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方法文章

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

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DOI：

10.3791/54714

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2016年12月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外 通过RNA-seq构建模型，并建立基于qRT-PCR的方法以验证候选基因。

摘要

药物耐药性在血液系统恶性肿瘤和实体瘤的癌症治疗中仍然是一个主要难题。内在或获得性耐药可由多种机制引起，包括药物清除增加、药物摄取减少、药物失活以及药物靶点的改变。近期研究表明，除了已知的遗传学（突变、扩增）和表观遗传学（DNA高甲基化、组蛋白翻译后修饰）改变外，药物耐药机制还可能受到剪接异常的调控。这是一个快速发展的研究领域，值得未来进一步关注，以制定更有效的治疗策略。本文所述方案旨在研究异常剪接在实体瘤和血液系统恶性肿瘤药物耐药性中的影响。为实现这一目标，我们分析了多种肿瘤的转录组谱 体外 通过RNA-seq构建模型，并建立基于qRT-PCR的方法以验证候选基因。特别是，我们评估了DDX5和PKM转录本的差异剪接。由计算工具MATS检测到的异常剪接在白血病细胞中得到验证，结果显示在亲代细胞与耐药细胞中表达的DDX5剪接异构体不同。在这些细胞中，我们还观察到PKM2/PKM1比例升高，而在Panc-1细胞的吉西他滨耐药株与亲代Panc-1细胞相比，该现象未被检测到，提示吉西他滨暴露诱导的耐药机制可能存在差异。

引言

尽管癌症治疗已取得显著进展，但恶性细胞对化疗药物的耐药性（无论是内在的，还是在长期药物暴露后获得的）仍是多种白血病和实体瘤治疗失败的主要原因1。

为了阐明药物耐药性的潜在机制， 体外 通过逐步筛选对化疗药物具有耐药性的癌细胞，可建立细胞系模型。该方法模拟了临床治疗方案，因而能够深入研究相关的耐药机制。经处理后存活的耐药细胞可通过细胞活力/细胞毒性检测，与亲本敏感细胞进行区分。2. 体外 原代细胞的耐药谱已显示出与化疗临床反应显著相关3.

高通量细胞毒性检测是一种用于测定药物敏感性的便捷方法 体外在此，通过例如3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法评估细胞活力4，该方法基于特定底物的代谢转化（即， 四氮唑盐）转化为有色产物，从而反映细胞的线粒体活性。 alternatively，可采用磺酰罗丹明B（SRB）法对细胞蛋白含量进行定量。5此处，活细胞数量与分光光度计在适当波长下测得的光密度（OD）成正比，无需 繁琐且耗时的细胞计数步骤。通过比较经测试药物处理的孔与未处理对照孔的光密度（OD）值，可计算特定化疗药物所诱导的生长抑制率。以药物浓度为横坐标，以相对于对照组细胞的活细胞百分比为纵坐标，绘制剂量-反应曲线。最终，药物敏感性可表示为与未处理细胞相比引起50%细胞生长抑制的药物浓度（IC50).

药物耐药性的机制涉及多种不同的异常，例如影响药物活性决定因子和细胞代谢相关基因表达的改变。这些分子损伤包括基因突变、转录及转录后水平的异常，以及表观遗传调控的紊乱，通常会影响参与药物代谢或细胞凋亡的基因6。

可变的前体mRNA剪接及其复杂调控机制最近作为可能决定癌细胞耐药性的新因素而受到广泛关注7。在正常细胞中，多达95%的人类基因通过这一严格调控的过程发生可变剪接，从而从同一基因产生多种不同的蛋白质异构体。可变剪接在癌症中常常发生失调，多种肿瘤的特征是越来越多参与药物代谢的基因剪接异常（例如，脱氧胞苷激酶、叶酰基多谷氨酸合成酶或多药耐药蛋白）6,8。然而，对耐药细胞剪接谱的系统性分析仍严重缺乏。因此，迫切需要建立高通量的可变剪接分析方法，这有助于开发更有效的治疗策略。

