内 预先血管化策略被开发用于在植入前于构建物中建立功能性微血管网络22支架的植入 体外 将预先构建的工程化毛细血管移植到小鼠背部皮肤后，可在一天内实现小鼠血管系统的快速吻合23相比之下，由人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞组成的球状共培养体在形成三维前血管网络后进一步发育 体内 植入。然而，与宿主血管系统的吻合有限24最重要的是，在血管化较差的缺损区域（如坏死区或经放射治疗的区域），这种所谓的外源性血管化——即血管从周围组织长入支架的过程——常常失败。而内源性血管化则是以血管轴作为新生毛细血管向支架内出芽的来源25采用轴向血管化方法，可将工程化组织以其血管轴进行移植，并在受体部位与局部血管相连。移植后立即由氧气和营养物质充分供给，为组织的最佳整合创造了有利条件。

由于可用于研究的模型有限 体内 血管生成以及鉴于构建轴向血管化组织日益重要的意义，我们进一步改进了Erol和Spira的显微外科技术，以在动物模型中构建动静脉（AV）循环回路26使用完全封闭的植入室使得该方法非常适合研究血管形成 "受控的"，特征明确 体内 条件（图1该模型不仅适用于血管生成的研究，也非常适合用于组织工程中支架的轴向血管化。

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方案

所有实验均经德国埃尔兰根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物护理委员会及德国中弗兰肯区政府批准。实验所用为雄性Lewis大鼠，体重为300 - 350 g。

