远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。
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摘要
摘要
局灶性脑缺血（即， 缺血性卒中可能导致严重的脑损伤，进而引起神经元功能显著丧失，并由此导致一系列运动和认知功能障碍。其高发病率带来了沉重的健康负担，因为卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一。1神经功能的恢复在大多数情况下仅为部分恢复。迄今为止，治疗选择非常有限，特别是由于溶栓治疗的时间窗较窄。2,3确定加速中风后恢复的方法仍是医学领域的首要目标，然而这一目标因对恢复过程的机制理解不足而受到阻碍。实验性中风研究常采用啮齿类动物的局灶性脑缺血模型。除急性期外，中风研究正日益关注脑缺血后的亚急性期和慢性期。大多数中风研究人员在小鼠或大鼠中采用大脑中动脉（MCA）的永久性或短暂性闭塞方法。在临床患者中，MCA闭塞是缺血性中风最常见的病因之一4除了使用线栓法进行大脑中动脉近端阻塞外，远端大脑中动脉的手术阻塞可能是实验性脑卒中研究中最常用的模型5远端大脑中动脉分支（位于豆纹动脉分叉以远）的闭塞通常不累及纹状体，主要影响新皮质。血管闭塞可为永久性或短暂性。该模型的主要优势在于梗死体积高度可重复，且长期预后死亡率极低。本文演示如何在矢状窦外侧行慢性颅窗（CW）制备，随后通过开颅手术在颅窗下诱导产生远端脑梗死。该方法可用于缺血后急性和慢性动态变化的连续成像观察，适用于透射照明、共聚焦激光扫描显微镜及双光子活体显微镜成像。
引言
脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一1，其致死率仅次于冠心病。此外，脑卒中也是导致长期残疾的首要原因，凸显了其巨大的社会经济影响6-8。除了急性期治疗外，探索加速和改善脑卒中后恢复的新方法和新机制仍是当前重要的医学目标7。
近几十年来，实验性卒中研究的数据极大地增进了人们对缺血所引发的复杂病理生理级联反应的理解9,10。兴奋性毒性、细胞凋亡、梗死周围去极化以及炎症已被确定为局灶性脑缺血后细胞死亡的最主要介质。此外，通过使用脑缺血动物模型，已发展并验证了若干重要概念、诊断方法和治疗策略（例如，“半暗带”和溶栓治疗）11。
实验性卒中模型的可获得性，结合无创成像技术（例如，磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描或激光散斑对比分析），使研究人员能够以纵向方式研究缺血性损伤所引发的超急性期和慢性病理生理变化12。在研究病灶动态时空演变特征的同时，还可探究类似神经可塑性的变化，并将其与功能结局及组织学发现进行关联分析。近年来，通过将脑缺血模型与经颅窗体内显微成像技术相结合，方法学上取得了进一步进展13。这些新技术使研究者能够在细胞和分子水平上分析神经血管单元，在局灶性脑缺血后的急性期、亚急性期和慢性期均具有强大的分....
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方案
伦理声明：涉及动物受试者的实验均依照德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany，批准号 G0298/13）发布的规定和指南以及适用的ARRIVE准则进行。本研究使用了10至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠。
1. 侧向慢性颅窗制备
- 使用氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行皮下注射以实施麻醉。通过疼痛刺激测试镇静程度是否充分。
- 使用70%乙醇对手术器械和手术区域进行消毒。
- 使用啮齿类动物剃毛器将从颈部到眼睛区域的头皮毛发去除。
- 将头部固定于立体定位仪框架中。
- 使用右旋泛醇眼膏涂抹双眼，以避免脱水。
- 用74.1%乙醇和10%异丙醇分三层消毒手术区域，彻底清除毛发并进行灭菌。
- 使用手术刀从颈部至眼部做正中切口。
- 用4针帐篷缝合固定皮瓣。
- 用手术刀小心刮除左侧半球的骨膜，直至颞肌起始处。
注意：此步骤还可为牙科粘合剂提供良好的粘附区域，以固定盖玻片。 - 使用微型钻头在骨瓣边缘磨薄颅骨，进行直径为4 mm的额顶骨开颅手术。钻孔过程中应用生理盐水冲洗，以避免热损伤。
- 使用套管抬起骨瓣，并用显微镊将其取出。
- 用生理盐水仔细且....
