Hybrid-Cut：一种改进的难处理植物组织样本切片方法

摘要

本方案描述了一种简单的杂交切片（Hybrid-Cut）组织切片方法，适用于难以处理的植物组织。高质量的组织切片可用于解剖学研究及其他生物学研究，包括原位杂交（in situ hybridization, ISH）。

摘要

保持植物切片的完整性对于在细胞、组织甚至器官水平上研究详细的解剖结构至关重要。然而，某些植物细胞具有坚硬的细胞壁、坚韧的纤维和晶体 草酸钙，二氧化硅 等等。），以及高含水量，这在植物组织切片过程中常常会破坏组织完整性。

本研究建立了一种简便的杂交切片（Hybrid-Cut）组织切片方法。该方案改良了基于石蜡的切片技术，显著提高了来自不同植物组织切片的完整性。植物组织在切片前先包埋于石蜡中，并在-16 °C的冷冻切片机中进行切片。低温条件下切片可硬化石蜡块，减少撕裂和划伤，从而显著改善组织完整性。该方法已成功应用于富含草酸钙晶体的蝴蝶兰（Phalaenopsis）组织，以及水稻、玉米和小麦等植物难以处理的生殖器官和叶片组织。此外，杂交切片法获得的高质量组织切片可与原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术联用，用于揭示目标基因的空间表达模式。综上所述，该方案特别适用于含有高含量晶体或二氧化硅的难处理植物组织。高质量的组织切片有助于开展形态学及其他生物学研究。

引言

石蜡包埋切片法是一种广泛用于解剖学研究的技术。完整组织结构的保存对于形态学和生物学研究至关重要。石蜡包埋切片技术具有优势，因为石蜡包埋能够很好地保持细胞和组织的形态。此外，石蜡块可方便地长期储存。然而，石蜡包埋切片不适用于含有细胞内晶体的植物组织。细胞内的晶体在切片过程中常常会撕裂石蜡带，破坏组织完整性。

与石蜡切片相比，冷冻切片速度相对较快，且无需固定、连续脱水或包埋介质渗透即可获得切片 ¹冷冻切片适用于多种应用，如免疫组织化学， 原位 杂交和酶组织化学。冷冻切片的另一个优点是，该方法无需经过高温和化学处理等可能导致变性的步骤，因此组织切片中的细胞分子得以良好保存。 ²冷冻切片通常比石蜡切片更适用于动物组织研究。然而，在植物组织中，冷冻切片并非首选方法，因为冷冻温度有时会导致冰晶形成，从而影响切片完整性。尽管可通过渗透调节手段，如蔗糖溶液、聚乙二醇（PEG）或甘油处理 ³ 据报道可在冷冻条件下减少冰晶形成，但改善效果尚不理想。

为了适应不同的环境，不同植物通常具有独特的组织质地，植物细胞也进化出坚硬的细胞壁、坚韧的纤维和晶体^4,5。例如，不溶性草酸钙晶体和硅质体在植物中较为常见⁶。已有研究报道，硅质体/晶体有助于维持禾本科植物的植株结构、直立性，并防止病害或虫害^7-9。

盆栽兰花和切花兰花市场蓬勃发展，已成为一个不断增长的产业。 蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite） （蝴蝶兰）是中国台湾最重要的出口观赏植物之一。为深入了解其开花过程中的形态和生理变化，已开展了大量研究工作。 蝴蝶兰 兰花。花序梗的 蝴蝶兰 兰花从叶基部的腋芽开始发育。在经历一段低温环境（约一个半月）后，腋芽膨大，打破休眠，并从叶基部突出，发育成幼嫩的花序。为了理解花序启动过程中的生理、细胞和分子机制，必须建立一种可靠的解剖学技术，以便及时观察组织或标记物。然而，由于兰花组织中普遍存在晶体，尤其是在腋芽中，这给解剖学研究带来了困难。

本研究旨在改进以往被认为在技术上具有挑战性的顽拗型植物组织的切片完整性。本文展示了一种名为 Hybrid-Cut 的改进方案。该方法是一种基于石蜡的切片技术，使用冷冻切片机进行操作。石蜡包埋可有效解决植物组织含水量高的问题。在低温条件下切片可使石蜡块硬化，减少晶体撕裂现象，显著提高组织完整性。该方案显著改善了顽拗型植物样品的组织完整性。

