侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

摘要

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。

摘要

局灶性脑缺血（即， 缺血性卒中可能导致严重的脑损伤，进而引起神经元功能显著丧失，并由此导致一系列运动和认知功能障碍。其高发病率带来了沉重的健康负担，因为卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一。¹神经功能的恢复在大多数情况下仅为部分恢复。迄今为止，治疗选择非常有限，特别是由于溶栓治疗的时间窗较窄。^2,3确定加速中风后恢复的方法仍是医学领域的首要目标，然而这一目标因对恢复过程的机制理解不足而受到阻碍。实验性中风研究常采用啮齿类动物的局灶性脑缺血模型。除急性期外，中风研究正日益关注脑缺血后的亚急性期和慢性期。大多数中风研究人员在小鼠或大鼠中采用大脑中动脉（MCA）的永久性或短暂性闭塞方法。在临床患者中，MCA闭塞是缺血性中风最常见的病因之一⁴除了使用线栓法进行大脑中动脉近端阻塞外，远端大脑中动脉的手术阻塞可能是实验性脑卒中研究中最常用的模型⁵远端大脑中动脉分支（位于豆纹动脉分叉以远）的闭塞通常不累及纹状体，主要影响新皮质。血管闭塞可为永久性或短暂性。该模型的主要优势在于梗死体积高度可重复，且长期预后死亡率极低。本文演示如何在矢状窦外侧行慢性颅窗（CW）制备，随后通过开颅手术在颅窗下诱导产生远端脑梗死。该方法可用于缺血后急性和慢性动态变化的连续成像观察，适用于透射照明、共聚焦激光扫描显微镜及双光子活体显微镜成像。

引言

脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一¹，其致死率仅次于冠心病。此外，脑卒中也是导致长期残疾的首要原因，凸显了其巨大的社会经济影响^6-8。除了急性期治疗外，探索加速和改善脑卒中后恢复的新方法和新机制仍是当前重要的医学目标⁷。

近几十年来，实验性卒中研究的数据极大地增进了人们对缺血所引发的复杂病理生理级联反应的理解^9,10。兴奋性毒性、细胞凋亡、梗死周围去极化以及炎症已被确定为局灶性脑缺血后细胞死亡的最主要介质。此外，通过使用脑缺血动物模型，已发展并验证了若干重要概念、诊断方法和治疗策略（例如，“半暗带”和溶栓治疗）¹¹。

实验性卒中模型的可获得性，结合无创成像技术（例如，磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描或激光散斑对比分析），使研究人员能够以纵向方式研究缺血性损伤所引发的超急性期和慢性病理生理变化¹²。在研究病灶动态时空演变特征的同时，还可探究类似神经可塑性的变化，并将其与功能结局及组织学发现进行关联分析。近年来，通过将脑缺血模型与经颅窗体内显微成像技术相结合，方法学上取得了进一步进展¹³。这些新技术使研究者能够在细胞和分子水平上分析神经血管单元，在局灶性脑缺血后的急性期、亚急性期和慢性期均具有强大的分析能力¹⁴。此外，对微循环动态过程的体内显微成像揭示了脑微血管功能和血管构架的新特征，具有重要的病理生理学意义^15-17。

在本实验方案中，我们介绍了如何在矢状窦旁进行慢性颅窗制备，以及如何在外窗下方手术诱导远端脑卒中。该小鼠模型可用于通过透射照明、共聚焦激光扫描显微镜和双光子活体显微镜，对局灶性脑缺血后急性期、亚急性期和慢性期的连续变化进行成像研究。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验均依照德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany，批准号 G0298/13）发布的规定和指南以及适用的ARRIVE准则进行。本研究使用了10至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠。

