研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

摘要

通过将DNA损伤剂连接至三链形成寡核苷酸（TFO），可实现靶向的DNA损伤。利用经修饰的TFO，结合本文所述的染色质免疫沉淀分析和DNA超螺旋分析方法，可在人细胞中研究DNA损伤特异性蛋白结合及DNA拓扑结构的改变。

摘要

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种非组蛋白的结构蛋白，在调控基因组的多种重要功能中发挥关键作用，如转录、DNA复制和DNA修复。HMGB1对结构发生畸变的DNA的结合亲和力高于对标准B型DNA的结合亲和力。例如，我们发现HMGB1能够结合DNA链间交联（ICLs），这种交联通过共价连接DNA双链，导致螺旋结构畸变，若未被修复，则可能引发细胞死亡。由于ICL具有细胞毒性潜力，目前临床上已有多种可诱导ICL形成的试剂被用作化疗药物。尽管形成ICL的试剂对某些特定碱基序列具有偏好性（例如， 5'-TA-3' 是补骨脂素（psoralen）优先交联的位点，但其诱导的DNA损伤通常缺乏特异性。然而，若将可诱导DNA链间交联（ICL）的试剂共价连接至可形成三链结构的寡核苷酸（TFO），由于TFO能够以序列特异性方式结合DNA，则可实现靶向性的DNA损伤。本文中，我们使用一种在5'端共价连接了4'-羟甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素（HMT）的TFO，在突变报告质粒上产生位点特异性的ICL，作为研究HMGB1在人细胞中对复杂DNA损伤进行结构修饰、加工及修复的工具。我们描述了在报告质粒上制备TFO导向的ICL的实验技术，并利用染色质免疫沉淀实验，在细胞环境中检测HMGB1与TFO导向ICL的结合情况。此外，我们还介绍了DNA超螺旋实验，通过测量HMGB1在补骨脂素交联的质粒上引入的超螺旋匝数，评估受损DNA的特异性结构修饰。这些技术可用于研究其他蛋白质在任何目标细胞系中对TFO导向ICL或其他靶向DNA损伤的加工与修复过程中的作用。

引言

三链体形成寡核苷酸（TFOs）通过Hoogsteen氢键以序列特异性方式结合双链DNA，形成三链螺旋结构^1-5。三链体技术已被用于研究多种生物分子机制，例如转录、DNA损伤修复和基因靶向（参见文献^6-8的综述）。TFOs已被广泛用于在报告质粒上诱导位点特异性损伤^9,10。我们实验室及其他研究团队此前曾使用与补骨脂素分子连接的TFO（AG30），在质粒pSupFG1的supF基因上诱导位点特异性的DNA链间交联（ICLs）^5,10-12。ICLs具有高度细胞毒性，因为这类损伤通过共价键将两条DNA链交联在一起，若未被修复，可阻断基因转录并阻碍DNA复制机器的运行^13,14。由于其细胞毒性潜力，诱导ICLs的试剂已被用作治疗癌症及其他疾病的化疗药物¹⁵。然而，人类细胞中ICLs的加工与修复机制尚不明确。因此，更深入地理解人类细胞中ICLs加工涉及的机制，可能有助于提高基于ICLs的化疗方案的疗效。TFO诱导的ICLs及其修复中间产物可能导致DNA双螺旋结构发生显著畸变。此类结构畸变很可能成为结构调控蛋白的靶标，这些蛋白对畸变DNA的结合亲和力高于对标准B型双螺旋DNA的结合亲和力^16-20。在此，我们通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，在补骨脂素交联的质粒上研究了在人类细胞中一种丰度极高的结构调控蛋白HMGB1与ICLs的关联，并在人源癌细胞裂解液中鉴定出HMGB1在调控补骨脂素交联质粒DNA拓扑结构中的作用。