方案

1. 固定与包埋

1. 试剂准备
   1. 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）
      1. 在800 ml双蒸水（ddH₂O）中加入80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na₂HPO₄和2.4 g KH₂PO₄，用HCl调节pH至7.4。用ddH₂O定容至1 L，然后加入1,000 µl焦碳酸二乙酯（DEPC），剧烈振荡。将PBS在室温下储存过夜，次日于121 °C高压灭菌20分钟。
   2. 1x PBS
      1. 将储存的10x PBS用ddH₂O按1:10比例稀释，得到终浓度为0.01 M Na₂HPO₄、0.002 M KH₂PO₄、0.003 M KCl和0.13 M NaCl的溶液。
   3. 多聚甲醛（PFA）固定液
      注意：多聚甲醛具有毒性。应在通风橱中配制，佩戴手套操作。
      1. 配制250 ml PFA固定液时，将100 ml 1x PBS加热至70 - 80 °C，加入1,750 µl NaOH。然后加入10 g多聚甲醛，充分搅拌至完全溶解。将溶液置于冰上冷却后，用H₂SO₄调节pH至7.2（每100 ml约需260 - 270 µl）。
      2. 用1x PBS将体积调至250 ml，加入625 µl戊二醛，使其终浓度为0.25%。加入250 µl Triton X-100和250 µl Tween 20，以促进固定液的渗透。
         注：PFA固定液可在4 °C保存一个月而不丧失固定能力。
   4. 使用DEPC处理水配制不同浓度的乙醇（30%、50%、70%、85%和95%）。
2. 植物样品采集
   1. 腋芽
      1. 选用处于四叶期的成熟Phalaenopsis蝴蝶兰植株。用手沿中脉撕去叶片。
      2. 用锋利的解剖刀小心地从单轴茎上第三或第四片叶基部切下腋芽。
   2. 种子样品
      1. 在授粉后4个月采集成熟的兰花蒴果。用解剖刀纵向切开蒴果，轻轻摇动开口处，将干燥种子散落在滤纸上。
   3. 原球茎
      1. 将成熟的兰花种子播种于1/2x Murashige和Skoog琼脂平板上，在组织培养室中于12小时光照周期和25 °C恒温条件下培养。播种后7周取绿色原球茎作为样品。
   4. 原球茎样体（PLBs）
      1. 将兰花PLBs接种于T2再生琼脂平板上，培养条件如前所述¹⁰，并置于与步骤1.2.3.1相同的生长环境中。采集高度为5 - 8 mm的10个PLBs。
   5. 叶片样品
      1. 按照步骤1.2.1.1所述方法，从成熟Phalaenopsis蝴蝶兰植株上采集叶片组织。
      2. 用锋利的解剖刀从第二片新生叶片上切下一小块组织（7 mm长 × 5 mm宽）。
   6. 根样品
      1. 使用与步骤1.2.1.1中相同的植株，用锋利的解剖刀切取1 cm长的根尖组织。
   7. 幼花序
      1. 用锋利的解剖刀从花梗顶端切取10 cm长的幼花序组织。
   8. 花蕾
      1. 从兰花花梗上切下直径约5 mm的小花蕾，纵向切取部分花蕾组织（厚度约3 mm）。
   9. 禾本科作物的叶片和小穗组织
      1. 从水稻、小麦和玉米植株的第一片新生叶片上切取1 cm长的叶片组织。
      2. 在开花前一天，从植株（水稻、小麦和玉米）上采集10个小穗。
3. 固定
   1. 立即将植物样品转移至含有15 ml冰冻PFA固定液的玻璃闪烁瓶中进行固定。
   2. 在4 °C冷室中对植物样品施加真空（约720 mm Hg），维持15 - 20分钟（应有小气泡从样品中释放）。重复此步骤，直至大多数组织在解除真空后下沉。保持真空过夜，次日缓慢释放真空。
4. 脱水
   注：从固定到浸润步骤均使用同一容器。倾倒或用移液器移除前一步的溶液，并向瓶中加入15 ml新溶液。根据组织质地，质地较硬的组织（如兰花腋芽、种子、原球茎、PLB以及水稻、小麦和玉米的小穗）处理时间较长；质地较软的组织（如兰花花蕾、幼花序、叶片和根，以及水稻、小麦和玉米的叶片）处理时间较短。
   1. 固定后，将样品置于15 ml 1x PBS中，在冰上浸泡10分钟。
      1. 在室温下用15 ml系列乙醇对样品进行脱水处理，顺序如下：30%乙醇30分钟，50%乙醇30分钟，70%乙醇1小时，85%乙醇对较硬组织处理54分钟、对较软组织处理30分钟，95%乙醇对较硬组织处理54分钟、对较软组织处理30分钟，100%乙醇处理两次，每次对较硬组织54分钟、对较软组织30分钟。
         注：植物样品可在4 °C的70%乙醇中保存数月。
5. 石蜡浸润
   1. 在室温下，用15 ml乙醇与二甲苯替代物的混合液对样品进行浸润处理，较硬组织每次54分钟，较软组织每次30分钟，顺序如下：乙醇/二甲苯替代物（2:1, v/v）、乙醇/二甲苯替代物（1:1, v/v）、乙醇/二甲苯替代物（1:2, v/v），纯二甲苯替代物两次。注意：二甲苯有毒，应在通风橱中操作。
   2. 将样品置于含15 ml二甲苯替代物与石蜡混合液的容器中，在60 °C烘箱中浸润，较硬组织过夜，较软组织60分钟，顺序如下：二甲苯替代物/石蜡（2:1, v/v）、二甲苯替代物/石蜡（1:1, v/v）、二甲苯替代物/石蜡（1:2, v/v）。
   3. 每天用15 ml纯石蜡浸润样品两次，并在60 °C烘箱中孵育。
   4. 次日重复步骤1.5.3。
6. 组织包埋
   1. 在进行组织包埋前1小时开启组织包埋仪电源，以熔化石蜡储存槽中的石蜡。
   2. 将金属模具（底面尺寸为3.3 cm长 × 2 cm宽）置于62 °C温控托盘上预热，并向模具底部倒入约13 ml熔化石蜡。
   3. 用预热的镊子将步骤1.5.4中的一个组织样品转移至模具中，并调整至所需方向。
   4. 小心将模具移至冷却板上，静置直至石蜡完全凝固。