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结果
时间线和代表性结果如图所示 图2 和 3颅窗制备，在上矢状窦外侧制作一个小的颅窗（图2 B、C、D由经验丰富的外科医生操作时，该手术的死亡率和并发症发生率极低。10只动物全部存活，所有慢性窗（chronic CW）均可用于高质量成像，即使在术后28天仍可获得良好图像。未出现伤口感染或其他并发症。
由于暴露于挥发性麻醉剂的时间较短，且脑损伤轻微，所有动物在远端大脑中动脉阻塞（distal MCAo）后约10至15分钟转移至加热的恢复笼中时均已苏醒，能够在笼内自由活动，并与同窝动物互动。总体而言，远端MCAo模型的死亡率低于5%，主要由MCAo手术过程中血管损伤及继发出血所致。在远端MCAo术后28天的观察期内，死亡情况极为罕见。形态学上，可通过组织学或磁共振成像（MRI）评估病灶（图3 A, B）。此外，MRI检测可实现.......
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讨论
脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一1。除了急性期治疗外，探索加速和增强卒中后恢复的新方法与新机制仍是当前重要的医学目标7。实验性脑卒中研究常采用啮齿类动物局灶性脑缺血模型。事实上，诱导短暂性或永久性大脑中动脉闭塞（MCAo）的模型可模拟患者中最常见的局灶性脑缺血类型之一4。除大脑中动脉近端闭塞外，通过手术线栓法阻断远端大脑中动脉（distal MCAo）的模型可能是实验性脑卒中研究中应用最广泛的模型5,19。本文介绍一种永久性远端MCAo联合侧颅窗（lateral CW）植入的基本技术，该模型可在小鼠中实现长期活体显微成像。该小鼠模型的主要优势在于梗死体积高度可重复，且死亡率极低，尤其适用于长期预后研究。在此皮层卒中模型中，可通过慢性颅窗观察卒中区域及梗周区的血管结构。利用多荧光落射荧光视频显微系统，可动态观察血流动力学变化及循环细胞的募集过程。血管可通过荧光标记的大分子物质（如葡聚糖或白蛋白）进行标记显影，细胞则可通过荧光染料或遗传学模型（例如GFP阳性动物构建的骨髓嵌合体）进行标记。此外，为研究细胞间相互作用及血管外细胞的动态行为.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
VP 是由柏林夏里特医学院（Charité - Universitätsmedizin Berlin）和柏林健康研究所（Berlin Institute of Health）资助的夏里特临床科学家项目参与者。TB 是瑞士国家科学基金会（SNSF）博士后流动奖学金获得者。作者们获得了爱因斯坦基金会（EinsteinStiftung）项目编号 A-2012-153 对 PV 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双目手术显微镜 | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| 显微镜光源 | Zeiss | CL 6000 LED | |
| 带直肠探针的加热垫 | FST | 21061-10 | |
| 立体定位仪 | Kopf | Model 930 | |
| 异氟烷麻醉系统 | Draeger | ||
| 异氟烷 | Abott | ||
| Dumont #5 镊子 | FST | 11251-10 | |
| Dumont #7 镊子 | FST | 11271-30 | |
| 双极电凝镊 | Erbe | 20195-501 | |
| 双极电凝镊 | Erbe 20195-022 | ||
| 微型钻机 | FST 18000-17 | ||
| 持针器 | FST | 12010-14 | |
| 5-0 丝线缝合线 | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 丝线缝合线 | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 丝线缝合线 | Feuerstein, Suprama | ||
| 动物复苏舱 | Peco Services | V1200 |
参考文献
- Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
- Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemi....
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