在过去十年中，下一代测序（NGS）技术的快速发展为生物医学研究带来了新的见解，深化了人们对基因组表达调控的分子机制及其在各种生物过程中作用的理解9。RNA测序（RNA-seq）是NGS在转录组学领域中的一项强大子应用，能够对数千个基因的表达模式进行全基因组范围的定性和定量分析，非常适合于鉴定新型编码mRNA以及长链非编码RNA、miRNA、siRNA和其他小RNA类别（例如，snRNA和piRNA）10,11。

RNA-Seq 在转录组表征方面相较于先前的技术具有诸多优势（例如， Sanger测序和表达谱芯片）。它不依赖于现有的基因组注释，具有单核苷酸水平的分辨率，并且在基因表达水平估计方面具有更宽的动态范围。简而言之，RNA-seq实验的基本实验流程包括：聚腺苷酸化转录本（mRNA）的筛选与片段化，随后将其转化为cDNA，构建文库，最后进行大规模并行深度测序12,13由于近年来测序成本迅速下降，RNA-seq 正逐步取代其他技术，同时科研人员正大力改进文库构建方案。例如，目前可通过在第二链 cDNA 中掺入脱氧尿苷三磷酸（dUTP）标记，并在 PCR 扩增前使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UDG）消化该标记链，从而保留 mRNA 转录本的链信息。该方法可提高基因注释和表达水平定量的准确性14,15.

RNA-seq 数据的分析与解读需要在生物信息学流程中使用复杂且强大的计算软件包进行处理16,17首先，原始测序读段需经过质量控制，去除技术性与生物学来源的干扰因素，并对未达到严格质量标准的序列进行截短（修剪）或丢弃。随后，将各样本的测序读段比对至参考基因组，并分别归集到基因水平、外显子水平或转录本水平，以确定各类别的表达丰度。根据具体应用需求，进一步通过统计学模型对数据进行精细分析，用于鉴定等位基因特异性表达、可变剪接、基因融合事件以及单核苷酸多态性（SNPs）。12最后，对选定水平进行差异分析（即， 基因表达或可变剪接可用于比较在不同条件下获得的样本。

差异剪接分析用于描述两个样本之间剪接位点使用情况的差异。目前已有越来越多基于不同统计模型、性能表现和用户界面的软件工具可用于此目的18。其中，MATS（转录本剪接的多变量分析）是一种基于贝叶斯统计框架的免费且精确的计算工具，专门设计用于从单端或成对末端RNA测序数据中检测差异剪接事件。从比对后的（.bam）文件出发，MATS能够检测所有主要类型的可变剪接事件（外显子跳跃、替代3'剪接位点、替代5'剪接位点、互斥外显子以及内含子保留——详见图1）。

首先，软件会识别支持特定剪接事件（例如外显子跳跃）的测序读段，并将其分为两类。"包含性读段"（对应于经典的剪接事件）比对至被研究的外显子内部，并跨越该外显子与其上下游相邻两个外显子之间的连接位点。"跳跃性读段"（对应于可变剪接事件）则跨越两个相邻外显子之间的连接位点。随后，MATS 计算并返回经典剪接事件和可变剪接事件的标准化包含水平，并在不同样本或条件下进行数值比较。最终，对于每个剪接事件，当两组条件下某基因的剪接异构体比例差异超过用户设定的阈值时，MATS 会计算相应的 P 值和错误发现率（FDR）19,34。

在进行差异剪接分析并结合RNA-seq之后，有必要开展广泛的实验验证，以鉴定真正阳性的基因候选分子18。定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）是验证RNA-seq分析所得候选基因最常用且最优化的方法20。本文旨在提供一种可靠的实验方法，用于研究实体瘤和血液系统恶性肿瘤中与药物耐药性相关的剪接谱型。我们的研究策略结合了基于RNA-seq的转录组分析，应用于选定的耐药癌症细胞系模型，并采用已建立的qRT-PCR方法对参与药物耐药性的候选基因进行验证。