1. 侧向慢性颅窗制备

1. 使用氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行皮下注射以实施麻醉。通过疼痛刺激测试镇静程度是否充分。
2. 使用70%乙醇对手术器械和手术区域进行消毒。
3. 使用啮齿类动物剃毛器将从颈部到眼睛区域的头皮毛发去除。
4. 将头部固定于立体定位仪框架中。
5. 使用右旋泛醇眼膏涂抹双眼，以避免脱水。
6. 用74.1%乙醇和10%异丙醇分三层消毒手术区域，彻底清除毛发并进行灭菌。
7. 使用手术刀从颈部至眼部做正中切口。
8. 用4针帐篷缝合固定皮瓣。
9. 用手术刀小心刮除左侧半球的骨膜，直至颞肌起始处。
   注意：此步骤还可为牙科粘合剂提供良好的粘附区域，以固定盖玻片。
10. 使用微型钻头在骨瓣边缘磨薄颅骨，进行直径为4 mm的额顶骨开颅手术。钻孔过程中应用生理盐水冲洗，以避免热损伤。
11. 使用套管抬起骨瓣，并用显微镊将其取出。
12. 用生理盐水仔细且充分地进行灌洗。
13. 将牙科粘合剂混合至具有适当的稠度且不呈流动状态（即， 胶水不应再产生丝状物）。将其置于颅骨开孔周围的骨头上。
14. 将直径为6 mm的盖玻片置于制备好的胶水上，并用剩余的牙科胶固定。确保密封不漏水。用镊子测试胶水是否干燥变硬后，再进行后续操作。
    注意：额外的灌注可加速固化过程。
15. 移除悬吊缝线，并用皮肤缝线关闭切口。
16. 提起小鼠侧腹部的皮肤，将针头插入皮下，缓慢注入0.5 ml无菌生理盐水，以维持体液平衡。
17. 手术后，将动物置于加热的恢复笼中 90 分钟。需等待动物完全清醒后方可无人看护，且须待其完全恢复后，方可将其放回与其他动物共处的笼中。
18. 在约12小时后，按照步骤1.16所述重复皮下生理盐水容量补充。
19. 手术后应始终通过灌胃或直接注入口腔的方式给予镇痛药物例如， 对乙酰氨基酚（10 mg/ml）或其他非甾体抗炎药。
20. 每天术后检查动物状况，并始终将压碎的动物饲料放在培养皿中置于笼底，以方便进食，避免术后出现严重的体重下降。
    注意：颅窗制备后第一天即可进行活体显微成像。
21.  使用异氟烷麻醉并用头固定器固定动物。切开皮肤缝线，用棉签和无菌生理盐水清洁窗口。24小时后，颅窗应已充满脑脊液，此时可进行成像。采用既定的显微成像方案进行成像。¹⁸.

2. 大脑中动脉远端阻塞

注意：MCAo 手术应在颅窗制备后约 5 天进行。这样可以最大程度减少颅窗制备引起的免疫反应对脑卒中诱导的免疫反应的干扰。

图 1. 远端大脑中动脉闭塞（Distal MCAo）概览。A. 此图为手术前血管的清晰概览。B. 第一次双极电凝接触后的血管状态。C. 第二次双极电凝接触后的血管状态。D. 血管现已完全闭合的概览图像。E. 低倍镜下的最终概览图像。请点击此处查看该图的高清大图。

1. 使用麻醉面罩和适当的麻醉方案，在兽医人员的指导下对小鼠进行麻醉（例如， 使用1.5–2%异氟烷进行诱导，1.0–1.5%异氟烷维持，混合气体为2/3 N₂₂O 和 1/3 O₂ 通过 一种汽化器）。
2. 剃除毛发并使用适当的试剂对皮肤及周围毛发进行消毒例如， 70% 乙醇），然后干燥。
3. 保持小鼠体温在 36.5 °C ± 0.5 °C 手术过程中，建议使用根据小鼠直肠温度反馈控制的加热垫进行加热。
4. 将动物置于侧卧位。将鼻部固定于麻醉面罩中，并调节异氟烷浓度至1.0 - 1.5%。
5. 将湿性软膏（dexpanthenol）涂抹于双眼。
6. 使用为CW制备所作的皮肤切口。
7. 轻轻分离皮肤，辨认下方的颞肌。
8. 调节高频发生器的能量（5 - 7 W），并使用双极模式。
9. 使用电凝镊小心地将颞肌从颅骨上剥离，形成肌瓣，但不要完全移除肌肉。
10. 在颞区前部、眶后窦背侧的透明颅骨下方识别大脑中动脉（MCA）。若无法识别大脑中动脉的分叉处，则尝试识别最靠前的血管。
11. 使用微型钻头在持续灌注冷却液以避免热损伤的同时，对大脑中动脉分支上方的颅骨进行减薄处理。
12. 用套管提起骨骼，并用显微镊将其移除。
13. 将高频发生器的能量降低至 3 - 5 W。
14. 从上方接近动脉，用双极镊子轻轻接触血管两侧，但不要抬起血管。
15. 在血管分叉的近端和远端结扎动脉。
16. 等待30秒，然后轻轻触碰动脉，以确认血流已永久阻断。若观察到再通现象，需重复电凝操作。
17. 若可能，用1至2针缝合颞肌至其附着点，以覆盖骨缺损区域。
18. 缝合伤口，并将动物放入加热的恢复箱中。通常情况下，动物在挥发性麻醉后可迅速恢复。
19. 对于容量替代，按照步骤1.16所述，皮下注射0.5 ml无菌生理盐水。
20. 术后，将动物置于加热的恢复笼中静置90分钟。需待动物完全清醒后方可离开监护。只有在动物完全恢复后，才可将其放回与其他动物共处的笼中。
21. 在12小时后，按照步骤1.16所述重复进行体积替换。
22. 应用术后镇痛 通过 饮用水（例如， 对乙酰氨基酚（10 mg/ml）或其他非甾体抗炎药。
23. 每天术后检查动物的健康状况。将软化的动物饲料放在培养皿中置于地面，以方便进食并减少术后体重下降。