HMGB1 是一种丰度极高的非组蛋白结构蛋白，广泛表达于各类细胞中，其与损伤DNA及非典型结构DNA底物的结合亲和力高于经典的B型DNA。^17-20HMGB1 参与多种 DNA 代谢过程，如转录、DNA 复制和 DNA 修复^16,21-23我们先前已证明，HMGB1 能够结合 TFO 定向的 ICLs 体外 高亲和力²⁰此外，我们证明了HMGB1的缺失会增加TFO导向的ICLs的致突变性加工，并将HMGB1鉴定为核苷酸切除修复（NER）的辅助因子。^23,24最近，我们发现HMGB1与人类细胞中TFO导向的ICL相关，且其向此类损伤位点的招募依赖于NER蛋白XPA¹⁶DNA的负超螺旋已被证明可促进核苷酸切除修复（NER）对DNA损伤的有效清除²⁵，我们发现HMGB1优先诱导TFO导向的含ICL质粒底物产生负超螺旋（相对于无损伤的质粒底物）¹⁶，有助于更深入地理解HMGB1作为核苷酸切除修复（NER）协同因子的潜在作用。目前，人类细胞中对DNA交联损伤（ICLs）的修复机制尚未完全阐明；因此，基于本文所述分子工具所开发的技术与检测方法，有望鉴定出更多参与ICL修复的蛋白质，这些蛋白质可能成为药理学干预的靶点，从而被用于提升癌症化疗方案的疗效。

本文讨论了一种通过变性琼脂糖凝胶电泳有效评估TFO导向的质粒DNA中ICL形成的效率的方法。此外，利用含有TFO导向ICL的质粒，描述了采用改良的ChIP检测技术，在细胞环境中确定HMGB1与ICL损伤质粒结合的方法。另外，通过二维琼脂糖凝胶电泳进行超螺旋实验，建立了一种简便的方法，用于研究结构蛋白HMGB1在人细胞裂解液中对ICL损伤质粒底物引入的拓扑学改变。所述技术可用于进一步理解DNA修复蛋白和结构蛋白在人细胞中对质粒上靶向DNA损伤处理过程中的作用。

我们描述了在质粒DNA上形成TFO导向的位点特异性补骨脂素交联（ICL）的详细方案，以及后续的质粒染色质免疫沉淀（ChIP）和超螺旋检测方法，分别用于鉴定与这些损伤位点结合的蛋白质以及改变DNA拓扑结构的蛋白质。这些检测方法可进行修改，以适用于其他DNA损伤剂、TFO、质粒底物以及感兴趣的哺乳动物细胞系。事实上，我们已证明在人类基因组中每个注释基因内至少存在一个潜在的、独特的高亲和力TFO结合位点²⁶。然而，为清晰起见，本文以我们在Mukherjee & Vasquez, 2016¹⁶中所采用的实验体系为例进行说明：即在人U2OS细胞中，使用特定的补骨脂素偶联TFO（pAG30）作用于特定的突变报告质粒（pSupFG1）。

方案

1. 质粒底物上TFO导向ICL的制备

1. 在琥珀色离心管中，将等摩尔量的质粒 pSupFG1^10,11 DNA（5 µg 质粒 DNA 是一个合适的起始量）与补骨脂素偶联的 TFO AG30 在 8 µl 三链结合缓冲液 [50% 甘油，10 mM Tris (pH 7.6)，10 mM MgCl₂] 和 dH₂O 中混合，总体积为 40 µl。通过上下吹打充分混匀。将反应体系置于 37 °C 水浴中孵育 12 小时。
2. 预热 UVA 灯以确保其达到最大输出功率。将三链反应液置于石蜡膜上，并将石蜡膜放置在冰上，置于 UVA（365 nM）灯下。在灯与反应液之间放置一片 Mylar 滤光片。
3. 进行 UVA 照射，总剂量为 1.8 J/cm²。照射后将样品于 4 °C 保存以备后续使用。
   注意：进行 UVA 照射时需佩戴适当的护目镜并穿着防护服。
4. 使用限制性内切酶 EcoR1 在 20 µl 总体积中线性化 200 ng 上述制备的质粒，反应体系中包含厂家提供的 10x 缓冲液。在 65 °C 加热 20 分钟以灭活酶。在 10,000 x g 离心 10 分钟后，将样品于 4 °C 保存。
5. 配制 50x 碱性缓冲液 [1.5 M NaOH，50 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)]。将 0.5 mg 琼脂糖加入 50 ml dH₂O 中，煮沸至完全溶解，随后置于 50 °C 水浴中保温。
6. 待溶解的琼脂糖温度降至 50 °C 后，加入 1 ml 50x 碱性缓冲液，混匀后将凝胶倒入制胶槽中。在使用前于室温下静置，使凝胶充分凝固。
7. 向 20 µl 线性化 DNA 样品中加入 4 µl 0.5 M EDTA，在室温下孵育 10 分钟。
8. 向样品及 1 kb DNA ladder 中加入 6x 碱性凝胶上样缓冲液（300 mM NaOH，6 mM EDTA，18% (w/v) 高分子量多糖，0.06% 溴酚蓝溶于 dH₂O 中）。
   注意：必须使用 6x 碱性凝胶上样缓冲液，详见讨论部分。
9. 在低温室中将样品上样至凝胶，并在 1x 碱性缓冲液中以每厘米 3.2 伏特的电压电泳过夜（12–16 小时）。样品进入凝胶后，将玻璃板置于凝胶上方以防止其漂浮。
10. 将凝胶在中和缓冲液 [1 M Tris-Cl (pH 7.6)，1.5 M NaCl，3 M 醋酸钠 (pH 5.2)] 中浸泡 45 分钟，于室温下进行中和处理。
11. 在 50 ml 水中加入 4 µl 1% 溴化乙锭（EtBr），于室温下染色 1 小时。随后用清水脱色 15 分钟。使用成像系统观察 DNA。
    注意：EtBr 为强效诱变剂，可经皮肤吸收。避免与 EtBr 直接接触。