2. 组织切片

1. 石蜡切片法
   1. 通过将包埋盒放置于模具（与1.6.2节中相同尺寸）顶部制备蜡基底，注入熔融石蜡，待石蜡凝固后移除模具。
      注意：包埋盒将形成石蜡基底，用于固定样本的石蜡包埋块。
   2. 将石蜡包埋块修整至适当形状和大小，取若干石蜡碎片置于平坦的刮刀上。用酒精灯加热刮刀，使石蜡熔化，然后将熔化的石蜡涂于2.1.1节中的石蜡底座上，以固定包埋块。将包埋块夹紧于切片机中。
   3. 将新刀片安装到切片机上，并将角度调整为5度，以利于切片。
   4. 将样品石蜡块切成薄片（10 µm），方法如前所述 ¹¹.
2. 杂交切割切片法
   1. 使用剃刀将步骤1.6.4中的石蜡包埋样本修整成适当大小的柱状，顶端呈梯形表面。
   2. 在冷冻切片机载物台上中央位置加入适量最佳切割温度包埋剂（OCT）。将石蜡块固定于冷冻切片机载物台上，迅速将组织块调整至所需位置。
   3. 将石蜡包埋块/载物台转移至冷冻切片机舱内。在-42 °C条件下，使OCT包埋剂在速冻台上固化10分钟。OCT固化期间，切勿移动组织块。图2C).
   4. 将包埋蜡块/载台安装到冷冻切片机适配器之前，先让适配器和切片室温度分别冷却至 -20 °C 和 -16 °C。将组织切成 10 µm 厚的切片。
   5. 用镊子夹取组织切片，将其漂浮于含有800 µl经DEPC处理的水的多孔板中-L-将载玻片转移至42 °C的加热板上。
   6. 在42 °C的DEPC处理水中使切片展平，用滤纸从边缘吸去多余水分。
   7. 将载玻片置于42 °C的加热板上过夜，以使组织贴附于载玻片上。