3. 假手术处理

1. 除不凝闭暴露的中动脉外，其余所有操作步骤均与上述第1步和第2步完全相同，包括CW的制备。

结果

时间线和代表性结果如图所示 图2 和 3颅窗制备，在上矢状窦外侧制作一个小的颅窗（图2 B、C、D由经验丰富的外科医生操作时，该手术的死亡率和并发症发生率极低。10只动物全部存活，所有慢性窗（chronic CW）均可用于高质量成像，即使在术后28天仍可获得良好图像。未出现伤口感染或其他并发症。

由于暴露于挥发性麻醉剂的时间较短，且脑损伤轻微，所有动物在远端大脑中动脉阻塞（distal MCAo）后约10至15分钟转移至加热的恢复笼中时均已苏醒，能够在笼内自由活动，并与同窝动物互动。总体而言，远端MCAo模型的死亡率低于5%，主要由MCAo手术过程中血管损伤及继发出血所致。在远端MCAo术后28天的观察期内，死亡情况极为罕见。形态学上，可通过组织学或磁共振成像（MRI）评估病灶（图3 A, B）。此外，MRI检测可实现...

讨论

脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一¹。除了急性期治疗外，探索加速和增强卒中后恢复的新方法与新机制仍是当前重要的医学目标⁷。实验性脑卒中研究常采用啮齿类动物局灶性脑缺血模型。事实上，诱导短暂性或永久性大脑中动脉闭塞（MCAo）的模型可模拟患者中最常见的局灶性脑缺血类型之一⁴。除大脑中动脉近端闭塞外，通过手术线栓法阻断远端大脑中动脉（distal MCAo）的模型可能是实验性脑卒中研究中应用最广泛的模型^5,19。本文介绍一种永久性远端MCAo联合侧颅窗（lateral CW）植入的基本技术，该模型可在小鼠中实现长期活体显微成像。该小鼠模型的主要优势在于梗死体积高度可重复，且死亡率极低，尤其适用于长期预后研究。在此皮层卒中模型中，可通过慢性颅窗观察卒中区域及梗周区的血管结构。利用多荧光落射荧光视频显微系统，可动态观察血流动力学变化及循环细胞的募集过程。血管可通过荧光标记的大分子物质（如葡聚糖或白蛋白）进行标记显影，细胞则可通过荧光染料或遗传学模型（例如GFP阳性动物构建的骨髓嵌合体）进行标记。此外，为研究细胞间相互作用及血管外细胞的动态行为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双目手术显微镜	Zeiss	Stemi 2000 C
显微镜光源	Zeiss	CL 6000 LED
带直肠探针的加热垫	FST	21061-10
立体定位仪	Kopf	Model 930
异氟烷麻醉系统	Draeger
异氟烷	Abott
Dumont #5 镊子	FST	11251-10
Dumont #7 镊子	FST	11271-30
双极电凝镊	Erbe	20195-501
双极电凝镊	Erbe                              20195-022
微型钻机	FST                              18000-17
持针器	FST	12010-14
5-0 丝线缝合线	Feuerstein, Suprama
7-0 丝线缝合线	Feuerstein,Suprama
8-0 丝线缝合线	Feuerstein, Suprama
动物复苏舱	Peco Services	V1200