开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

摘要

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。

摘要

自身免疫性疾病源于免疫耐受的丧失。调节性T细胞（Tregs）在免疫耐受中发挥重要的介导作用。Tregs约占成熟CD4⁺ 小鼠和人类体内的T细胞亚群中，约有1-2%的调节性T细胞（Tregs）在外周血中循环。诱导性多能干细胞（iPSCs）可分化为具有功能的调节性T细胞，有望用于自身免疫性疾病的细胞治疗。本文介绍一种从iPSCs制备抗原（Ag）特异性Tregs的方法即，iPSC-Tregs）。该方法基于将转录因子FoxP3和一种抗原特异性T细胞受体（TCR）导入iPSCs，随后在表达Notch配体delta-like（DL）1和DL4的OP9基质细胞上进行分化。继而 体外 分化后，iPSC-Tregs 表达 CD4、CD8、CD3、CD25、FoxP3 以及抗原特异性 TCR，并能够响应抗原刺激。该方法已成功应用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞治疗。将这些抗原特异性的 iPSC-Tregs 过继转移至抗原诱导性关节炎（AIA）小鼠体内，可减轻关节炎症与肿胀，并防止骨质流失。

引言

自身免疫性关节炎是一种系统性疾病，其特征是滑膜组织增生以及关节软骨、骨和韧带的进行性破坏¹。在自身免疫性关节炎中，调节性T细胞（Tregs）的生成或功能缺陷导致慢性炎症和组织损伤，因为Tregs在防止自身反应性免疫细胞的产生中起着关键作用。

调控调节性T细胞（Tregs）是开发能够在抗原依赖性条件下抑制炎症的治疗策略的理想途径。对于基于Tregs的免疫治疗而言，所转移Tregs的特异性在控制正在进行的自身免疫反应中至关重要²。为了发挥抑制功能，Tregs需要迁移并滞留在病变部位，而这一过程可通过其T细胞受体（TCR）对该部位抗原的特异性来引导³。尽管多克隆Tregs中可能含有少量具有该抗原特异性的细胞亚群，但这类抗原特异性Tregs的数量通常较低。因此，使用多克隆Tregs治疗自身免疫性疾病时，往往需要进行大量Tregs的过继性转移^4,5。由于多能干细胞（PSCs）具有分化为任何细胞类型的潜能，抗原特异性的PSC来源Tregs（PSC-Tregs）可能成为基于Tregs的免疫治疗的理想候选细胞。先前的研究已成功实现了由PSCs分化为T细胞，包括Tregs^6-8。

本文介绍了一种制备抗原特异性诱导多能干细胞来源的调节性T细胞（Ag-specific iPSC-Tregs）的实验方案。我们进一步描述了在小鼠模型中利用....

方案

所有动物实验均经宾夕法尼亚州立大学医学院动物护理委员会（IACUC 方案编号 #45470）批准，并严格按照实验室动物护理与使用评估认证协会的指南进行。

1. 干细胞培养

1. 将10 ml 0.1% 明胶加入10 cm培养皿中，于37 °C（培养箱）孵育至少30分钟，以包被培养皿。
2. 移除培养皿中的明胶，接种3 × 10⁶ 照射处理的SNL76/7细胞，并在37 °C（培养箱）下用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养一天。
3. 移除培养基，将解冻的iPSCs接种于SNL76/7细胞饲养层上，使用iPSC培养基（含15%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、1 mmol/L L-谷氨酰胺和0.1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM培养基）进行培养⁹。小鼠iPS-MEF-Ng-20D-17细胞系由小鼠胚胎成纤维细胞经逆转录病毒转染Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导获得，由日本京都大学前沿医学研究所Shinya Yamanaka博士提供。
4. 第3天更换新鲜培养基，并在显微镜下观察iPSC克隆。
   注意：这些克隆呈小而闪亮的细胞簇或圆形细胞，边界清晰，在荧光显微镜下可见GFP表达。

2. 体外 Ag特异性iPSC-Treg的分化

结果

如图所示，在第28天，抗原特异性调节性T细胞（Tregs）显著表达CD3和抗原特异性TCR，这两种T细胞标志物。CD3⁺TCRVβ5⁺ 群体表达CD4。大多数CD3⁺TCRVβ5⁺CD4⁺ 细胞还表达 CD25、CD127 和 CTLA-4，这些分子在天然存在的 T 细胞中通常呈高水平表达_{调节性T细胞} (nTregs) 以及异位表达 FoxP3 的 T 细胞中。在 iPSC 来源的细胞中，FoxP3 的表达即使在长期培养后仍持续存在 体外 通过流式细胞术分析的细胞内染色检测到的Notch配体刺激 （图1）此外，抗原特异性的iPSC-Treg在受到刺激时能够产生抑制性细胞因子，如TGF-β和IL-10。 体外 用抗原致敏的脾细胞 （图2），表明iPSC-Tregs具有潜在的抑制活性。荧光显微镜显示，FoxP3阳性细胞数量增多⁺

讨论

在此方案中，一个关键步骤是 体外 TCR/FoxP3基因转导的iPSCs的分化 体外 Notch 信号通路诱导细胞向 T 细胞谱系发育。将诱导多能干细胞分化为 CD4⁺FoxP3⁺ Tregs，我们使用了 OP9-DL1/DL4/I-A^b 高表达MHC II（I-A）的细胞^b）分子。大多数iPSCs会分化为CD4⁺ 细胞。然而，在表面TCR表达后，许多已分化的前体T细胞会失去进一步分化的能力，并最终死亡。因此，诱导性多能干细胞来源的功能性调节性T细胞在四周后细胞数量显著减少 体外 分化。为避免此情况，可在这些时间点添加IL-2以提高细胞存活率。另一种促进抗原特异性前体调节性T细胞（pre-Tregs）成熟与存活的方法是，将已分化的pre-Tregs进行过继转移 体外 持续一周向小鼠体内给予。这些前体调节性T细胞可继续分化并成熟 体内 再持续三周。利用该方法，可从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成具有功能性的抗原特异性调节性T细胞（Treg）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6j 小鼠	杰克逊实验室	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	杰克逊实验室	2216
抗CD3（2C11）抗体	BD Pharmingen	553058
抗CD28（37.51）抗体	BD Pharmingen	553295
抗CD4（GK1.5）抗体	Biolegend	100417
抗-CD8（53–6.7）抗体	Biolegend	100714
抗CD25（3C7）抗体	Biolegend	101912
抗TCR-β (H57597) 抗体	Biolegend	109220
抗IL10	Biolegend	505010
抗TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
布雷菲德菌素A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	综合科学	204130
ACK裂解缓冲液	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
明胶	Sigma	G9391
多聚甲醛	Sigma	P6148-500G	警告：致敏性、致癌性、毒性
透化缓冲液	Biolegend	421002
mBSA	Sigma	A7906
卵清蛋白	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
尾静脉固定器	布雷因特里科学公司	RTV 150-STD