本方案描述了用于区室化分析神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养方法。
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摘要
摘要
正常的神经元发育与功能是发育中及成年大脑正常运作的前提。然而，迄今为止，对于高度受控的复杂神经网络的形成与维持机制尚未完全阐明。有关神经元在健康与疾病状态下的未解问题多种多样，范围从基本发育过程的理解到人类相关病理学的研究，例如 阿尔茨海默病和 精神分裂症。对神经元最详尽的分析可在体外（in vitro）进行。然而，神经元是难以培养的细胞，其长期存活需要星形胶质细胞的额外支持。这种细胞异质性与分别解析神经元和星形胶质细胞功能的研究目标相冲突。本文介绍一种细胞培养检测方法，可在物理分离的条件下，实现纯化的原代神经元与星形胶质细胞在相同的化学成分明确的培养基中长期共培养。在此体系中，细胞培养物可存活长达四周，该方法适用于多种关于神经元-胶质细胞相互作用的研究。
引言
在过去的几十年中，人们对神经胶质细胞功能的普遍认识不断演变 从对神经元功能仅起支持作用的观点转变为发挥主动调节作用1. 由于它们在健康和疾病状态下对脑内稳态具有显著影响2，星形胶质细胞尤其受到科学界的关注。近年来，大量研究聚焦于神经元-胶质细胞相互作用 体内 和 体外3然而，大多数培养系统无法分别分析这两种细胞类型及其各自的分泌组。
多种方法利用神经元与胶质细胞的直接共培养，以实现神经元网络的长期存活及符合生理特征的发育4-6本方案在保持两种细胞物理分离的同时，实现了相同的目标7与条件培养基方法相比8,9我们的系统可用于研究神经元与星形胶质细胞之间的双向通讯。在细胞于共用培养基中成熟的过程中，可监测分泌性信号分子的表达。这一优势尤为重要，因为星形胶质细胞会释放多种可溶性因子，如细胞因子、生长因子以及细胞外基质分子。10,11从而调控神经元的生长与功能7,12因此，已证明将血小板反应蛋白添加至视网膜神经节细胞 体外 诱导突触的形成13然而，还需要其他尚未明确的因素才能使突触具备功能13此外，为了理解神经元-胶质细胞相互作用的基础，必须鉴定星形胶质细胞释放的分子。
小鼠和大鼠原代神经元与星形胶质细胞的培养方法已有先前文献报道14-16。本文介绍一种精巧且多功能的工具，可用于实现这两类细胞的间接共培养。由于两种细胞在物理上相互分离 但仍共享相同的培养基，因此可分别分析神经元、星形胶质细胞以及可溶性分子的作用，从而为研究神经元-胶质细胞相互作用提供一种强有力的手段。
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方案
小鼠实验遵循德国法律及德国神经科学学会的动物饲养指南。波鸿鲁尔大学的动物护理与使用委员会已授予相应的许可。
1. 皮层星形胶质细胞的制备与培养
注意：在进行后续步骤前，至少需提前 7 天完成本方案的这些步骤，因为星形胶质细胞培养物应在神经元制备前发育成融合的单层。原代星形胶质细胞来源于出生后第 0–3 天（P0–3）小鼠幼崽的混合胶质细胞培养物。每瓶 T75 培养瓶使用三只小鼠（6 个皮层）。
- 在无菌条件下，通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10% v/v马血清和0.1% v/v庆大霉素配制星形胶质细胞培养基。培养基于4 °C保存，最多可保存2周。
- 用 10 µg/mL 的溶液包被 3 个 T75 培养瓶 聚-D-赖氨酸（PDL；溶于细胞培养级水）孵育至少 1 小时 在37 °C、6% v/v CO存在条件下2包被后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤烧瓶两次，以去除未结合的阳离子，并加入9 mL 星形胶质细胞培养基
- 对于脑组织的制备，加入10 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）至 1x 10 cm 培养皿，加入 1 mL 将HBSS加入1个15 mL离心管中（无论使用脑组织的数量）。操作过程中，将一把手术剪、两把精细镊子和一台双目显微镜置于方便取用的位置。