2. 在人源细胞中转染含TFO导向ICL的质粒并进行免疫沉淀

1. 接种400,000个哺乳动物细胞（例如， 每60 mm培养皿中接种U2OS骨肉瘤细胞，置于添加10%胎牛血清（FBS）但不含抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，转染前培养24小时。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。₂.
2. 转染前，将培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）在水浴中预热至 37 °C。将转染试剂恢复至室温。
3. 将30 µl转染试剂与500 µl 1x生长培养基混合（混合物1），另将2 µg TFO导向的含ICL质粒溶于500 µl 1x生长培养基中（混合物2），分别置于14 ml圆底试管中，室温孵育10分钟。
4. 将混合液1加入混合液2中，用移液器上下吹打充分混匀。室温孵育25-30分钟。
5. 用预热的 PBS 洗涤细胞两次。将转染混合物逐滴加入，均匀分布于细胞培养板中。向培养板中加入 1 ml 生长培养基，使最终体积达到 2 ml。充分混匀。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。₂ 4小时
6. 更换为 3 ml 添加 10% FBS 的生长培养基，继续培养 16 小时。不要使用抗生素。
7. 每孔加入80 µl 37%新鲜甲醛，使终浓度约为1%，室温避光孵育10分钟。
   注意：甲醛具有毒性，应根据其安全说明书进行操作。接触甲醛可能对皮肤、眼睛和呼吸道造成伤害。
8. 通过每孔加入300 µl预冷的甘氨酸（ commercially available kits 中提供）以终止甲醛交联反应，孵育5分钟。吸除培养基，用预冷的PBS洗涤两次，然后在1 ml预冷（4 °C）PBS中用刮棒刮下细胞，收集至微量离心管中。所有操作过程中样品均需置于冰上。
9. 在4 °C条件下，使用台式冷冻离心机以13,400 x g离心5 min制备细胞沉淀。用移液器吸除上清液，将细胞沉淀置于冰上。
10. 将沉淀物在1 ml预冷（4 °C）的缓冲液A（商业试剂盒中提供）中均匀重悬，冰上孵育10分钟。通过倒置离心管偶尔混匀。按前述方法离心收集细胞（见上述步骤2.9）。
11. 将沉淀物在1 ml预冷（4 °C）的缓冲液B（商业试剂盒中提供）中均匀重悬，冰上孵育10分钟，期间偶尔通过倒置混匀。离心收集细胞沉淀（同前，参见步骤2.9）。
12. 再次将细胞重悬于200 µl预冷的缓冲液B中。加入2 µl微球菌核酸酶（MNase），室温孵育10分钟。通过轻弹管壁间歇混匀反应液。将反应管置于冰上并加入EDTA至终浓度40 mM，以终止MNase反应。按前述方法离心收集细胞（见上述步骤2.9）。
13. 用含有蛋白酶抑制剂混合物的100 µl 1×染色质免疫沉淀缓冲液（ChIP缓冲液， commercially available kits中提供）重悬细胞。
14. 将重悬的细胞置于薄壁微量离心管中。将样品置于水浴超声仪中，超声处理20秒，随后冰上孵育20秒。重复此超声步骤9次，以获得约800–1,200 bp的片段。
    1. 向20 µl超声处理的样品中加入3 µl 5 M NaCl和1 µl RNase A。涡旋充分混匀，37 °C孵育30分钟。随后加入2 µl蛋白酶K，65 °C孵育2小时。使用PCR纯化试剂盒纯化样品。将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭（EtBr）显影。
       注意：所得 DNA 的最大强度应位于或低于 1,000 bp 处。
15. 在三个独立的离心管中，分别加入30 µl裂解液至预冷的硅化管中，随后加入70 µl含有蛋白酶抑制剂的预冷1×ChIP缓冲液。向各管中分别加入1 µg抗免疫球蛋白G（IgG）抗体、抗组蛋白H3抗体（作为阳性对照）或抗HMGB1抗体。在4°C冰箱中持续旋转孵育过夜。
16. 在冷室中将蛋白G磁珠充分重悬。每管加入4 µl蛋白G磁珠，于冷室中旋转孵育额外2-4小时。
17. 使用磁力架收集珠子并弃去上清液。向沉淀中加入200 µl 1× ChIP缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物），在低温室中旋转孵育5分钟进行洗涤。重复洗涤两次。
18. 用高盐 1x ChIP 缓冲液（含 70 mM NaCl）再洗涤一次。
19. 用160 µl洗脱缓冲液（ commercially available kits 中提供）重悬沉淀，37 °C旋转孵育30 min。
20. 离心沉淀珠子，并将上清液转移至新管中。加入6 µl 5 M NaCl和2 µl蛋白酶K，于65 °C孵育过夜。
21. 使用PCR产物纯化试剂盒纯化DNA，并用50 µl dH₂O洗脱DNA₂O.
22. 进行PCR¹⁶ 使用针对目标区域的引物组进行反应，并将产物在含溴化乙锭（EtBr）染色的1%琼脂糖凝胶上电泳分离。