3. 组织染色

1. 脱蜡
   1. 从加热板上取下玻片，放入染色架中。在通风橱内向染色缸中加入150 ml二甲苯，并将染色架浸入二甲苯中5分钟。
2. 复水
   1. 用DEPC处理的水配制不同浓度的乙醇溶液（100%、95%、70%、50%和30%），分别向不同的染色缸中加入150 ml溶液。
   2. 将样品依次通过浓度递减的乙醇溶液进行复水，每步在室温下进行3分钟。将染色架中的玻片从一个染色缸转移至另一个含有不同浓度乙醇的染色缸：100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇。
   3. 复水完成后，将标本浸入ddH₂O中3分钟。
3. 苏木精染色
   1. 将组织切片浸入苏木精染液中染色1.5分钟。
   2. 用含1–2滴12 N盐酸（HCl）的ddH₂O短暂冲洗数秒，然后用ddH₂O快速洗涤。
4. 脱水
   1. 将样品依次通过浓度递增的乙醇溶液脱水，每步在室温下进行3分钟：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。在通风橱中用二甲苯透明处理5分钟。
5. 封片
   1. 在玻片上滴加约600 μl以二甲苯为基质的封片剂。小心地将盖玻片覆盖在标本上，避免产生气泡，以获得高质量图像。
   2. 让玻片在空气中过夜干燥。次日用显微镜观察标本。
      注：根据标本大小，图像在25X至400X放大倍数下采集。

4. 原位 杂交

1. 探针合成
   1. 克隆 蝴蝶兰肌动蛋白 使用引物 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3' 和 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC-3' 扩增基因特异性编码序列（获得 242 bp 的 PCR 扩增产物）并 CyclinB1;1 使用引物5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3'和5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3'扩增基因特异性编码序列（得到327 bp的PCR扩增产物），方法如前所述 ¹².
   2. 将特定编码序列连接至载体中（例如， pGEMT）按照制造商的说明书进行操作。
   3. 使用SP6/T7 DIG RNA标记试剂盒，按照制造商说明书制备地高辛（DIG）标记的正义链和反义链探针。
2. 原位 杂交
   1. 切取 2^nd 和 3^rd 使用Hybrid-Cut法获取的腋芽组织切片（厚度10 µm），并将切片置于涂覆载玻片上。
   2. 用二甲苯脱蜡组织切片（见3.1.1），再用梯度递减的乙醇溶液水化（见3.2.2），然后在37 °C下用2 mg/ml蛋白酶K消化30分钟。
   3. 执行 原位 根据先前所述方案进行杂交 ^11,13 并作了一些修改， 即，杂交温度为 肌动蛋白 59 °C 和 60 °C CyclinB1;1 将载玻片与40 ng DIG标记的RNA探针杂交。
   4. 使用硝基蓝四氮唑盐/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT/BCIP）溶液检测杂交信号，方法如所述。 ¹¹.

结果

Hybrid-Cut 可提高组织切片的完整性

了解兰花生殖花结构的解剖结构对于研究其花器官起始的潜在机制至关重要。然而，Phalaenopsis 兰花细胞内草酸钙晶体的积累使得此类研究极具挑战性。为克服在切片过程中因晶体导致组织撕裂的问题（图1），我们开发了一种名为 Hybrid-Cut 的系统。该方案结合了传统的石蜡包埋与冷冻切片技术。我们首先在 Phalaenopsis 兰花的腋芽中测试了 Hybrid-Cut 方法，因为其组织硬度高且晶体含量丰富，历来难以处理。腋芽组织用 4% PFA 固定（见方案，步骤 1.3）。经过梯度乙醇脱水和石蜡浸润后，将腋芽包埋于石蜡块中。在切片前将石蜡块修整至合适大小（图2A）。随后，在冷冻切片机载物台中央加入少量 OCT 包埋剂（图2B），再将石蜡块通过 OCT 粘附于载物台上。将载物台置于冷冻切片机中孵育 10 分钟，使 OCT 完全凝固后进行切片（图2C），随后在 -16 °C 的环境中进行冷冻切片（图2D）。

