利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

摘要

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外 通过RNA-seq构建模型，并建立基于qRT-PCR的方法以验证候选基因。

摘要

药物耐药性在血液系统恶性肿瘤和实体瘤的癌症治疗中仍然是一个主要难题。内在或获得性耐药可由多种机制引起，包括药物清除增加、药物摄取减少、药物失活以及药物靶点的改变。近期研究表明，除了已知的遗传学（突变、扩增）和表观遗传学（DNA高甲基化、组蛋白翻译后修饰）改变外，药物耐药机制还可能受到剪接异常的调控。这是一个快速发展的研究领域，值得未来进一步关注，以制定更有效的治疗策略。本文所述方案旨在研究异常剪接在实体瘤和血液系统恶性肿瘤药物耐药性中的影响。为实现这一目标，我们分析了多种肿瘤的转录组谱 体外 通过RNA-seq构建模型，并建立基于qRT-PCR的方法以验证候选基因。特别是，我们评估了DDX5和PKM转录本的差异剪接。由计算工具MATS检测到的异常剪接在白血病细胞中得到验证，结果显示在亲代细胞与耐药细胞中表达的DDX5剪接异构体不同。在这些细胞中，我们还观察到PKM2/PKM1比例升高，而在Panc-1细胞的吉西他滨耐药株与亲代Panc-1细胞相比，该现象未被检测到，提示吉西他滨暴露诱导的耐药机制可能存在差异。

引言

尽管癌症治疗已取得显著进展，但恶性细胞对化疗药物的耐药性（无论是内在的，还是在长期药物暴露后获得的）仍是多种白血病和实体瘤治疗失败的主要原因¹。

为了阐明药物耐药性的潜在机制， 体外 通过逐步筛选对化疗药物具有耐药性的癌细胞，可建立细胞系模型。该方法模拟了临床治疗方案，因而能够深入研究相关的耐药机制。经处理后存活的耐药细胞可通过细胞活力/细胞毒性检测，与亲本敏感细胞进行区分。². 体外 原代细胞的耐药谱已显示出与化疗临床反应显著相关³.

高通量细胞毒性检测是一种用于测定药物敏感性的便捷方法 体外在此，通过例如3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法评估细胞活力⁴，该方法基于特定底物的代谢转化（即， 四氮唑盐）转化为有色产物，从而反映细胞的线粒体活性。 alternatively，可采用磺酰罗丹明B（SRB）法对细胞蛋白含量进行定量。⁵此处，活细胞数量与分光光度计在适当波长下测得的光密度（OD）成正比，无需 繁琐且耗时的细胞计数步骤。通过比较经测试药物处理的孔与未处理对照孔的光密度（OD）值，可计算特定化疗药物所诱导的生长抑制率。以药物浓度为横坐标，以相对于对照组细胞的活细胞百分比....

方案

1. 通过细胞毒性实验表征药物耐药性谱型

1. 白血病细胞系培养
   1. 维持亲本T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM（CEM-WT）及其耐药亚系，包括CEM/R30dm、CEM-R5和CEM-C3，于25 cm²培养瓶中培养² 在含有2.3 µM叶酸、10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素G和100 µg/毫升链霉素的10毫升RPMI-1640培养基中。
   2. 在37 °C、5% CO₂的加湿环境中培养细胞₂ 培养箱
   3. 使细胞生长至浓度为 2 - 3 x 10⁶ 细胞/毫升
   4. 每周将细胞传代两次，初始浓度为 0.3 x 10⁶ 细胞/毫升（例如， 如果细胞浓度为 3 x 10⁶ 细胞/毫升，取1毫升细胞悬液转移至含有9毫升新鲜培养基的新培养瓶中）。连续传代20次后弃去该细胞系。
2. 胰腺癌细胞系培养
   注意：将人胰腺癌细胞系 Panc-1 培养于 75 cm² 培养瓶中² 含高糖和L-谷氨酰胺的DMEM培养基10 ml，添加10%胎牛血清、100单位/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素，用于培养细胞。耐药株Panc-1R在相同培养基中培养，另加入1 µM吉西....

结果

本方案中所述的细胞毒性检测方法为评估癌细胞对化疗药物的耐药性提供了一种可靠且稳健的技术手段 体外通过MTT法检测了四种T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系对地塞米松（Dex）的敏感性，包括对Dex敏感的亲本细胞CEM-WT以及三种Dex耐药亚系：CEM/R30dm、CEM-R5和CEM-C3。由于CEM-WT细胞与其他细胞系之间的敏感性差异较大，因此需使用两种不同的浓度范围进行实验。2 µM - 0.97 nM）以及Dex耐药细胞系（640 µM - 0.33 nM)。MTT 实验明确显示 CEM/R30dm 具有地塞米松耐药性（IC₅₀ = 456 ± 49 µM），CEM-R5（IC₅₀ > 640 µM）和 CEM-C3（IC₅₀ = 386 ± 98 µM) 与 CEM-WT 细胞相比（IC₅₀ = 0.028 ± 0.003 µM）。同样，SRB 实验显示 Panc-1R 细胞系对吉西他滨具有高度耐药性（IC₅₀ = 3........

讨论

在此，我们介绍一种新颖的方法，该方法结合了成熟的细胞毒性筛选技术与基于高通量测序（NGS）的转录组分析，以鉴定与药物耐药性相关的差异剪接事件。分光光度法检测是一种便捷且可靠的高通量方法，可用于评估药物敏感性 体外 癌症模型，是许多进行细胞毒性筛选的实验室的首选。该方法的故障排除及可能的变异方案已在其他文献中详尽描述。^4,5.

目前用于研究耐药机制的高通量基因组分析主要依赖于单核苷酸多态性（SNP）检测以及与特定耐药表型相关基因的差异表达分析。在本研究中，我们描述了RNA测序方法的应用，并结合稳健的生物信息学分析流程，以实现mRNA转录本的精确注释和差异剪接事件的检测。本方案的一个重要特征是能够识别具有不同药物敏感性特征的两组样本之间的新型剪接变异体。为了实现准确且无偏倚的分析，一个关键步骤是RNA的分离，所获得的RNA必须具有高纯度和完整性。

MATS 是我们在一系列可用的类似生物信息学工具中选择的软件（例如， Cuffdiff 2、DEXseq、DiffSplice .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磺基罗丹明B	Sigma-Aldrich	230162
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM高糖培养基	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
胎牛血清和小牛血清	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
青霉素G硫酸链霉素	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
三(羟甲基)氨基甲烷	Sigma Aldrich	252859
MTT甲臜	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96孔板分光光度计
Greiner CELLSTAR 96孔板	Greiner/Sigma	M0812-100EA
胰蛋白酶/EDTA溶液 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR细胞培养瓶 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR细胞培养瓶 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
磷酸盐缓冲液（0.9% NaCl）	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140