本研究中使用的成人白血病细胞系模型包括儿童T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系CCRF-CEM（CEM-WT），及其两个糖皮质激素（GC）耐药亚克隆CEM-C7H2-R5C3（CEM-C3）和CEM-C7R5（CEM-R5）21,22，以及甲氨蝶呤（MTX）耐药亚系CEM/R30dm23。尽管目前基于糖皮质激素和甲氨蝶呤的治疗方案在约90%的病例中可产生临床疗效，但糖皮质激素耐药性的出现仍然是一个尚未解决的问题，其分子机制尚不明确。为分离糖皮质激素耐药亚克隆，将CEM-WT细胞在1 µM地塞米松（Dex）中培养2至3周。MTX耐药亚系CEM/R30dm则是通过对CEM-WT细胞反复进行短期（24小时）暴露于30 µM MTX而建立，以模拟临床治疗方案。有趣的是，该细胞系还表现出对地塞米松的交叉耐药性（未发表结果），其机制尚未完全阐明。

本研究中所探讨的实体瘤模型为胰腺导管腺癌，该肿瘤以对化疗药物极强的耐药性而著称。为此，我们选用了Panc-1细胞系及其通过持续暴露于1 µM吉西他滨获得的吉西他滨耐药亚克隆Panc-1R24在此，我们描述了一种发现潜在新机制的方法 体外 通过结合三种实验方案研究药物耐药性：采用比色法细胞毒性检测评估白血病细胞及实体瘤来源癌细胞的药物敏感性，基于RNA测序的分析流程鉴定与药物敏感性/耐药性相关的新剪接变异体，并通过RT-PCR和qRT-PCR分析验证潜在候选基因。

