光控物质是研究信号通路的有力工具。为了拓展可能的实验范围，我们开发了一种利用流式细胞术实时研究光控物质的装置：LED Thermo Flow。
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摘要
摘要
光遗传学工具能够对复杂信号通路中的几乎任何信号分子进行分离且功能性的研究。主要障碍在于如何将光精确地递送至细胞样本，因此目前光遗传学研究中最常用的工具是基于显微镜的细胞分析方法 体外 实验。流式细胞仪相较于显微镜具有显著优势，包括能够以单细胞分辨率快速检测成千上万个细胞。然而，流式细胞仪在光遗传学领域尚未得到广泛应用。本文介绍一种结合光遗传学与流式细胞术强大功能的装置：LED Thermo Flow。该装置可在流式细胞检测过程中，以特定波长、光强和温度对细胞进行照射。该设备成本低廉，且可与大多数常见的流式细胞仪兼容。为展示其应用价值，我们表征了Dronpa蛋白的光开关动力学 体内 并且能够实时进行。该方案几乎可适用于所有光学可控物质，显著拓展了可能开展的实验范围。更重要的是，它将极大简化新型光遗传学工具的发现与开发过程。
引言
光遗传学工具的受欢迎程度日益提高，部分原因在于它们可用于解析信号通路的连接方式1-4。这些工具基于光可激活蛋白在光照下改变其构象和结合亲和力的能力。将这些蛋白与信号元件融合，可实现对复杂细胞内信号通路中某一特定组分的精确调控5-12。因此，能够以高时间分辨率和空间分辨率研究信号通路。
大多数基于细胞的光遗传学研究采用基于显微镜的方法，结合在光照条件下进行细胞培养，随后进行生物化学分析11,12。相比之下，流式细胞仪通过毛细管将细胞逐一分离，并测量细胞大小、颗粒度和荧光强度。与显微镜或生物化学方法相比，该方法具有显著优势，包括能够在极短时间内以单细胞分辨率分析数千个活细胞。因此，将光遗传学与流式细胞术相结合具有重要意义。
据我们所知，目前尚无针对光遗传学流式细胞术的既定方案。一种被广泛接受的方法是使用手电筒类设备从反应管外部手动照射细胞。然而，在流式细胞仪中进行手动照明时，光线需穿过反应管，而对于活细胞成像，还需穿过圆柱形的加热水浴腔室。这会导致显著的光散射和光强损失。此外，手动照明所提供的光照强度在不同实验之间难以重复（如角度、距离等）， 等等。）且单次实验中的波长数量存在实际限制。
通过构建LED热流装置，我们能够克服这些限制。使用该装置，可在流式细胞术检测过程中以受控温度条件对细胞进行特定波长的光照，从而实现在单次实验内以及不同实验间精确且可重复的光照剂量控制。
为了展示我们设备的实用性 体内我们记录了Dronpa在Ramos B细胞光转换过程中的荧光信号。Ramos B细胞来源于人类伯基特淋巴瘤。Dronpa是一种可形成单体、二聚体或四聚体的荧光蛋白。在其单体形式下，Dronpa不具荧光。用400 nm光照可诱导其发生二聚化和四聚化，从而使Dronpa蛋白产生荧光。该过程可通过500 nm光照逆转。Dronpa蛋白已被用于调控信号蛋白的功能与定位4,13.
本研究中，我们在Ramos B细胞中表达了Dronpa-Linker-Dronpa蛋白，以在流式细胞仪中研究Dronpa的光致变色特性。利用我们的装置，能够在实时记录其荧光强度的同时，高效且可重复地实现Dronpa的光致变色。该方法相较于目前依赖人工照明的光照方案具有显著优势，极大地拓展了光遗传学工具和笼锁化合物的实验应用范围。使用本装置将显著简化并加速新型光遗传学工具的发现与开发过程。
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方案
1. 设计与构建装置
- 预实验
注意：特定光遗传学工具和细胞类型所需的光强可能差异显著。使用原型进行预实验有助于估算所需的最低光强度。以下实验所用的光遗传学工具为 Dronpa-Linker-Dronpa 融合构建体。Dronpa 序列通过商业途径获得（见材料清单）。在两个 Dronpa 序列之间克隆了一个长连接子，以使表达的构建体能够形成分子内（和分子间）二聚体。以下描述的步骤可适用于其他多种光遗传学工具或光控物质。- 使用包装细胞产生的含逆转录病毒的上清液，按照制造商的转导说明，将 Ramos B 淋巴细胞转导含有 Dronpa-Linker-Dronpa 的构建体。根据先前发表的方案13收集并计数细胞。
- 将细胞重悬于培养基中（RPMI 1640，10% 热灭活 FCS，2 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素，50 µM 2-巯基乙醇），浓度为 1 × 106/mL，并转移至玻璃 FACS 管中。
- 将管插入流式细胞仪，测量 Dronpa 的荧光强度（GFP 通道）14,15。
- 在后续所有步骤中佩戴防护眼镜，以保护眼睛免受可能有害波长的损伤。
- 手动将一个 500 nm LED 光源置于管外侧，继续测量 Dronpa 的荧光强度。
- 增加 LED 光源的数量和/或强度，直至 Dronpa 荧光强度下降。
- 手动将一个 400 nm LED 光源置于管外侧，继续测量 Dronpa 的荧光强度。
- 增加 LED 光源的数量和/或强度，直至 Dronpa 荧光强度回升。
- 在构建装置时，使用的 LED 数量应不少于步骤 1.1.5 和 1.1.7 中光开关实验预测所需的数量。
- 装置的构建
注意：该装置由弗莱堡大学的 Arbeitsgruppe Technik 专业加工车间制造。大多数部件为定制，非市售产品。各部件的精确尺寸如图 1和图 2所示。为阐明该装置的组装过程，提供了补充视频 1，并在下文描述了最关键的步骤。- 使用聚氯乙烯（PVC）材料铣削出 A 部件，尺寸需与图 1A所示完全一致。
- 将 LED 灯插入 A 部件的钻孔中，并用 PVC 胶密封每个孔，以防止漏水。
- 将 LED 连接到一个多通道变压器（每种波长应占用独立通道），输出功率可调范围为 0–29 mA。
- 如图所示，用 3 颗螺钉将外护套（B）固定在 A 部件上，以保护 LED 免受物理损伤。
- 为使装置能够连接水泵，使用 PVC 胶将管夹（C）粘入 A 部件的钻孔中（如图 1a所示，横截面 Y：9 mm 和 61.5 mm）。
