方法文章

一种B族链球菌的小鼠模型 链球菌 阴道定植

DOI:

10.3791/54708

2016年11月16日

本文内容

摘要

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本实验方案的目的是模拟人类B组 链球菌属 在小鼠模型中研究无乳链球菌(GBS)的阴道定植。该方法可用于探究宿主免疫反应及细菌因素在GBS阴道持续定植中的作用,也可用于评估治疗策略。

摘要

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无乳链球菌 (B组 链球菌,B群链球菌(GBS)是一种革兰氏阳性菌,可无症状定植于10%至30%成年人的胃肠道及阴道。在免疫功能低下的人群中,包括新生儿、孕妇和老年人,GBS可转变为侵袭性病原体,引发败血症、关节炎、肺炎和脑膜炎。由于GBS是导致新生儿感染的主要细菌性病原体,目前的预防措施包括在妊娠晚期对孕妇进行阴道GBS定植筛查,并对GBS阳性的母亲在围产期给予抗生素治疗。较高的阴道GBS载量是新生儿感染和定植的危险因素。然而,目前对促进或允许GBS在阴道定植的宿主与细菌因素仍知之甚少。本实验方案描述了一种通过单次β-雌二醇预处理建立持续性GBS阴道定植的小鼠模型,并结合每日取样以测定细菌负荷。该方案还详细说明了如何施加其他干预性治疗或感兴趣试剂,以及如何采集阴道灌洗液和生殖道组织。该小鼠模型将有助于深入理解GBS与宿主在阴道微环境中的相互作用,从而为妊娠期间控制母体阴道定植及防止向易感新生儿传播提供潜在的治疗靶点。此外,该模型也有助于增进对女性阴道道中细菌与宿主相互作用的普遍机制的理解。

引言

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无乳链球菌,B组 链球菌 (GBS)是一种有荚膜的革兰氏阳性细菌,常从健康成人的肠道和泌尿生殖道中分离得到。20世纪70年代,GBS成为新生儿感染性死亡的首要病原体,每年导致超过7,000例新生儿疾病。1早发性B族链球菌病(EOD)发生于出生后的最初数小时至数天内,常表现为肺炎或呼吸窘迫,并易发展为败血症;而晚发性B族链球菌病(LOD)则在出生数月后发生,以菌血症为主要表现,且常进展为脑膜炎2截至2002年,美国疾病控制与预防中心建议在妊娠晚期对B族链球菌(GBS)阴道定植进行普遍筛查,并对GBS检测阳性孕妇在分娩期间实施抗生素预防性治疗(IAP)。1尽管由于产时抗生素预防(IAP)的实施,美国早发型B族链球菌病的年发病率已降至约1,000例,但B族链球菌(GBS)仍是早发型新生儿败血症的首要病因,且对晚发型感染的发生率并无影响1无论是在宫内、分娩期间,还是迟发性病例中,新生儿暴露于B族链球菌(GBS)均需经历在多种宿主环境与屏障中的存活与穿越、免疫逃逸,而在脑膜炎病例中,还需穿越高度调控的血脑屏障。2在新生儿发生这些致病性相互作用之前,首先是母体阴道部位的初始定植。在发达国家和发展中国家,母体B族链球菌(GBS)阴道定植率介于8%至18%之间,平均定植率估计为12.7%3,4孕妇阴道道中GBS的定植可能表现为持续性、间歇性或一过性5有趣的是,....

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方案

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所有动物实验均经圣地亚哥州立大学实验动物护理办公室批准,并在公认的兽医标准下进行。本方法的建立使用了8至16周龄的雌性小鼠。

1. β-雌二醇的制备与腹腔注射

  1. 佩戴适当的个人防护装备(PPE)后,用称量纸称取β-雌二醇(0.5 mg/只小鼠)。注意: β-雌二醇可通过皮肤和黏膜表面吸收。
  2. 将β-雌二醇转移至15 ml锥形管中,涡旋振荡至无结块,使β-雌二醇呈细粉状。用10 ml注射器吸取芝麻油(100 µl/只小鼠)。使用0.45 µm滤器将芝麻油经注射器滤入含有β-雌二醇的15 ml锥形管中。涡旋振荡15 ml锥形管,直至β-雌二醇在芝麻油中形成均匀的混悬液。
  3. 用一支新的10 ml注射器吸取β-雌二醇混悬液。使用18 G、1英寸针头,将混悬液分装至1 ml结核菌素注射器中,每管100 µl。为每只小鼠准备一支注射器。为每支结核菌素注射器安装一支新的无菌26 G、½英寸针头。
  4. 在细菌接种前24小时,向每只小鼠腹腔注射含于100 µl芝麻油中的0.5 mg β-雌二醇(5 mg/ml)。注射部位位于下腹部象限,沿腹中线偏右或偏左,操作方法如前所述28
    注:注射部位无需清洁或剪毛。