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方案

1. 通过细胞毒性实验表征药物耐药性谱型

  1. 白血病细胞系培养
    1. 维持亲本T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM（CEM-WT）及其耐药亚系，包括CEM/R30dm、CEM-R5和CEM-C3，于25 cm²培养瓶中培养2 在含有2.3 µM叶酸、10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素G和100 µg/毫升链霉素的10毫升RPMI-1640培养基中。
    2. 在37 °C、5% CO₂的加湿环境中培养细胞2 培养箱
    3. 使细胞生长至浓度为 2 - 3 x 106 细胞/毫升
    4. 每周将细胞传代两次，初始浓度为 0.3 x 106 细胞/毫升（例如， 如果细胞浓度为 3 x 106 细胞/毫升，取1毫升细胞悬液转移至含有9毫升新鲜培养基的新培养瓶中）。连续传代20次后弃去该细胞系。
  2. 胰腺癌细胞系培养
    注意：将人胰腺癌细胞系 Panc-1 培养于 75 cm² 培养瓶中2 含高糖和L-谷氨酰胺的DMEM培养基10 ml，添加10%胎牛血清、100单位/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素，用于培养细胞。耐药株Panc-1R在相同培养基中培养，另加入1 µM吉西他滨（溶于无菌水）。更多细节见于 24.
    1. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 培养箱
    2. 每2至3天按1:5的比例传代一次细胞，当细胞融合度达到约90%时进行。
    3. 为传代细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每75 cm²培养面积加入1 ml胰蛋白酶/EDTA溶液，2 培养瓶，37 °C 孵育 3 分钟。
    4. 加入9 ml培养基，将脱落的细胞收集至15 ml离心管中。取2 ml细胞悬液接种至含8 ml培养基的新培养瓶中。连续传代20次后弃去该培养物。
  3. 白血病细胞的 MTT 检测
    1. 提前配制 MTT 溶液：将 500 mg MTT 甲臜溶解于 10 ml PBS 中，避光条件下使用磁力搅拌器搅拌约 1 小时。用 0.22 µm 滤器过滤除菌。注意：溶液可分装为 10 ml 每份，于 −20 °C 保存。解冻后需避免直接光照。
    2. 提前配制酸化异丙醇：将50 ml 2 M HCl加入2.5 L异丙醇中。注意：配制后需在室温下储存至少一个月方可使用。若异丙醇酸化不充分，可能与培养基产生沉淀，影响分光光度读数。
    3. 准备一个单独的96孔平底板 "第0天" （对照）平板以确保更准确地估算生长抑制：每种细胞系分配3至6个孔，每孔加入30 µl生长培养基和120 µl细胞悬液（8,000个细胞），空白孔（无细胞）中加入150 µl生长培养基。按照本节步骤1.3.9至步骤1.3.13测定光密度（OD）。注意：更多细节见 4.
    4. 准备一块96孔平底实验板：分配30个孔用于药物浓度（10个浓度，每浓度设3个复孔），10个孔用于对照细胞，10个孔用于不含细胞的培养基对照（空白孔），并使用二甲基亚砜作为溶剂配制地塞米松（Dex）的药物梯度稀释液。
      注意：CEM-WT 细胞的 Dex 稀释范围为 2 µM 至 0.97 nM；CEM/R30dm、CEM-R5 和 CEM-C3 细胞的 Dex 稀释范围为 640 µM 至 0.33 nM。
    5. 将每种Dex稀释液各30 µl加入96孔板的相应孔中。每种浓度需设置三个复孔。
    6. 向对应于对照细胞的孔中加入30 µl培养基，向对应于空白对照的孔中加入150 µl培养基。
    7. 收集对数生长期的细胞，并重悬于其最佳接种浓度。
      注意：为了确定最佳起始细胞浓度，建议在96孔板中以多种细胞接种浓度培养各细胞系，并连续每日检测至少4天，以评估其生长曲线。应选择一种接种浓度，确保细胞在72小时后不会过度生长，以免导致OD值饱和而影响实验结果。对于CEM-WT、CEM-C5和CEM-R5细胞系，最佳接种浓度为8,000个细胞/孔，而对于CEM/R30dm细胞系，则为5,000个细胞/孔。
    8. 向每孔中加入120 µl细胞悬液，孔内预先含有药物溶液或生长培养基（对应对照细胞的孔）。向板的外围空白孔中加入150 µl PBS，以确保培养板内湿度，并将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育72小时。2 在细胞培养孵育箱中。
    9. 向每个孔中加入15 µl MTT溶液，使用平板振荡器以最高900次/分钟的速度振荡混匀5分钟。
    10. 将培养皿重新置于37 °C、5% CO₂条件下培养2 在细胞培养孵育箱中继续孵育4至6小时。
    11. 向每孔中加入150 µl酸化异丙醇，使用多通道移液器充分混匀，以彻底重悬所有甲臜晶体。从空白孔开始操作，移液至另一排前务必充分冲洗吸头。
    12. 在室温（RT）下孵育平板10分钟。
    13. 使用酶标仪测定540 nm和720 nm处的吸光度（OD），通过校正背景OD值以确保测量准确。随后将数据保存至电子表格文件并进行分析4.
  4. 胰腺癌细胞的SRB检测
    1. 将SRB试剂溶于1%乙酸中，配制成终浓度为0.4%（w/v）的溶液。
    2. 将三氯乙酸（TCA）溶于超纯水中，配制成终浓度为50%（w/v）的溶液。
    3. 将三（羟甲基）氨基甲烷溶于超纯水中，配制成终浓度为 10 mM 的溶液。
    4. 准备一个独立的96孔平底板 "第0天" 对照孔以更准确地评估生长抑制：取处于对数生长期的细胞，以适当的接种浓度在100 µl培养基中接种6个孔，另设空白孔仅加入100 µl培养基。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜2 以确保细胞充分贴附于培养板。随后向所有孔中加入100 µl培养基，并继续执行本节的步骤1.4.8至1.4.16。
    5. 准备96孔平底实验板：使用多通道移液器，将处于指数生长期的细胞以适当的密度接种于96孔平底板中，每孔加入100 µl培养基，每组设三个复孔。
      注意：为了确定最佳起始细胞浓度，建议在96孔板中以多种接种浓度培养各细胞系，并连续每日检测至少4天，以评估其生长曲线。应选择一种接种浓度，确保细胞在72小时后不会过度生长，以免因光密度（OD）值达到饱和而影响实验结果。对于Panc-1和Panc-1R细胞，最佳接种浓度为8000个细胞/孔。
    6. 向仅含培养基的孔中加入 100 µl 培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜2 以确保细胞与培养板的充分贴附。
    7. 配制吉西他滨药物浓度梯度，Panc-1细胞为1 µM至10 nM，Panc-1R细胞为1 mM至100 nM。使用多通道移液器将每种稀释液各100 µl加入96孔板的相应孔中。确保每个浓度设三个复孔。此外，向仅含培养基的孔和对照细胞孔中各加入100 µl培养基。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 72 小时。
    8. 使用多通道移液器向各孔中加入25 µl冷TCA溶液，将板在4 °C孵育至少60分钟，以使蛋白质在孔底沉淀并固定。
    9. 移除培养基后，将培养板在纸巾上短暂吸干。
    10. 用自来水洗涤5次，然后倒空培养板并在室温下晾干。
    11. 使用多通道移液器向每孔加入 50 µl SRB 溶液，室温下染色 15 分钟。
    12. 移除SRB染料以清空培养板。
    13. 用1%乙酸洗涤4次，然后吸干孔板并室温下晾干。
    14. 每孔加入 150 µl Tris 溶液，使用多通道移液器操作，在平板振荡器上以最高 900 次/分钟的速度振荡混匀 3 分钟。
    15. 在540 nm（或如果OD值过高则在492 nm）处读取光密度值。
    16. 分析数据。
  5. MTT和SRB实验的数据分析
    1. 计算细胞的OD值 "第0天" 使用以下公式：OD第0天 光密度对照细胞 - 平均 OD空白孔
    2. 根据以下公式计算每种药物浓度下存活细胞的百分比：% 处理细胞 = 平均值 [OD经处理的细胞 - 平均 OD空白孔 - OD第0天]/[OD对照细胞 - 平均 OD空白孔 - OD第0天]*100
    3. 绘制剂量-反应曲线（药物浓度 vs. 生长抑制率%）。
    4. 计算抑制细胞生长50%的药物浓度（IC50) 使用剂量-反应曲线。

