本文介绍一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）三龄（L3）幼虫阶段整体脂肪水平的方法。该方法利用脂肪组织相对较低的密度，以区分脂肪储存量发生改变的幼虫。基于浮力的分析是一种快速、可重复且经济高效的筛选工具。
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本文内容
摘要
摘要
黑腹果蝇 是脂肪调控研究中的关键实验体系。目前已有多种技术可用于检测储存脂肪的水平 果蝇，但大多数方法成本高昂和/或操作繁琐，且存在明显局限性。本文介绍一种快速、廉价测定L3期生物体脂肪含量的方法 果蝇 幼虫。该技术基于脂肪组织与瘦肉组织之间的密度差异，可快速检测脂肪与瘦肉表型。我们通过将该方法与中性脂质提取结合气相色谱-质谱联用（GCMS）测定的体脂百分比进行比较，验证了其准确性。此外，我们还详细阐述了幼虫收集与同步化的实验方案及相关实验配方。下述技术克服了目前最常用的脂质定量方法的主要缺陷，能够在保持幼虫完整性的前提下，快速、灵敏地筛选L3幼虫的脂肪调控表型。该检测方法在利用 果蝇.
引言
Drosophila melanogaster 已被用于遗传学及其他基础生物学问题的研究超过一个世纪。在过去的几十年中，人们逐渐认识到，Drosophila 是研究多种人类疾病的有力工具。由于与人类疾病相关的基因中有 70 - 80% 拥有已鉴定的果蝇同源基因1-4，Drosophila 提供了一个简化但具有可转化性的系统，可用于研究复杂的疾病。其中，代谢研究尤其受益于这类模型。不仅果蝇与人类在代谢遗传机制上高度保守，相关的器官和细胞类型也非常相似2,5。例如，果蝇的脂肪体同时储存三酰甘油（TAG）和糖原，其功能类似于哺乳动物的肝脏和白色脂肪组织6。利用Drosophila 作为人类肥胖症的模型，极大地加深了我们对脂质代谢及肥胖遗传机制的理解7。发育的幼虫阶段对于研究营养物质在储存与利用之间的分配尤为有用，因为该阶段专注于摄食，并储存能量以供化蛹时使用。
目前，已有多种不同的定量方法用于测定黑腹果蝇（Drosophila）中的脂肪储存水平。其中应用最广泛的方法是偶联比色法（CCA）8,9。CCA 最初是为测定人血清中的甘油三酯（TAG）水平而开发的，其原理基于从甘油三酯骨架中释放出的甘油会经历一系列反应，最终通过氧化还原偶联反应生成有色....
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方案
1. 收集具有目标基因型的果蝇的卵
注意：理想的杂交组合包含 150 只处女蝇和至少 75 只雄蝇。品系保种的数量应至少包含 200 只果蝇。
- 制备葡萄培养基平板。
- 在4 L的烧瓶中，将37.5 g琼脂加入1.5 L蒸馏水中。
- 在121 ºC（250 ºF）条件下，将水/琼脂混合物高压灭菌50分钟。
- 在水/琼脂混合物灭菌的同时，将50 g蔗糖加入500 ml葡萄汁中，并在加热磁力搅拌器上用搅拌子搅拌，直至蔗糖完全溶解。
- 关闭加热，继续搅拌使葡萄汁/蔗糖混合物冷却至70 ºC以下。使用酒精温度计检测内部温度。
- 向温热的葡萄汁/蔗糖混合物中加入3 g Drosophila 抗真菌剂（例如，Tegosept），搅拌至溶解。
- 当水/琼脂混合物从高压灭菌器中取出后，通过偶尔轻轻旋转烧瓶，使其冷却至可触碰的温度。
- 将水/琼脂混合物与葡萄汁/蔗糖混合物混合，并搅拌至充分均匀。
- 使用血清移液管将8–10 ml葡萄混合物加入小型培养皿（35 × 10 mm规格）的皿盖中。使混合物液面高于皿盖边缘，形成凸面形状。
- 让葡萄培养基平板在室温下冷却2小时，然后存放在密封容器中，置于4 ºC保存。
- 制备酵母糊。
- 在50....
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结果
图1 展示了基于浮力的检测方法如何在基因操作的幼虫中检测到脂肪储存量的升高和降低。 图1A 显示，在幼虫大脑中激活或抑制特定神经元亚群（E347）会分别导致脂肪储存量降低和升高。两种情况下均使用了相同的遗传背景对照。 图1B 展示了一个实例，说明通过密度检测获得的表型可通过中性脂质提取并结合气相色谱-质谱法（GCMS）进行定量验证。
图 1. 幼虫脑特定区域的神经元功能对体脂调控具有必要性和充分性。通过过表达.......
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讨论
目前已开发出多种用于测定脂质水平的技术8-10。然而，上述基于浮力的检测方法克服了这些技术中的诸多主要缺陷。首先，该检测方法极为快速，完成一个完整浓度梯度的测试仅需30至60分钟，相较于目前大多数常用技术是显著的改进。例如，通过质谱法（MS）进行脂质定量需要7至9小时来分离脂质，另需数小时进行分析。这在对大量动物进行筛选时构成了明显障碍。通过快速测量浮力表型，可迅速聚焦于具有目标表型的基因型。其次，密度检测仅需使用常见试剂，如盐类（用于PBS）和蔗糖，这使得对大量幼虫进行筛选或快速测试特定基因型变得更加简便且成本更低。最后，该方案具有非侵入性，实验结束后幼虫仍存活，因而可对同一批动物继续开展后续实验，例如特定脂质定量、转录本或蛋白质分析。此外，回收的幼虫还可继续培养至成虫阶段。
与其他方法相比，该技术的另一优势在于对群体中脂肪水平微小变化的敏感性更高。通过对50条幼虫的群体进行完整的浓度梯度实验，即使幼虫开始漂浮和完全漂浮的浓度与对照组无差异，群体脂肪水平的微小变化仍可通过中间浓度的变化被识别出来。其他脂肪定量方法可.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
K.E.H. 获得了美国国立卫生研究院分子生物学培训基金（NIH-T32-GM08730）的支持。本研究由美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所基金（NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932）和美国心脏协会奖项（AHA Award 12BGIA11930014）资助，资助对象为 T.R.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂 | VWR | 214030 | |
| Welch's 原味 100% 葡萄汁 | |||
| 蔗糖 | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| 乙醇 | 200 proof | ||
| 面包酵母 | Fleichmann's | ||
| 黄色玉米粉 | Quaker | 强化去胚芽 | |
| 果蝇琼脂 II 型 | Apex | 66-104 | |
| 大豆粉 | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| 麦芽提取物 | Breiss | 5748 | |
| 淡色玉米糖浆 | Karo | ||
| 丙酸 | VWR | U330-09 | |
| 氯化钠 | Fisher | 50147491 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | P5655-100G | |
| 无水磷酸钠 | Fisher | S3933 | |
| 氯化钾 | Fisher | P330-500 | |
| 35 × 10 mm 培养皿 | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | Fisher | 50-869-569 |
参考文献
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Usin....
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