3. 超螺旋实验与二维琼脂糖凝胶电泳

1. 配制DNA修复合成缓冲液（45 mM Hepes-KOH，pH 7.8；70 mM KCl；7.4 mM MgCl₂；0.9 mM DTT；0.4 mM EDTA；2 mM ATP，20 µM dNTPs，3.4%甘油和18 µg牛血清白蛋白）。于-80 °C保存。使用前在冰上解冻，并加入40 mM磷酸肌酸和2.5 µg肌酸磷酸激酶。
2. 配制10×超螺旋缓冲液[500 mM Tris（pH 8.0），500 mM NaCl，25 mM MgCl₂，1 mM EDTA]，室温保存。
3. 在10 µl反应体系中，使用1 µl Vaccinia拓扑异构酶I（5–15 U/µl）和1×超螺旋缓冲液，将300 ng超螺旋质粒pSupFG1 DNA完全线性化。37 °C孵育1小时。
4. 在冰上解冻HeLa无细胞提取物²⁴。向完全松弛的质粒中加入25 µl HeLa无细胞提取物和DNA修复合成缓冲液，充分混匀。再向混合物中加入额外的1 µl Vaccinia拓扑异构酶I，37 °C孵育1小时。
5. 通过加入十二烷基硫酸钠（SDS）（终浓度1%）和蛋白酶K（终浓度0.25 mg/ml）终止反应。65 °C孵育2小时。
6. 用1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液制备1%琼脂糖凝胶。加入DNA上样染料，将反应产物直接上样至凝胶，各泳道之间至少间隔4个泳道。在室温下，以1×TBE缓冲液（第一维电泳）在2 V/cm电压下电泳8–10小时，以分离拓扑异构体。
   注意：在1 L dH₂O中加入54 g Tris碱、27.5 g硼酸和20 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），配制5×TBE储存液。
7. 用含3 µg/ml氯喹-磷酸盐的1×TBE缓冲液配制2 L溶液。将凝胶浸入200 ml该溶液中20分钟。用铝箔覆盖凝胶托盘。
8. 进行第二维电泳时，将凝胶顺时针旋转90°，在含氯喹的1×TBE缓冲液中以2 V/cm电压电泳4–6小时，以分离正超螺旋和负超螺旋。
9. 将凝胶在摇床上用溴化乙锭（EtBr）染色1小时，然后用dH₂O脱色15分钟，随后使用成像仪观察拓扑异构体的热分布情况。