2. RNA 提取与RNA测序文库制备

  1. 样本采集与RNA提取
    1. 对于CEM细胞：直接从培养基中收集106个细胞。
    2. 对于Panc-1和Panc-1R细胞：弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，加入胰蛋白酶-EDTA并在37 °C孵育3分钟以消化贴壁细胞。加入培养基终止消化，收集106个细胞。
    3. 在300 × g离心3分钟，弃去上清液，使用市售的硅胶膜离心柱按照制造商提供的操作说明提取总mRNA。
    4. 使用紫外-可见分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。
      注：若260 nm / 280 nm吸光度比值高于1.8，则认为RNA纯度较高。样品可在-80 °C保存。
    5. 取200 ng样品在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上进行电泳，评估总RNA的完整性。
      注：若观察到两条清晰完整的条带，分别对应哺乳动物约2 kb的28S和约1 kb的18S rRNA，则表明总RNA完整性良好。
  2. 测序文库构建
    1. 每个样本使用2 µg总mRNA。根据制造商说明书进行mRNA文库构建。
    2. 使用生物分析仪系统检测各文库的质量与浓度。将各文库等量混合至终浓度为10 nmol/L，并用生物分析仪测定混合后文库的浓度。
    3. 采用高通量测序系统，设置为单端读取（Single Read）100 bp模式。
      注：读长需超过> 80 bp，以确保能够识别转录本异构体。

3. 从测序读段中检测差异剪接

  1. 将测序读段比对至参考基因组及质量检测
    1. 使用 UCSC 表浏览器从 NCBI refGene 表中编译基因注释（.gtf 文件）（25,963 个基因）。
    2. 使用 STAR 将测序读段相对于参考基因组（GRCh37）进行注释感知的间隔比对。
    3. 使用 Picard 工具对生成的比对文件进行排序和索引。
    4. 使用 RSeQC 和 samtools 进行比对后质量控制。
  2. 样本组间的差异剪接检测
    1. 安装 Python 以及对应版本的 NumPy 和 SciPy。下载并安装 samtools。下载并安装 bowtie 和 tophat。
    2. 将 Python、bowtie、tophat 和 samtools 目录添加到 $PATH 环境变量中。下载预构建的 bowtie 索引（hg19）。下载 rMATS 3.0.9 版本。
      注意：有关rMATS的更多详细信息见于 19 和 34.
    3. 通过分别将每种地塞米松耐药细胞系与CEM-WT、Panc-1与Panc-1R进行比较，开展独立的MATS分析以检测可变剪接事件 图5A.
    4. 为了从先前比对好的测序读段（.bam 文件）中检测差异剪接事件，使用以下命令运行 MATS： 图5B CEM-WT 与 CEM-C3、CEM-WT 与 CEM-R5、CEM-WT 与 CEM/R30dm 以及 Panc1 与 Panc-1R 的比较。
      注意：MATS 将创建一个输出文件夹，其中包含两个 .txt 文件，分别对应所分析的每种剪接事件类型（SE - 外显子跳跃、A5SS - 可变 5' 剪接位点、A3SS - 可变 3' 剪接位点、MEX - 互斥外显子和 RI - 内含子保留）的结果：一个文件仅基于连接位点计数生成结果，另一个文件则结合连接位点计数和靶标区域上的读段生成结果。此外，同一文件夹中还会生成一个包含结果概览的额外 .txt 文件。
    5. 对于SE、A5SS、A3SS和RI事件，导入基于剪接位点连接计数及靶向区域读段数的.txt文件至电子表格；对于MEX事件，仅导入基于剪接位点连接计数的.txt文件。
      注意：MATS 输出文件按 P 值升序排列，包含多个参数：基因 ID、基因符号、染色体及链位置、选择性剪接片段的基因组坐标、两个分析样本中包含型和跳过型的读段计数及其长度、用于标准化的包含型和跳过型长度、P 值、错误发现率（FDR）、基于标准化计数的各样本包含水平，以及差异包含评分（average(IncLevel1) - average(IncLevel2)）。
    6. 选择具有统计学显著性的候选基因，FDR<10% 用于进一步验证（例如，DDX5 和 PKM2）
    7. 使用 Integrative Genomics Viewer（IGV，https://www.broadinstitute.org/igv/）可视化可变剪接事件，如文献报道所示 图5.