作为对比，对含有蝴蝶兰（Phalaenopsis）腋芽的石蜡包埋块进行了常规切片机切片。如图1A所示，切片后观察到石蜡带出现严重撕裂。组织完整性和细胞结构也受到破坏（图1B）。而采用Hybrid-Cut方法则获得了完整的组织切片（图3A），且组织结构完整性得以良好保持（图3B）。

杂交切割法在 P. aphrodite多种组织中的应用

为了进一步验证 Hybrid-Cut 方法的适用性，我们测试了蝴蝶兰（Phalaenopsis）的不同组织。由于种子种皮硬化，通常难以获得组织完整性良好的种子切片。采用本方案后，种子的精细结构在切片后得以良好保存（图4A）。如图4A所示，常见的储存产物——蛋白体¹⁴，可被清晰识别。Hybrid-Cut 方法在一个月大的原球茎（由种子萌发形成的结构）的茎尖分生组织（图4B）以及原球茎样体（PLBs，图4C）中同样成功应用，并展示了其精细结构。在 PLB 的切片中观察到细胞内晶体。Phalaenopsis 蝴蝶兰具有厚而多肉的叶片，进行景天酸代谢（Crassulacean acid metabolism, CAM）型光合作用¹⁵。叶片横切面显示了较大的叶肉细胞以及包含木质部和韧皮部的维管束（图4D）。在白天，叶片远轴面仅观察到少量气孔开口（图4D）。事实上，CAM 植物在干旱条件下通过夜间开放气孔以最大化碳同化，同时最小化水分流失^15,16。P. aphrodite 的根尖分生组织如图4E所示。根尖细胞似乎含有大量晶体，且切片后晶体结构保存极为完好（图4E）。幼嫩花序的纵切面提供了关于幼嫩花原基结构的信息（图4F）。此外，在已完成分化的 5 mm 花蕾的纵切面中，可清晰识别萼片、花瓣、唇瓣和花粉块（图4G）。请注意，晶体在幼嫩花蕾的萼片中有所积累。总之，该方案能稳定维持组织完整性，获得完整的形态结构，适用于解剖学及潜在的细胞学研究。

杂交切割法在谷类作物中保持组织完整性

我们还在含有高硅含量的谷类作物（如水稻、小麦和玉米）上测试了Hybrid-Cut方法^17,18。如图5所示，采用Hybrid-Cut方法后，水稻、小麦和玉米叶片横切面的组织完整性显著改善。从水稻叶片切片中可清晰识别出木质部、韧皮部、叶肉细胞、气孔以及控制叶片卷曲以减少水分流失的泡状细胞。玉米叶片的花环结构（Kranz anatomy）、叶肉细胞和维管束^19,20也清晰可辨。值得注意的是，玉米叶片的近轴面和远轴面均具有高密度的气孔（图5）。此前已有报道，玉米叶片近轴面与远轴面气孔比例为0.7²¹。此外，本方案还成功获得了水稻、小麦和玉米小穗的详细细胞形态（图6）。已知小穗中含有丰富的二氧化硅⁹，通常会导致组织切片困难。

原位 杂交

基因组学和转录组学方法常用于注释基因功能。在发育或环境背景下提供目的基因转录本的空间分布信息，有助于深入理解这些基因的潜在功能。 原位 原位杂交（ISH）已用于在组织水平上定位基因表达模式 ^11,22-25此外，原位杂交（ISH）可在多细胞生物中提供细胞水平，甚至在某些情况下达到亚细胞水平的mRNA分布分辨率。 ²⁶在原位杂交（ISH）过程中，RNA和组织完整性对于获得所选转录本的可靠空间信息至关重要。我们采用Hybrid-Cut方案进行了ISH检测。 肌动蛋白 基因（PATC157348）使用引物 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3' 和 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC-3' 进行克隆，获得 242 bp 的 PCR 扩增片段。 细胞周期蛋白B1:1 (PATC146999) 基因特异性编码序列，使用引物 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' 和 5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' 扩增获得 327 bp 的 PCR 产物。ISH 后 肌动蛋白 和 细胞周期蛋白 B1:1 基因表达 在幼嫩和成熟的腋芽中进行了监测 (图7). 两个基因均在分生组织细胞中表达 2 的^nd 和 3^rd 腋芽，其中在3中检测到更强的信号^rd 腋芽。这些结果表明，Hybrid-Cut 能够保持良好的解剖结构，并提供空间基因表达模式。