2. 使用B族链球菌进行阴道接种

  1. 接种前一天,在Todd Hewitt肉汤(THB)中于37 ....

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结果

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在建立该模型的过程中,对影响无乳链球菌(GBS)阴道定植持续时间的多种因素进行了观察。为了确定接种时动情周期阶段对GBS细菌持续性的影响,通过阴道灌洗液对小鼠在接种当天的动情周期进行分期。图1展示了根据湿片法阴道灌洗液所确定的小鼠动情周期的四个阶段,这是一种已被广泛认可的方法29。根据初始动情周期阶段将小鼠分组,并通过阴道拭子随时间监测GBS的持续存在情况。在动情前期(proestrus)接种的小鼠,其GBS定植时间显著长于其他动情阶段的小鼠,尤其是与接种时处于动情间期(diestrus)的小鼠相比(图2)。基于这些结果,在当前的模型中,小鼠于GBS接种前一天接受β-雌二醇处理,以使其同步进入动情前期。

其他小鼠生殖道感染模型表明,当小鼠通过外源性雌二醇处理维持在动情期时,病原体持续存在的能力增强30,31。为了确定在阴道定植GBS期间是否也.......

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讨论

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为了进一步推动对B族链球菌(GBS)在宿主环境中与宿主及其他微生物相互作用的理解,需要建立动物模型。本研究描述了在小鼠中建立GBS阴道定植的技术细节。该方案可在不使用麻醉剂接种细菌或采集拭子样本、不使用免疫抑制剂促进定植、不进行阴道预冲洗、也不添加增稠剂的情况下,实现超过>90%的小鼠定植率。此外,该模型具有良好的可重复性,在GBS持续时间及细菌负荷方面,不同实验间的变异程度较小。本研究中展示的代表性结果来自多个独立实验的汇总,可为未来实验设计提供参考;然而,在不同GBS菌株和小鼠品系之间进行直接比较时应谨慎对待。

该模型模拟了人类的定植过程,因为小鼠的黏膜阴道B族链球菌(GBS)定植似乎仅局限于生殖道。尽管已观察到多种GBS菌株可上行至宫颈和子宫25,但小鼠即使在定植数月后也未表现出发病或死亡的迹象。此外,根据所研究的GBS菌株和小鼠品系不同,小鼠表现出持续性或一过性的阴道定植,这分别有助于研究细菌因素和宿主免疫应答。在此模型中,部分小鼠表现出间歇性定植;目前尚不清楚这些小鼠是否在后期时间点被重新定植,还是定植水平在某些时间点降至检测限以下(通常为5.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢圣地亚哥州立大学动物实验中心的负责人及工作人员在动物饲养方面提供的支持。在本研究工作期间,K.A.P. 获得了 ARCS 奖学金以及稻盛基金会奖学金的资助。K.S.D. 获得了美国国立卫生研究院 R01 项目(项目编号:NS051247)的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
芝麻油 Sigma AldrichS3547-250ML
β-雌二醇 Sigma AldrichE8875-1G注意:佩戴适当的个人防护装备。β-雌二醇可通过皮肤和黏膜表面吸收。 
200 μl 凝胶上样吸头 USA Scientific1252-0610
泌尿生殖道无菌海藻酸钙拭子Puritan25-801 A 50
CHROMagar B族链球菌培养基DRG InternationalSB282
Todd Hewitt 液体培养基Hardy Diagnostics7161C
18 G,1.5 英寸针头BD305199
26 G,0.5 英寸针头BD305111
10 ml 注射器BD309604
1 ml 注射器BD309659
0.45 μm PVDF 注射式滤器Whatman6900-2504
杜氏磷酸盐缓冲液(1×)Corning21-031-CV

参考文献

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  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understan....

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重印与许可

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GBS CFU

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