- 截取一段长度为 58.5 mm 的有机玻璃管（D1）。
- 按照图 2所示，由有机玻璃加工制造 D2 和 D3 部件。
- 用有机玻璃胶将 D3 部件粘接至 D1 底部。
- 在 D2 部件上安装橡胶 O 形圈，并用有机玻璃胶将其粘接至 D1 顶部。
注意：D1、D2 和 D3 部件共同组成 D 部件。 - 用 3 颗螺钉将 D 部件插入 A 部件中。
- 在向变压器供电前，测试装置是否漏水。
2. 测量光遗传学工具的动力学
- 准备细胞
- 将Ramos B细胞在RPMI培养基（RPMI 1640，10%热灭活FCS，2 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，50 µM 2-巯基乙醇）中培养，细胞密度为3-10 × 106 个细胞/mL，培养条件为37 °C、5% CO2。
- 以350 × g离心力、4 °C离心5分钟，收集Ramos B细胞。
- 按照制造商说明，使用Neubauer计数板对细胞进行计数，并将1-5 × 106 个细胞重悬于600 µL培养基中。
- 将细胞转移至玻璃FACS管中，置于冰上，并避光保存直至检测。
- 准备流式细胞仪和设备。
- 将设备连接至加热水泵，并将温度调节至37 °C。
- 当使用玻璃FACS管时，需将流式细胞仪的黑色O型圈更换为橡胶O型圈，并额外涂抹硅脂。
- 检测
- 小心将玻璃FACS管插入设备中，并连接至流式细胞仪（图3）。
- 开始检测，记录Dronpa荧光强度（GFP通道）。
- 分别用400 nm或500 nm光照射细胞样品，并记录Dronpa荧光强度（GFP通道）。
- 数据分析
- 使用合适的流式细胞仪软件分析实验数据。绘制前向散射光与侧向散射光图，圈选活细胞群体，并绘制Dronpa荧光强度随时间变化的曲线。
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结果
使用 LED 热流与流式细胞仪
该装置的功能核心是一个圆柱形腔室，其内壁呈环形排列着向内发光的LED灯。该腔室可连接水源和水泵，从而实现对LED以及细胞样品的温度控制。LED连接至变压器，因此每种波长的光强均可独立调节。装置中心可容纳标准尺寸的FACS管，可适配大多数标准流式细胞仪（图4 和 图5）。为证明本装置中的光照不会导致细胞发生非预期的升温，我们对三种不同波长光照下的PBS溶液温度随时间的变化进行了测量（图6）。使用360 nm、400 nm或500 nm光照时，仅引起微小的温度升高。总体而言，本文所介绍的装置可实现对温度可控的细胞样品进行可重复的光照，并可用于流式细胞仪检测。
Dronpa的光控开关
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讨论
LED Thermo Flow 是一种创新设备，可用于在流式细胞仪中研究光遗传学工具。
迄今为止，光遗传学样本仅使用显微镜激光器或手电筒装置进行 illumination11,12。根据手电筒与样本之间的角度和距离不同，不同实验间的光照强度可能存在显著差异。此外，单个实验者能够操作的手电筒数量也有限，这限制了实验的多样性和可重复性。在开发本装置的过程中，我们解决了上述局限性，该装置可用于表征活细胞中光敏开关的实时动力学。据我们所知，目前尚无类似的可比装置。
在当前配置下，一个 Thermo Flow 腔室最多可集成 30 个 LED。因此，根据每种波长所需的光强，单个设备可用于多种光遗传学工具。已建立的光控切换方案可进一步优化以实现功能性检测，例如钙离子流测定。本设备也可能适用于其他光控物质，如笼锁化合物或光激活荧光探针。
根据具体的科学问题和所用样本，可快速建立个性化的实验方案。建议使用玻璃管而非聚苯乙烯或聚丙烯管，以减少400–...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢弗莱堡大学的 J. Schmidt 设计了该设备。感谢 P. Nielsen 和 D. Medgyesi 对本研究的支持以及对本文稿的审阅。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）通过 SFB746 项目以及德国研究基金会卓越计划（GSC-4，斯佩曼研究生院）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃FACS管 | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | 硼硅酸盐玻璃管 12x75 mm |
| 流式细胞仪 | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | 特殊订单 |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯管 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC 瓦片 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC 瓦片 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC 块 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-巯基乙醇 | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| 青霉素/链霉素 (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix 聚甲基丙烯酸甲酯胶水 | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U 胶水 | Henkel, Düsseldorf, Germany |
参考文献
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