4. 通过RT-PCR和qRT-PCR实验验证结果

  1. 引物设计
    注意：为了可靠地验证使用生物信息学分析流程获得的结果，需通过 RT-PCR 扩增可变剪接事件产生的 mRNA 转录本，并通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行可视化检测。使用如 SYBR Green 等氰基绿色染料的 qRT-PCR 检测方法，相对于看家基因定量特定剪接变体的表达量。图7展示了用于可视化 DDX5 基因第12外显子跳跃事件以及定量 PKM 基因互斥外显子9和外显子10的策略。
    1. 对于 RT-PCR 检测，设计引物对，使其分别退火至可变剪接位点上游和下游的组成型外显子（外显子10和外显子13）（图7A）。
      注意：扩增子大小应在 100 至 800 bp 之间，以确保 PCR 产物在琼脂糖凝胶上能够清晰分离。引物的退火温度应在 55 至 65 °C 之间，GC 含量不应超过 60%。
    2. 氰基绿色染料检测（图7B）。
      1. 检查两个互斥外显子的序列同源性，并设计两对引物，每对引物特异性且唯一地检测两种剪接变体中的一种。
        注意：对于 PKM，反向引物退火至两种变体共有的外显子11，而正向引物具有变体特异性，分别退火至外显子9（PKM1）或外显子10（PKM2）。
      2. 为检测 DDX5 全长基因，将反向引物设计在被跳过的外显子（外显子12）内部。
        注意：为特异性检测 DDX5 ΔEx12 变体，反向引物应跨越外显子11与外显子13的连接边界。两组反应使用相同的正向引物，该引物退火至组成型外显子10。
        注意：扩增子大小应在 80 至 200 bp 之间。
  2. 第一链 cDNA 合成
    1. 使用 200 U/µl 的莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶，在其反应缓冲液经无菌水稀释至 1:5 后，对 1 µg 提取的 RNA 进行逆转录反应生成 cDNA。加入 1 µM DTT、0.05 µg 随机六聚体引物、1 mM 脱氧核苷三磷酸混合物（dNTP）以及 40 U/µl 核糖核酸酶抑制剂。
    2. 短暂涡旋混匀，于 37 °C 孵育反应体系 2 小时。
    3. 于 70 °C 孵育 5 分钟以灭活逆转录酶，将反应体系转移至冰上，并使用微量离心机离心收集。样品可立即使用或储存于 -20 °C。
  3. RT-PCR 反应与琼脂糖凝胶电泳
    1. 在每个样品的 PCR 管中配制 PCR 反应体系：加入 12.5 µl 的 2x 浓缩 PCR 预混液、1.25 µl 的 10 µM 正向引物、等量的反向引物，并用无菌水补足至终体积 25 µl。
    2. 向体系中加入 1 µl cDNA，将 PCR 管放入热循环仪中。运行程序如下：初始变性：95 °C 2 分钟；重复以下步骤 35 个循环：95 °C 变性 25 秒，52 °C 退火 35 秒，72 °C 延伸 1 分钟；最后在 72 °C 延伸 5 分钟。
    3. 通过将 1 g 琼脂糖溶解于 100 ml 1x TBE 缓冲液中制备 1% 琼脂糖凝胶。向溶液中加入 2.5 µl 溴化乙锭。注意：溴化乙锭具有致癌性，应在化学通风橱中谨慎操作。
    4. 上样后，在电泳系统中以 1x TBE 缓冲液、100 V 电压电泳约 30 分钟。
    5. 使用数字紫外成像系统观察凝胶并保存图像。
  4. qRT-PCR 与数据分析
    1. 在每个样品的 PCR 管中配制氰基绿色染料 PCR 反应体系：加入 12.5 µl 的 2x 绿色 PCR 预混液、2 µl 的 5 µM 正向引物、等量的反向引物，并用无菌水补足至终体积 15 µl。为每种待检测的特异性剪接变体（PKM1、PKM2、DDX5 全长、DDX5 ΔEx12）以及看家基因（GUS）分别配制反应体系。
    2. 将预混液加入白色 96 孔板中，每个样品设置两个复孔。
    3. 将 cDNA 用无菌水稀释 10 倍，每孔加入 5 µl，将 96 孔板放入热循环仪中。运行程序如下：初始变性：95 °C 5 分钟；重复以下步骤 45 个循环：95 °C 变性 10 秒；退火温度为 58 °C（用于 DDX5 和 DDX5 ΔEx12 反应体系）或 60 °C（用于 PKM1 和 PKM2 反应体系），持续 20 秒；最终延伸：72 °C 20 秒。设置熔解曲线程序，温度梯度从 65 °C 升至 97 °C。
    4. 为评估引物对目标序列的特异性，检查熔解曲线，确认每对引物仅产生单一峰形。
    5. 计算扩增曲线的二阶导数，导出循环阈值（Ct）。
    6. 使用"ΔCt（ΔCt）"法计算各样品中剪接变体 mRNA 相对于 GUS 看家基因（参照基因）的相对表达水平（REL）。公式为：REL = 2-ΔCt，其中 ΔCt = Ct 目标剪接变体 - Ct 参照基因。
    7. 为定量剪接变体的相对丰度，使用以下公式计算 REL 比值：REL 比值 = REL剪接变体1 / REL剪接变体2。