结果

TFO引导的ICL的形成对于基于质粒的检测至关重要，该检测用于研究结构蛋白在人类细胞ICL加工过程中的作用。变性琼脂糖凝胶电泳是一种简便的方法，可用于测定TFO引导的ICL形成的效率。携带TFO引导的ICL的质粒在琼脂糖凝胶基质中的迁移速率较慢（图1A，第3道），而未交联的对照质粒迁移较快（图1A，第2道）。对第2道和第3道条带进行密度计量定量分析（图1A）显示，约70%的质粒群体以较慢的迁移速率通过凝胶（由黑色箭头标示），表明这些质粒上已形成TFO引导的ICL。

对转染了对照质粒（P）或含有TFO导向ICL的质粒（P-ICL）的人类U2OS细胞提取物进行染色质免疫沉淀实验，结果显示，使用抗HMGB1抗体进行免疫沉淀时，与对照区域（P）相比，P-ICL区域HMGB1富集明显（图2，上图，第2和第3泳道）。这些结果表明，...

讨论

TFO导向的ICL高效形成依赖于两个关键因素：第一，适当的缓冲液成分（例如，MgCl₂）以及TFO与其靶DNA底物孵育的时间（取决于TFO与其靶双链的结合亲和力及所用浓度）；第二，适当的UVA（365 nm）照射剂量，以高效形成补骨脂素交联。通过使用HPLC或凝胶纯化的TFO可实现最佳的三链结构形成。TFO中的杂质可能产生非预期的交联产物，从而进一步复杂化实验结果。为提高共价连接5'-HMT补骨脂素的TFO的稳定性，应将TFO分装后保存于-80 °C，因为反复冻融可能导致寡核苷酸降解。在三链结构形成后，将补骨脂素靶向至特定位点（例如，5'-TA-3'和5'-AT-3'是补骨脂素交联的优选位点），补骨脂素ICL的形成需要UVA照射。体外实验中，1.8 J/cm²的UVA剂量足以在质粒上实现ICL的最佳形成。照射时间应通过光度计测定确定。根据UVA灯源的不同，除了在365 nm发射紫外线外，灯源还可能发射较短波长的光，这可能导致在整个DNA骨架中产生非预期的DNA损伤。由于TFO导向的含ICL质粒将用于研究特定位置ICL的DNA修复，此类非预期...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5'HMT 补骨脂素-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	定制订单	经 HPLC（或凝胶）纯化
Simple ChIP 酶法染色质免疫沉淀试剂盒	Cell Signaling Inc.	9003	制造商推荐方案针对染色质免疫沉淀优化，不适用于质粒免疫沉淀。对照 IgG 和 H3 抗体、Protein G 磁珠及微球菌核酸酶均由制造商提供。
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR 预混液
HMGB1 抗体	Abcam	Ab18256
Wizard 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒	Promega	A9281
氯喹二磷酸盐	Sigma	C6628-50G	用于二维琼脂糖凝胶电泳
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER 转染试剂	Genlantis	T201015
痘苗病毒拓扑异构酶 I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray 长波紫外灯	Upland, CA	B 100 AP	UVA 灯
EpiSonic 多功能生物处理器 1100	Epigentek	EQC-1100	水浴超声仪
聚酯薄膜滤膜（Mylar 滤膜）	GE Healthcare Life Sciences	80112939
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ 系统	DNA 成像系统
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-500
37% 甲醛	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	用于交联
蛋白酶 K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	细胞培养基
PBS	ThermoFisher	70013073	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	25200056	细胞培养
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	114-359	DNA 上样染料
硅化管	Fisher Scientific	02-681-320	低吸附微量离心管
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-1
硼酸	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
光度计	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA 剂量测定
细胞系
人 U2OS 骨肉瘤细胞	ATCC	ATCC HTB-96	根据供应商建议进行培养’
人宫颈腺癌 HeLa 细胞	ATCC	ATCC-CCL-2	根据供应商建议进行培养’
近端正向引物	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
近端反向引物	5′-tag tta acc gga taa ggc gcag cgg
远端正向引物	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
远端反向引物	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc