一种基于浮力的体脂含量测定方法 果蝇

摘要

本文介绍一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）三龄（L3）幼虫阶段整体脂肪水平的方法。该方法利用脂肪组织相对较低的密度，以区分脂肪储存量发生改变的幼虫。基于浮力的分析是一种快速、可重复且经济高效的筛选工具。

摘要

黑腹果蝇 是脂肪调控研究中的关键实验体系。目前已有多种技术可用于检测储存脂肪的水平 果蝇，但大多数方法成本高昂和/或操作繁琐，且存在明显局限性。本文介绍一种快速、廉价测定L3期生物体脂肪含量的方法 果蝇 幼虫。该技术基于脂肪组织与瘦肉组织之间的密度差异，可快速检测脂肪与瘦肉表型。我们通过将该方法与中性脂质提取结合气相色谱-质谱联用（GCMS）测定的体脂百分比进行比较，验证了其准确性。此外，我们还详细阐述了幼虫收集与同步化的实验方案及相关实验配方。下述技术克服了目前最常用的脂质定量方法的主要缺陷，能够在保持幼虫完整性的前提下，快速、灵敏地筛选L3幼虫的脂肪调控表型。该检测方法在利用 果蝇.

引言

Drosophila melanogaster 已被用于遗传学及其他基础生物学问题的研究超过一个世纪。在过去的几十年中，人们逐渐认识到，Drosophila 是研究多种人类疾病的有力工具。由于与人类疾病相关的基因中有 70 - 80% 拥有已鉴定的果蝇同源基因^1-4，Drosophila 提供了一个简化但具有可转化性的系统，可用于研究复杂的疾病。其中，代谢研究尤其受益于这类模型。不仅果蝇与人类在代谢遗传机制上高度保守，相关的器官和细胞类型也非常相似^2,5。例如，果蝇的脂肪体同时储存三酰甘油（TAG）和糖原，其功能类似于哺乳动物的肝脏和白色脂肪组织⁶。利用Drosophila 作为人类肥胖症的模型，极大地加深了我们对脂质代谢及肥胖遗传机制的理解⁷。发育的幼虫阶段对于研究营养物质在储存与利用之间的分配尤为有用，因为该阶段专注于摄食，并储存能量以供化蛹时使用。

目前，已有多种不同的定量方法用于测定黑腹果蝇（Drosophila）中的脂肪储存水平。其中应用最广泛的方法是偶联比色法（CCA）^8,9。CCA 最初是为测定人血清中的甘油三酯（TAG）水平而开发的，其原理基于从甘油三酯骨架中释放出的甘油会经历一系列反应，最终通过氧化还原偶联反应生成有色产物。通过测定特定波长光的吸光度，可推算出初始甘油的含量。然而，甘油不仅可由甘油三酯释放，也可来自单酰基甘油和二酰基甘油，因此该方法可能无法准确反映体内脂肪储存的真实水平⁹。此外，研磨后的成年果蝇眼色素可能干扰某些吸光度读数，从而影响实验结果的准确性^9,10。因此，CCA 方法需结合薄层色谱法（TLC）进行验证，TLC 可分离大多数脂质类别，并可通过密度测定法进行定量分析^10,11。然而，某些脂质类别（如甾醇）无法通过该方法检测，必须采用其他方法进行定量¹²。质谱法（MS）能够准确测定所有主要细胞脂质类别的含量^12,13。但用于质谱分析的脂质提取过程既耗时（多数方法几乎需要一整天）又成本高昂。本文介绍一种替代方法，可快速且低成本地测定黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）三龄幼虫（L3）个体的脂肪水平。

以下所述方法利用了脂肪组织与瘦肉组织之间密度的差异。哺乳动物脂肪组织的密度约为 0.9 g/ml¹⁴，而骨骼肌的密度为 1.06 g/ml¹⁵。这种差异意味着脂肪储存较多的动物密度较低，而脂肪储存较少的动物密度较高，因此在固定密度的溶液中，前者更容易上浮。该特性使得大量动物能够被极为快速地筛选，同时具备成本低廉和非侵入性的优点。基于浮力的分析方法已被用于验证已知脂肪水平调控因子的表型变化，同时也被用于发现新的肥胖相关遗传和神经调控因子^16,17。

方案

1. 收集具有目标基因型的果蝇的卵

注意：理想的杂交组合包含 150 只处女蝇和至少 75 只雄蝇。品系保种的数量应至少包含 200 只果蝇。

1. 制备葡萄培养基平板。
   1. 在4 L的烧瓶中，将37.5 g琼脂加入1.5 L蒸馏水中。
   2. 在121 ºC（250 ºF）条件下，将水/琼脂混合物高压灭菌50分钟。
   3. 在水/琼脂混合物灭菌的同时，将50 g蔗糖加入500 ml葡萄汁中，并在加热磁力搅拌器上用搅拌子搅拌，直至蔗糖完全溶解。
   4. 关闭加热，继续搅拌使葡萄汁/蔗糖混合物冷却至70 ºC以下。使用酒精温度计检测内部温度。
   5. 向温热的葡萄汁/蔗糖混合物中加入3 g Drosophila 抗真菌剂（例如，Tegosept），搅拌至溶解。
   6. 当水/琼脂混合物从高压灭菌器中取出后，通过偶尔轻轻旋转烧瓶，使其冷却至可触碰的温度。
   7. 将水/琼脂混合物与葡萄汁/蔗糖混合物混合，并搅拌至充分均匀。
   8. 使用血清移液管将8–10 ml葡萄混合物加入小型培养皿（35 × 10 mm规格）的皿盖中。使混合物液面高于皿盖边缘，形成凸面形状。
   9. 让葡萄培养基平板在室温下冷却2小时，然后存放在密封容器中，置于4 ºC保存。
2. 制备酵母糊。
   1. 在50 ml锥形管中，将6 ml磷酸盐缓冲液（PBS）加入4 g活性干酵母中，用刮刀搅拌至均匀。
   2. 将酵母糊在4 ºC下保存。
3. 取少量酵母糊（约1/8茶匙）置于葡萄培养基平板中央，用刮刀抹平表面不平整处。
4. 将葡萄培养基平板放入培养箱，直至其达到环境温度。
5. 将目标果蝇转移至产卵室，并将带有酵母糊的一面朝内放置于其上。用胶带将葡萄培养基平板固定在产卵室上，防止脱落。务必在葡萄培养基平板底部标注重要的基因型和日期信息。
6. 将产卵室倒置，使果蝇可在葡萄培养基平板上产卵。
7. 用盒子或遮盖物罩住产卵室，并将其置于25 ºC培养箱中。
8. 让果蝇产卵4–6小时。
9. 结束收集时，将葡萄培养基平板从产卵室中取出，并将果蝇转移回其食物瓶中。用刮刀清除葡萄培养基平板上多余的酵母糊。将葡萄培养基平板置于较大的培养皿中，在25 ºC的加湿培养箱中保存约24小时。

2. 将幼虫转移至实验培养基

1. 准备实验用食物。
   注意：本食物配方基于布卢明顿果蝇保种中心（Bloomington stock center）的配方¹⁸。重要修改包括增加酵母用量，以优化食物的营养价值，该优化依据是在25 ºC条件下，幼虫达到游走期的时间（在收卵后112至120小时之间）进行评估。尽管我们发现此配方非常适合实验幼虫的健康与发育，但只要通过阳性和阴性对照进行校准，任何其他食物配方亦可接受，相关对照示例见步骤3.10。
   1. 量取1,600 ml蒸馏水。
   2. 在1 L烧杯中混合134 g玉米粉、10.6 g果蝇琼脂II型及部分水（约500 ml），使用电动手持搅拌器搅拌2分钟。
   3. 在另一个1 L烧杯中混合70 g活性干酵母、18.4 g大豆粉、84.8 g麦芽提取物及部分水（约500 ml），使用电动手持搅拌器搅拌2分钟。
   4. 轻轻摇动每个烧杯，将内容物倒入4 L锥形瓶中。用剩余的水冲洗烧杯，并将冲洗液一并加入锥形瓶。
   5. 量取140 ml淡玉米糖浆加入锥形瓶中，轻轻摇动混合。
   6. 在121 ºC（250 ºF）下，以液体模式高压灭菌50分钟。
   7. 灭菌后，将食物倒入4 L烧杯中，使其冷却。可通过电动手持搅拌器搅拌以加速冷却过程。
   8. 待锥形瓶冷却至可触碰时，加入8.8 ml丙酸和16.8 ml Drosophila 抗真菌剂/乙醇溶液，充分混匀。（制备Drosophila 抗真菌剂溶液的方法：将380 g Drosophila 抗真菌剂加入1 L 200度乙醇中，在加热板上搅拌至溶解，注意溶液温度不得超过70 ºC。）
   9. 将食物倒入试管中，使食物深度约为1英寸，在室温下冷却2至3小时。塞上棉塞，置于25 ºC培养箱中保存，一周内使用完毕。
2. 用刮刀多次插入食物试管的表层，划出刻痕，以帮助幼虫钻入和取食。
3. 在收卵结束后的22至24小时，使用小号画笔收集约50只大小相近的一龄幼虫（L1）。将幼虫转移至实验用食物中。用实验室擦拭纸清洁画笔，并确保画笔上无残留幼虫后，再进行下一个基因型的操作。
4. 将装有幼虫的试管置于25 ºC培养箱中，使其正常发育。

3. 测定幼虫中的脂肪含量

1. 配制溶液。
   1. 配制 1 L 的 10× PBS 储存液。
      1. 在装有搅拌子的 2 L 烧杯中加入 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na₂HPO₄ 和 2.4 g KH₂PO₄，加入 800 ml 水。在不加热的情况下搅拌，直至所有盐完全溶解。调节 pH 至 7.4，再加水定容至 1 L。
   2. 配制 2 L 的 1× PBS。将 200 ml 10× PBS 储存液加入 1,800 ml 水中。
   3. 使用上述 1× PBS 储存液配制 20% w/v 蔗糖溶液。
2. 当试管壁上有 20–40 条幼虫向上爬行时（通常在收卵后第五天），从培养箱中取出幼虫试管。记录实验的日期、时间以及爬行幼虫的数量。
3. 在 50 ml 锥形管中加入 11.5 ml PBS 和 9 ml 20% 蔗糖，配制实验用溶液。
4. 向试管中加入 20% 蔗糖溶液，直至液面距离试管口 0.5–1 英寸。
5. 用刮勺轻轻搅拌食物表层，使仍埋在食物中的幼虫释放出来。所有幼虫将上浮至蔗糖溶液表面。
6. 用镊子将幼虫轻轻转移至步骤 3.3 中的初始蔗糖浓度溶液中。
7. 用刮勺在该溶液中轻轻搅拌幼虫。
8. 盖上锥形管盖，反复倒置数次，充分混匀溶液。
9. 打开锥形管盖，轻轻旋转以形成温和的涡流。
10. 静置幼虫，使其上浮至溶液表面或沉降至底部。等待 2–5 分钟，使幼虫完全沉降。
    注意：若仍有部分幼虫无法明确判断为上浮或下沉，可设定一条分界线作为判断标准，将幼虫归类为“上浮”或“下沉”，并对所有基因型使用相同标准。我们以锥形管底部的夹角处作为分界线。adp 或 sir2¹⁷ 突变体幼虫可作为阳性对照，lsd2¹⁹ 突变体幼虫可作为阴性对照，用于校准实验。
11. 记录上浮幼虫的数量及所测试的具体浓度。
12. 向实验溶液中加入 1 ml 20% 蔗糖，以提高溶液密度。
13. 重复步骤 3.7 至 3.10，记录上浮幼虫数量及新的浓度。
14. 重复执行步骤 3.12 和 3.13，直至至少 95% 的幼虫上浮。
15. 用镊子将所有幼虫转移至盛有 PBS 的解剖皿中。
16. 在显微镜下观察幼虫，记录是否存在小型幼虫、前蛹、蛹或其他不同基因型之间的差异。
    注意：理想情况下，所有幼虫应外观均一且处于相同的发育阶段。我们仅在这些条件下观察到稳定的脂肪含量测量结果。
17. 记录幼虫总数。
18. 用镊子将 10 条幼虫转移至实验室擦纸以吸干水分。标记一个微量离心管，并将 10 条幼虫放入管中。
19. 将幼虫在液氮中迅速冷冻，随后在 -20 ºC 下保存。

结果

图1 展示了基于浮力的检测方法如何在基因操作的幼虫中检测到更高和更低的脂肪储存水平。 图1A 显示，在幼虫脑中激活或抑制特定神经元亚群（E347）会分别导致脂肪储存减少和增加。两种情况下均使用了相同的遗传背景对照。图1B 展示了通过密度检测获得的该表型经中性脂质提取，并通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS）进行定量验证的示例。

图 1. 幼虫大脑特定区域的神经元功能对体脂调控具有必要性和充分性。通过...

讨论

目前已开发出多种用于测定脂质水平的技术^8-10。然而，上述基于浮力的检测方法克服了这些技术中的诸多主要缺陷。首先，该检测方法极为快速，完成一个完整浓度梯度的测试仅需30至60分钟，相较于目前大多数常用技术是显著的改进。例如，通过质谱法（MS）进行脂质定量需要7至9小时来分离脂质，另需数小时进行分析。这在对大量动物进行筛选时构成了明显障碍。通过快速测量浮力表型，可迅速聚焦于具有目标表型的基因型。其次，密度检测仅需使用常见试剂，如盐类（用于PBS）和蔗糖，这使得对大量幼虫进行筛选或快速测试特定基因型变得更加简便且成本更低。最后，该方案具有非侵入性，实验结束后幼虫仍存活，因而可对同一批动物继续开展后续实验，例如特定脂质定量、转录本或蛋白质分析。此外，回收的幼虫还可继续培养至成虫阶段。

与其他方法相比，该技术的另一优势在于对群体中脂肪水平微小变化的敏感性更高。通过对50条幼虫的群体进行完整的浓度梯度实验，即使幼虫开始漂浮和完全漂浮的浓度与对照组无差异，群体脂肪水平的微小变化仍可通过中间浓度的变化被识别出来。其他脂肪定量方法可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌琼脂	VWR	214030
Welch's 原味 100% 葡萄汁
蔗糖	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
乙醇			200 proof
面包酵母	Fleichmann's
黄色玉米粉	Quaker		强化去胚芽
果蝇琼脂 II 型	Apex	66-104
大豆粉	ADM Specialty Ingredients	062-100
麦芽提取物	Breiss	5748
淡色玉米糖浆	Karo
丙酸	VWR	U330-09
氯化钠	Fisher	50147491
磷酸二氢钾	Sigma	P5655-100G
无水磷酸钠	Fisher	S3933
氯化钾	Fisher	P330-500
35 × 10 mm 培养皿	Fisher	08-757-100A
50 ml 圆锥形离心管	Fisher	50-869-569