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结果

本方案中所述的细胞毒性检测方法为评估癌细胞对化疗药物的耐药性提供了一种可靠且稳健的技术手段 体外通过MTT法检测了四种T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系对地塞米松（Dex）的敏感性，包括对Dex敏感的亲本细胞CEM-WT以及三种Dex耐药亚系：CEM/R30dm、CEM-R5和CEM-C3。由于CEM-WT细胞与其他细胞系之间的敏感性差异较大，因此需使用两种不同的浓度范围进行实验。2 µM - 0.97 nM）以及Dex耐药细胞系（640 µM - 0.33 nM)。MTT 实验明确显示 CEM/R30dm 具有地塞米松耐药性（IC50 = 456 ± 49 µM），CEM-R5（IC50 > 640 µM）和 CEM-C3（IC50 = 386 ± 98 µM) 与 CEM-WT 细胞相比（IC50 = 0.028 ± 0.003 µM）。同样，SRB 实验显示 Panc-1R 细胞系对吉西他滨具有高度耐药性（IC50 = 3....

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讨论

在此，我们介绍一种新颖的方法，该方法结合了成熟的细胞毒性筛选技术与基于高通量测序（NGS）的转录组分析，以鉴定与药物耐药性相关的差异剪接事件。分光光度法检测是一种便捷且可靠的高通量方法，可用于评估药物敏感性 体外 癌症模型，是许多进行细胞毒性筛选的实验室的首选。该方法的故障排除及可能的变异方案已在其他文献中详尽描述。4,5.

目前用于研究耐药机制的高通量基因组分析主要依赖于单核苷酸多态性（SNP）检测以及与特定耐药表型相关基因的差异表达分析。在本研究中，我们描述了RNA测序方法的应用，并结合稳健的生物信息学分析流程，以实现mRNA转录本的精确注释和差异剪接事件的检测。本方案的一个重要特征是能够识别具有不同药物敏感性特征的两组样本之间的新型剪接变异体。为了实现准确且无偏倚的分析，一个关键步骤是RNA的分离，所获得的RNA必须具有高纯度和完整性。

MATS 是我们在一系列可用的类似生物信息学工具中选择的软件（例如， Cuffdiff 2、DEXseq、DiffSplice ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨向 J.J. McGuire 教授、R. Kofler 教授以及 K. Quint 博士致谢，感谢他们提供本研究所用的耐药细胞系。本研究获得了阿姆斯特丹癌症中心（CCA）基金会（资助 JC、EG 和 RS）、KiKa 基金会（儿童无癌项目，资助 AW）、间皮瘤应用研究基金会 Peter G. Angelos 律师事务所资助项目（资助 VEG 和 EG）、意大利癌症研究协会（AIRC）、托斯卡纳肿瘤研究所（ITT）以及托斯卡纳大区 FAS 健康项目（资助 EG）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磺基罗丹明BSigma-Aldrich230162
三氯乙酸Sigma-Aldrich251399
CCRF-CEMATCC, Manassas, VA, USAATCC CCL-119
Panc-1ATCC, Manassas, VA, USAATCC CRL-1469
DMEM高糖培养基Lonza, Basel, Switzerland12-604F
RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, USA11875093
胎牛血清和小牛血清Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany758093
青霉素G硫酸链霉素Gibco, Carlsbad, CA, USA15140122
三(羟甲基)氨基甲烷Sigma Aldrich252859
MTT甲臜Sigma AldrichM2003
Anthos-Elisa-reader 2001Labtec, Heerhugowaard, NetherlandsUV-Vis 96孔板分光光度计
Greiner CELLSTAR 96孔板Greiner/SigmaM0812-100EA
胰蛋白酶/EDTA溶液 100 mlLonza, Basel, SwitzerlandCC-5012
CELLSTAR细胞培养瓶 25 cm2Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82051-074
CELLSTAR细胞培养瓶 75 cm3Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82050-856
磷酸盐缓冲液（0.9% NaCl）B.Braun Melsungen AG, Germany362 3140

参考文献

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