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Summary

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Abstract

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Introduction

光遗传学工具已日益普及，部分是因为它们可用于破译信号通路^1-4的布线。它们是基于可光活化的蛋白质当与光照射改变其构象和结合​​亲和力的能力。融合这些蛋白质信令元素允许单个玩家的复杂细胞内信号通路^5-12内的特定调节。因此，信号传导途径可以以高时空分辨率进行研究。

大多数基于细胞的光遗传学研究利用基于显微镜的方法，在光的存在下培养相结合，随后通过生物化学分析^11,12。与此相反，一个流式细胞singularizes细胞沿着毛细管并测量细胞大小，粒度和荧光强度。这种方法具有在显微镜或生物化学方法主要优点，包括分析thousan的能力家里单细胞分辨率的细胞在非常短的时间的DS。因此，理想的是光遗传学流式细胞仪结合。

据我们所知，有一个光遗传学流式细胞仪没有既定的协议。一个被广泛接受的过程是从手电筒设备反应管外手动点亮照明单元。然而，在流动手册照明仪要求光通过反应管，并用于活细胞成像，圆柱形，加热的水室中。这会导致大量的光散射和光的损失。此外，通过手动照明提供的光强度不实验（角度，距离， 等等 ）之间的可再现的和有一个实际的限制，以波长的数量在一项实验。

通过构造该LED热流量设备，我们能够克服这些限制。与此设备中，细胞可以在一个临时的特定波长照射erature控制在流式细胞仪的测量方式。这使得在与实验之间的精确和可重复的光量。

为了证明我们的体内装置的效用，我们在光控记录在拉莫斯B细胞Dronpa的荧光信号。拉莫斯B细胞是从人Burkitt淋巴瘤的。 Dronpa是存在作为单体，二聚体或四聚体的荧光蛋白质。在它的单体形式，它是无荧光的。照明用400纳米的光诱导二聚和四聚并呈现Dronpa蛋白荧光。这个过程可以通过用500nm的光照射可以相反。该Dronpa蛋白已被用于控制信号蛋白^4,13的功能和位置。

在此，我们表示拉莫斯B细胞Dronpa连接子Dronpa蛋白研究Dronpa光控的在流式细胞仪。使用我们的装置中，我们能够有效地和重复性光控Dronpa同时记录实时荧光强度。这种方法比用人工照明照度当前的协议提供了巨大的优势和显著扩大了光遗传学工具和笼化合物的实验剧目。使用我们的设备将显著简化并加速的新颖光遗传学工具的发现和开发。

Protocol

1.设计和建造设备

1. 试点实验
   注:为特定的光遗传学工具和细胞类型所需要的光照强度可能会有所不同显著。与原型试点实验是估计所需的最低光照强度是有用的。用于以下实验的光遗传学工具是Dronpa – 接头 – Dronpa融合构建。从商业上获得Dronpa序列（参见材料清单）。长接头克隆两个Dronpa序列之间，以允许表达构建体，以形成分子内（分子间）二聚体。下面描述的步骤可以适于许多其它光遗传学工具或光控制物质。
   1. 转导拉莫斯B淋巴细胞与使用含逆转录病毒的上清液从包装细胞按照制造商的转导的指令的Dronpa – 接头 – Dronpa含有构建体。采收和计数细胞根据预先viously发布的协议^13。
   2. 重悬的细胞以浓度1×10 ⁶ / mL的培养基（RPMI 1640,10％热灭活的FCS，2mM的L-谷氨酰胺，100U / mL青霉素，100U / mL链霉素，和50μM2-巯基乙醇）并把它们转移到一个玻璃试管FACS。
   3. 插入管插入流式细胞仪和测量Dronpa（GFP通道^）14,15的荧光强度。
   4. 穿所有进一步的措施防护眼镜，以保护眼睛免受可能会损坏波长。
   5. 手动放置在管的外侧上的500nm的LED光，并继续测量Dronpa的荧光强度。
   6. 增加LED灯的数量和/或强度，直到Dronpa荧光强度降低。
   7. 手动放置在管的外侧上的400nm的LED光，并继续测量Dronpa的荧光强度。
   8. 增加LED灯的数量和/或强度，直到Dronpa FLUOrescence强度增大。
   9. 至少使用尽可能多的LED灯作为预测是必要的步骤1.1.5和1.1.7的建设光控设备。
2. 建筑设备
   注:该设备是由一个专业的机械加工车间，Arbeitsgruppe技术公司从弗莱堡大学建成。大部分地区都是定制的，而不是商业化。各部分的精确的尺寸在图1和2中描绘。为了澄清本装置的组装，补充视频1被提供并最本质的步骤如下所述。
   1. 磨片A从聚氯乙烯（PVC），与图1A中所示的精确的测量。
   2. 将LED灯成片A的钻孔和密封用PVC胶水每孔防止水的渗漏。
   3. 连接LED的多通道转换器（每个波长应该占据一个独立的陈荫罴EL）与0-29毫安的可调输出功率。
   4. 附加的外鞘（B）和3螺钉片A如所描绘，以保护LED不受物理损坏。
   5. 为了能够将设备连接到一个水泵，胶水在管夹（C）的成片A的钻孔（ 图1a所描述的，交叉部Y为9mm 61.5 MM）使用PVC胶水。
   6. 削减58.5毫米长的有机玻璃管（D1）。
   7. 从有机玻璃制造件D2和D3， 如图2中所描绘。
   8. 胶块D3至D1的底部有机玻璃胶水。
   9. 附加橡胶O型圈到一块D2，它胶水D1的顶部，有机玻璃胶水。
      注:作品D1，D2和D3一起形成片D.
   10. 插入件d成片带3个螺丝。
   11. 测试之前，将电源变压器渗漏水的设备。

2.测量的光遗传学工具的动力学研究

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准备细胞

1. 培养拉莫斯B细胞在RPMI培养基（RPMI 1640,10％热灭活的FCS，2mM的L-谷氨酰胺，100U / mL青霉素，100U / mL链霉素，和50μM2-巯基乙醇）中的3-密度10×10 ^6个细胞/ mL，在37℃和5％的CO _2。
2. 收获拉莫斯B细胞通过离心在350 XG和4℃5分钟。
3. 算使用Neubauer计数室按照制造商的指示细胞，重悬1-5×10 ^6个细胞在600微升培养基。
4. 转移细胞的玻璃FACS管，把它们放在冰和保护他们免受光直到测量。

制备流式细胞仪和设备。

1. 将设备连接到一个加热的水泵和调节温度至37℃。
2. 当使用玻璃FACS管，更换流通的黑色O型圈仪用橡胶O型圈和额外使用硅GR缓解。

测量

1. 小心地将玻璃FACS管进入设备，并将其连接到流式细胞仪（ 图3）流动。
2. 开始测量，并记录Dronpa荧光强度（GFP通道）。
3. 分别照亮为400nm或500nm的光的细胞样品，并记录Dronpa荧光强度（GFP通道）。

数据分析

1. 分析用合适的流式细胞仪软件的实验数据。对侧向散射和门活细胞情节前向散射。绘制随着时间的推移Dronpa荧光强度。

Representative Results

Discussion

LED的热流量是一个创新的设备，研究光遗传学工具在流式细胞仪。

到目前为止，光遗传学样品已经只能用显微镜激光或闪光装置^11,12照明。根据不同的手电筒与样品的角度和距离，在光照的量实质性变性实验之间的预期。此外，存在于手电筒一个人可以在实验操作的数目的限制。这限制了实验剧目和重现性。这些限制我们的装置，该装置可用于在活细胞中表征实时光控动力学的发展过程中进行了讨论。据我们所知，没有类似的设备存在。

在当前的配置，多达30个LED可以被做成热流室。因此，根据所要求的光强度对每个波长，单个设备可以是我们编为各种各样的光遗传学工具。该光控建立协议可以被用于功能读数， 如钙通量测量优化。我们的设备可以适用于其他光控制物质，如笼化合物或光活化荧光团。

根据科学问题和使用试样，个性化协议可以迅速建立。使用玻璃试管代替聚苯乙烯或聚丙烯管的建议在400-500纳米之间的波长，以限制光诱导的细胞毒性。所有测试的细胞系存活照度（360纳米，400纳米或500纳米），用于在玻璃管长达一小时。我们试图通过执行转移实验来研究细胞死亡的塑料管照明中的原因。我们照亮在PBS或RPMI细胞用不同波长的光，然后转移上清至非照射细胞来测量细胞死亡。所收集的无上清液在受体细胞引起显著的细胞死亡（数据未显示）。另外，照射的PBS在聚苯乙烯或聚丙烯管中的温度几乎是相同的在玻璃管中的温度。因此，我们只能推测细胞死亡的原因。照亮塑料可以释放出波长是毒性细胞的不稳定物质或辐射。

介质的用于每个实验的选择是重要的。缓冲能力必须考虑和不同的试剂，如pH指示剂，吸收不同波长的程度不同。此外，比较自由FCS的时到含有FCS的培养基的细胞存活显著不同，例如，。

光滴定的目标是使用必要的最大光控光的最小量。对于大多数实验中，这是有利的最大化光电开关的速度，从而最大程度地光强。但是，根据不同的waveleNGTH和细胞类型，光可以具有在所述信令行为，这就是为什么过度照明应避免直接的影响。

有可能对我们的装置的光的时间表编程和将它连接到一台计算机为其他光装置普遍。然而，由于大多数流式细胞仪是由许多不同的实验室共同的工作场所时，最好保持装置小巧便携越好。此外，我们对这里所提出的两颜色设置设备的手工操作就是这么简单，那将编程仅略有提高实验过程。

总之，我们在这里提出了一个创新的设备，它结合了光遗传学工具的力量和流式细胞仪。这将大大简化在体内的表征和光遗传学工具的开发和拓展，实验剧目。

Materials

Glass FACS tube	Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA	14-961-26	Borosilicate glass tubes 12×75 mm
Flow Cytometer	BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany	Fortessa II	Special Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N	Addgene; Cambridge, USA	41645
PolyJet	SignaGen, Rockville, USA	SL100688
LED 505 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	HLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	UV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mm	Maertin; Freiburg, Germany	76999
Plexiglas 3 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692230
Plexiglas 2.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692225
Plexiglas 1.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692215
PVC tile 5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.005
PVC tile 6 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.006
PVC block 50 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.050
RPMI	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	61870-010
2-Mercaptoethanol	EMD; Germany	805740
FCS	PAN Biotech; Aidenbach, Germany	P30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	15140-122
Acrifix plexiglas glue	Evonic industries, Essen, Germany	1R0192
Tangit PVC-U glue	Henkel, Düsseldorf, Germany