1. 大鼠动静脉环模型

  1. 植入手术步骤（图2）
    1. 用于麻醉时，使用一个连接好的特殊塑料箱 通过 将导管连接至异氟烷蒸发器，并用盖子封闭。打开供气，调节流量计至0.8–1.5 L/min。
    2. 将大鼠放入诱导用塑料盒中并密封顶部。打开异氟烷挥发罐至5%。
    3. 在麻醉诱导期间密切观察大鼠。3 - 4 分钟后，大鼠将进入麻醉状态。
    4. 确认麻醉效果：翻正反射消失、眼睑反射消失、回缩反射消失、角膜反射阳性。
    5. 将大鼠从盒子中取出，称重以计算药物剂量。在麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    6. 给予止痛药和抗生素（例如，皮下注射7.5 mg/kg恩诺沙星（enrofloxacin），静脉注射12.5 mg/kg曲马多（tramadol）和100 mg/kg美他咪唑（metamizole）。术中给予按体重调整剂量的晶体液例如，30 ml/kg，皮下注射。
    7. 将大鼠置于37 °C的加热板上，仰卧位，在1 - 2%异氟烷吸入麻醉下进行操作 通过 口罩
    8. 正确监测麻醉状态，若麻醉过浅（大鼠出现移动、对疼痛有反应、下颌肌张力存在、反射未消失（见1.1.4））、心率上升），应增加异氟烷浓度。注意避免异氟烷过量（角膜反射消失、心率过高、血氧饱和度下降）。使用专用于小动物的脉搏血氧仪监测大鼠的血氧饱和度（95 - 100%）和心率（250 - 450次/分钟）。术中持续监测大鼠体温（36 - 40 °C），必要时调节加热板温度。
    9. 用电动剃须刀剃除后肢内侧的毛发，并用消毒剂对区域进行消毒。分开后肢，用胶带固定。
    10. 将大鼠置于手术显微镜下，并用无菌巾覆盖大鼠。确保整个手术过程在无菌条件下进行。
    11. 使用手术刀（10号）从左侧大腿上部膝关节至腹股沟处沿纵轴切开皮肤。
    12. 使用解剖剪和显微镊逐层切开皮下组织和筋膜，每段长约3 cm，直至暴露股血管束，从腹股沟处的髂动脉至膝部股动脉分叉处。
    13. 分离血管并使用外膜剪和显微镊去除外膜。
    14. 使用电凝固法凝固侧支血管。用湿敷料覆盖手术区域。
    15. 按照左侧所述方法（1.1.11 - 1.1.14）打开右侧皮肤。
    16. 收获静脉移植物时，使用电凝法在距离远端和近端1 - 1.5 cm处结扎右侧股静脉。
    17. 用显微镊子取出静脉移植物，使用灌注套管以肝素溶液（50 IU/ml，溶于0.9%氯化钠溶液）冲洗静脉移植物，随后将其转移至左侧大腿。用湿纱布覆盖右侧手术区域。
    18. 在左侧腹股沟区域近端用微血管夹夹闭股静脉。在距离约2 cm、分支前的膝关节上方远端位置，通过电凝法凝固股静脉。
    19. 吻合时，使用11-0缝线将静脉移植物近端与静脉近端行端对端吻合。采用约8针间断缝合。首先在12点和6点位置各放置第一针和第二针，然后在前侧两点之间再缝2至3针，随后在后侧两点之间也缝2至3针。
    20. 以与股静脉相同的方法结扎股动脉（1.1.18）。确保血管环无扭曲。将静脉移植物的远端与动脉近端吻合，操作方法同股静脉所述（步骤1.1.19）。
    21. 静脉注射25 IU肝素。再次确认循环管路无扭曲，移除夹子，观察循环管路约5分钟，检查有无渗漏及是否通畅。
    22. 滴加罂粟碱（papaverine）例如， 4 mg/ml）以防止血管痉挛。若血管通畅，环状结构会扩张，并可观察到动脉搏动。
    23. 用基质的第一半部分（约 500 µl）预填充植入室 （例如，含或不含细胞的水凝胶或骨基质）。将环植入植入室中。
    24. 将基质的第二部分加入植入室，使总体积达到 1,000 µl。用腔室盖密封腔室。
    25. 用不可吸收的6-0缝线将植入 chamber 固定在大腿上。用不可吸收的6-0缝线固定 chamber 盖。使用电凝止血以控制可能的出血。
    26. 使用可吸收的4-0缝线缝合皮肤。用铝喷雾覆盖伤口。
    27. 给予抗生素和镇痛药（例如， 7.5 mg/kg 皮下注射恩诺沙星，12.5 mg/kg 口服曲马多（p.o.）（通过饮水给药）持续 3–5 天，之后根据大鼠行为表现决定是否继续用药。
    28. 关闭蒸发器，让大鼠吸入供气直至开始苏醒。
    29. 将大鼠放入带有热支持的盒子中，并密切观察直至其完全恢复。
    30. 在大鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
    31. 在完全恢复之前，不要将大鼠放回与其他动物同处的环境中。
  2. 组织块培养法操作步骤
    1. 根据研究设计，在短期或长期植入后进行取出手术（示例请参见参考文献27-32）。按照步骤1.1.1–1.1.9对大鼠进行麻醉。
    2. 使用手术刀（10号）切开腹部皮肤，用纱布将肠管移至一侧。用棉签暴露腹主动脉和后腔静脉。
    3. 插管腹主动脉（例如，24号塑料导管）并用解剖剪剪断尾腔静脉。
    4. 用含有 100 IU/ml 肝素的 0.9% 氯化钠溶液冲洗腹主动脉，直至流出液澄清。用 30 ml 灌注液对主动脉进行灌注（例如，对比剂或印度墨水）。
    5. 在深度麻醉下，通过注射致死剂量的戊巴比妥钠、甲苄唑铵碘化物、盐酸四卡因注射液（0.1–0.2 ml/kg）处死大鼠。
    6. 用不可吸收的4-0缝线结扎腹主动脉和尾腔静脉。
    7. 用1-2个夹子闭合开放性伤口区域。将大鼠在4 °C下保存24小时（灌注液固化）。
    8. 将大鼠仰卧放置，展开后肢并用胶带固定。
    9. 用手术刀（10号）沿纵轴方向切开囊袋上方的皮肤。
    10. 使用解剖剪和显微镊去除腔体及环状蒂上的结缔组织。用解剖剪在距离腔体开口1 cm处剪断环状蒂，并移除腔体。
    11. 打开腔室盖子，用镊子小心将构建物从腔室内取出，并在室温下置于4%缓冲甲醛溶液中固定24小时。随后，将构建物用于3D显微计算机断层扫描，或进行石蜡包埋以供组织学分析30.