图1： 传统石蜡切片导致组织严重撕裂。 含有蝴蝶兰（Phalaenopsis）腋芽的石蜡包埋块经过常规切片机切片。传统切片后可观察到石蜡带出现严重撕裂 (A)。组织完整性和细胞结构也受到破坏 (B)。箭头指示组织切片的严重撕裂区域，箭头尾部指示晶体结构。比例尺为 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： Hybrid-Cut 切片法。 腋芽组织经 PFA 固定后，进行脱水、石蜡浸润并包埋于石蜡块中。将石蜡块修整至适当大小 (A)。在冷冻台中央涂布适量的包埋剂（Optimal Cutting Temperature compound, OCT）(B)。将石蜡块粘附于冷冻台上的 OCT 上。在低温条件下，石蜡块通过 OCT 固定于冷冻台表面 (C)。在 -16 °C 的冷冻切片机腔室内进行组织切片 (D)。标尺分别代表 0.5 cm (A) 和 1 cm (B-D)。请点击此处查看该图的放大版本。

图3： Hybrid-Cut 可提高切片完整性。 含有蝴蝶兰（Phalaenopsis）腋芽的石蜡包埋块经过 Hybrid-Cut 切片处理 （A），该方法获得了组织完整性极佳的切片 （B）。箭头所示为嵌在腋芽组织中的内源性晶体结构。比例尺为 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4： 杂交切割技术在多种组织切片中的应用 蝴蝶兰 兰花 不同兰花 采用Hybrid-Cut法对组织进行切片，例如成熟阶段的兰花种子纵切面 （A），原球茎纵切面 （B），原球茎状体（PLB）的纵切面 (C)，叶片横切面 (D)，根的纵切面 (E)，幼嫩花序的纵切面 (F)以及幼嫩花蕾的纵切面 (G)组织切片经苏木精染色。SC，种皮；PB，蛋白体；M，分生组织；MP，母体原球茎；DP，子代原球茎；Ad，近轴叶面；Ab，远轴叶面；St，气孔；MC，叶肉细胞；VB，维管束；RC，根冠；fb，花蕾；Se，萼片；Pe，花瓣；La，唇瓣；Po，花粉块；Ro，蕊柱；Ca，胼胝体。箭头示晶体。比例尺代表20 µm（A–E）和200 µm（F–G）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：杂交切片法在多种谷类作物中保持了叶片组织的完整性。 使用传统石蜡切片法（左图）与本研究开发的杂交切片法（右图）对叶片组织进行比较。图像显示了水稻、小麦和玉米的叶片横切面。MC，叶肉细胞；Ph，韧皮部；St，气孔；BC，泡状细胞。箭头指示组织切片的撕裂部位。箭头指示硅质体。蓝色虚线圆圈标示C4植物玉米的花环结构。比例尺为20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图6： Hybrid-Cut 法在多种谷类作物中保持小穗组织完整性。 传统石蜡切片法与 Hybrid-Cut 法在小穗组织切片完整性方面的比较。箭头显示组织切片撕裂处，箭头指示硅质体。比例尺：20 µm（水稻），200 µm（小麦和玉米）。请点击此处查看该图的放大版本。

图7： 原位 杂交 肌动蛋白 和 CyclinB1;1 腋芽中的表达模式 蝴蝶兰 兰花 2 的组织切片^nd 腋芽和3^rd 使用 Hybrid-Cut 法制备腋芽分生组织。共使用 40 ng 的 肌动蛋白 和 CyclinB1;1 使用地高辛标记的探针进行杂交，正义探针作为阴性对照。箭头指示腋芽生殖分生组织的位置。比例尺为100 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

植物细胞具有坚硬的细胞壁、坚韧的纤维、晶体以及高含水量，这些特性在植物组织切片过程中容易导致组织撕裂。尽管石蜡切片法常用于植物组织，但内源性晶体在切片过程中往往会划伤植物组织（图1）。由于植物细胞本身含水量较高，使用冷冻切片机进行切片时常导致细胞破裂和组织切片开裂。

本研究建立了一种结合石蜡包埋与冷冻切片的技术，称为Hybrid-Cut，并成功获得了高质量的组织切片。该技术通过引入石蜡包埋解决了植物组织含水量高带来的问题，并在切片过程中通过低温使石蜡硬化，从而减少了切片撕裂现象（图3）。因此，与单纯的石蜡切片或冷冻切片相比，该改良方案在保持植物组织完整性的方面具有明显优势。

本文稿表明，Hybrid-Cut 方法可在多种组织中保持组织完整性 蝴蝶兰 兰花的腋芽、种子和原球茎（PLB） 等等。 含有高水平晶体的图示 3-4此外，该方案适用于水稻、玉米和小麦等含有高硅的谷类作物的生殖器官和叶片。图5-6）。该方案可能适用于纤维含量较高的木本植物。

通常情况下，充分固定组织对于 Hybrid-Cut 至关重要。我们发现，甲醛-酒精-冰醋酸（FAA）固定液在保持某些难处理组织（如顶芽、根）的组织完整性方面优于多聚甲醛（PFA）。 等等。 然而，PFA 在保持 RNA 完整性方面优于 FAA，因此建议使用 PFA 固定样本 原位 杂交（ISH）实验。此处描述的方案专为RNA原位杂交实验设计，因此所有试剂均经过DEPC处理以消除RNase污染，防止RNA降解。如果Hybrid-Cut切片用于解剖学研究，可使用常规的反渗透（RO）水及其配制的缓冲液或试剂。

将样本尺寸和厚度减小至3 mm以下有助于包埋渗透。此外，对于质地较硬的组织，需要延长脱水和渗透的浸渍时间。本方案的局限性可能源于样本固定、脱水或渗透不充分所导致的问题。因此，调整每一步骤的处理时间对于制备高质量的石蜡包埋块至关重要。通常情况下，质地越硬的组织所需的处理时间越长。

此外，我们证明了Hybrid-Cut与ISH联用可成功实现目标转录本的空间分布分析（图7综上所述，本实验方案适用于植物解剖学研究，并可提供所选基因的组织特异性RNA表达图谱。此外，该方法还可应用于其他分子生物学研究，如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测、荧光标记 原位 杂交 (FISH）和免疫染色技术。总之，这一改进的组织切片方案对植物学研究领域的科研人员具有重要的实用价值和帮助。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包埋中心模型 EC780-1	CSA
切片机模型 RM2255	Leica
冷冻切片机模型 CM 1950	Leica
Axio Scope A1 显微镜	Zeiss
含维生素的 Murashige & Skoog 培养基	Duchefa Biochemia	M0222.0050
无RNase表面去污剂	Apex	10-228
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Bio Basic Inc.	D801154
氯化钠（NaCl）	MDBio, Inc.	101-7647-14-5
氯化钾晶体（KCl）	J.T. Baker	7447-40-7
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	7558-79-4
磷酸二氢钾（KH2PO4）	Sigma-Aldrich	7778-77-0
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	16005
氢氧化钠（NaOH）	Showa	19430160
硫酸（H2SO4）	Sigma-Aldrich	7664-93-9
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	111-30-8
聚氧乙烯20山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）	J.T. Baker	9005-64-5
辛基酚聚氧乙烯醚（Triton X100）	J.T. Baker	9002-93-1
玻璃闪烁瓶	Newastar	DG60805-00020
真空干燥器	Violet Bioscience Inc.	TS-402030
旋片式真空泵 RZ2.5	Vacuubrand	36149406
乙醇	J.T. Baker	64-17-5
Sub-X	Leica Surgipath	3803670	二甲苯替代物
Paraplast Plus	Leica Surgipath	39602004	组织包埋石蜡
SUPERFROST 显微载玻片	Matsunami	S7441
FSC 22 Clear	Leica Surgipath	3801480	最佳切割温度化合物（OCT）
纯化二甲苯	Leica Surgipath	3803665
苏木精	Merck	HX305311
盐酸（HCl）	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Micromount	Leica Surgipath	3801731	封片介质
pGEM T-easy 载体	Promega	A1360
蛋白酶K	Roche	3115879001
SP6/T7 DIG RNA标记试剂盒	Roche	11175025910
NBT/BCIP 储存液	Roche	11681451001