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结果

组织工程
为实现骨组织工程目的，多种不同的骨替代材料被植入小型动物大鼠的动静脉袢（AV loop）模型中27,28,33,34。通过三维显微计算机断层扫描（micro-CT）可清晰显示血管化情况（图3A）。在植入加工后的牛松质骨（PBCB）支架材料时，动静脉袢组的血管化程度显著高于无血管化组。在植入腔内，血管网络持续生长并逐渐成熟，历时8周。在第4至第8周期间，观察到血管化组织持续向构建物中心生长，而在非血管化组中则未见此类增长33。将PBCB支架在动静脉袢模型中预先血管化6周后，所接种的成骨细胞存活率显著优于对照组的成骨细胞。与对照组相比，在植入成骨细胞的动静脉袢组中可检测到骨特异性基因的表达28。此外，另一种支架材料——烧结生物活性玻璃联合纤维蛋白凝胶——也被植入大鼠的动静脉袢中。3周后，micro-CT与组织学分析均证实已形成致密的新生血管网络27。

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讨论

十余年来，我们已成功将动静脉（AV）环路用于组织工程及血管生成研究。 体内 在小型动物模型中，我们证实该显微外科模型非常适用于不同组织的工程化构建，也可用于血管生成或抗血管生成研究。

该技术相对于现有/替代方法的重要性
工程化组织或器官需要具备功能性的血管网络，以在移植到缺损部位后为其存活和成功整合提供所需的营养物质和氧气41几十年来，人们已开发出多种不同的预血管化策略，这些策略可根据以下方面进行区分： 体外 与 体内 和外在的 与 内在方法

支架可被制备成管状结构，并接种血管内皮细胞或祖细胞等血管细胞 体外42另一方面，对于 体内 预血管化，将支架植入高血管化区域，如皮下或肌肉组织21随后，这些外部血管化的构建物可被移植到缺损部位。然而，这些方法的缺点在于移植后无法与受体的血管进行显微外科连接。特别是对于大规...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢以下机构对我们的动静脉环路研究提供的支持：Staedtler基金会、Dr. Fritz Erler基金会、Else Kröner Fesenius基金会、Baxter Healthcare GmbH、德国研究基金会（DFG）、IZKF/ELAN/EFI/性别与多样性办公室、医学研究基金会、埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）、AO基金会、Manfred Roth基金会、Xue Hong、Hans Georg Geis基金会、德国学术交流中心（DAAD）以及伊拉克高等教育与科研部。我们感谢Stefan Fleischer、Marina Milde、Katrin Köhn和Ilse Arnold-Herberth提供的出色技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠Berlin-Chemie AG34592508
11-0 Ethilon / 聚酰胺 6/6EthiconEH7438G
4-0 Vicryl / 聚乙醇酸交酯共聚物 910EthiconV392H
6-0 Prolene / 聚丙烯Ethicon8695H
铝喷雾Pharma Partner Vertriebs-GmbH1020
消毒剂 BODE Chemie GmbH 
导管 B Braun Meslungen AG4251612-02
造影剂Flowtech MV-122
戊巴比妥、甲苯磺酸甲苯磺隆、盐酸四卡因注射液 Intervet International GmbH
浓墨（印度墨水）Lefranc & Bourgeois
恩诺沙星Bayer AG
眼膏Bayer AG
4% 甲醛Carl Roth GmbH & Co. KGP087.4
肝素Ratiopharm GmbH
异氟烷 Abbott Laboratories6055482
Lewis 大鼠，雄性Charles River Laboratories
安乃近钠 Ratiopharm GmbH
罂粟碱 / Paveron NLinden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
曲马多 / TramalGrünenthal GmbH

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