- 用手术剪迅速将3只幼鼠断头，并将头部收集到一个空的10 cm培养皿中。
- 在双目镜下进行皮质组织的制备。使用两把精细镊子，从颈部开始沿中线向上至眼部水平，剥离颅骨背侧的皮肤。随后，脑组织及其血管即可在颅骨下清晰可见。
- 用镊子固定头部前端，从后端开始沿颅骨中线剪开。随后，剪除左右两侧颅骨，以暴露脑组织。
- 闭合镊子尖端，将其从腹侧置于脑组织下方。将脑组织从颅骨中取出，并转移至盛有HBSS的10 cm培养皿中。以相同方法处理其余样本，直至所有脑组织均收集至培养皿中。
- 收集脑组织后，使用一对镊子像使用剪刀一样夹住后脑部分，将其与大脑皮层分离。用另一对镊子在两个半球之间沿中线做切口。用镊子小心固定脑组织，再用第二对镊子剪除中脑和嗅球，最终获得大脑皮层的两个半侧。
- 用一对镊子固定一侧大脑皮层半球，用另一把镊子从外侧边缘分离脑膜，然后将其从皮层表面剥离。
- 将皮层半侧翻转，使其表面朝下贴近培养皿；使用一对镊子仔细解剖并移除新月形的海马体。将单个皮层组织转移至锥形15 mL离心管中 使用一把闭合的镊子夹取单个皮质组织并转移至管中。
- 收集完所有皮层组织后，转移至无菌超净工作台，开始进行皮层组织解离的准备工作。
- 加入 1 mL DMEM 至 2 mL 反应管中加入0.1%（w/v）木瓜蛋白酶（30单位）。将悬液置于37 °C水浴中孵育，直至溶液变澄清（约3分钟）。加入0.24 mg/mL L-半胱氨酸和 20 µg/mL 加入DNA酶并轻轻振荡。
注意：消化时，大约使用 1 mL 需要酶溶液。 - 过滤（0.22 µm 孔径）以获得 1 mL 在将其加入皮质组织之前，先置于无菌溶液中。将试管孵育30分钟至1小时 在 37 °C（即，置于水浴中）.
注意：步骤 1.11 - 1.14 至关重要，须在 15 分钟内完成。 - 为终止消化反应，加入 1 mL 星形胶质细胞培养基，并使用1 mL移液器轻轻吹打消化后的组织 移液器。进行吹打时，轻柔地上下移动移液器的活塞，从而反复吸取和推出皮质组织悬液。
- 组织解离成单细胞悬液后，加入 5 mL 星形胶质细胞培养基，216 × g 离心 5 分钟
- 小心吸除上清液，将沉淀物中的细胞重悬于 1 mL 星形胶质细胞培养基
- 将细胞悬液加入已补充9 mL星形胶质细胞培养基（见1.2）的T75培养瓶中。
- 在37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中孵育细胞24天后进行首次完全换液（10 mL），此后每2至3天更换一次培养基。
- 7天后，检查细胞是否已形成融合的单层。若未达到完全融合，需再等待2至3天，直至培养物完全融合。
注意：星形胶质细胞具有较大且扁平的细胞体，位于培养瓶底部，不形成明显的细胞突起。它们与位于上层的小型相位对比明亮的前体细胞和小胶质细胞不同 单层细胞17. - 为了去除前体细胞并获得纯化的星形胶质细胞培养物，将T75培养瓶置于摇床中，在37 °C下以250 rpm振荡过夜。确保培养瓶的滤膜用实验室封口膜密封，以防止CO₂培养箱中的蒸发2.
- 第二天，吸除培养基，加入10 mL新鲜培养基，其中补充20 µM胞嘧啶-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷（AraC），以清除残留的增殖细胞。
注意：在37 °C培养箱中用AraC孵育2 - 3 d， 6% CO2 将获得纯化的星形胶质细胞培养物。 - 通过光学显微镜下目视检查星形胶质细胞培养物的纯度。若在星形胶质细胞单层上仍残留有相位对比明亮的前体细胞和小胶质细胞17 （参见步骤1.16），重复步骤1.18和1.19。
注意：融合且纯化的星形胶质细胞单层可在培养箱（37 °C，6% v/v CO₂）中维持长达14天2在进行下一步之前完成此操作。每3天更换一半培养基。不要收集、冷冻和解冻星形胶质细胞，因为这些细胞会通过储存过程失去其对神经元的支持特性。
2. 星形胶质细胞间接共培养的准备
注：48 - 72 小时 在准备神经元之前，先将星形胶质细胞转移至细胞培养小室。通常情况下，单个 T75 培养瓶可提供足够的细胞数量，以支持一次制备所获得的神经元培养。
- 根据需要将多个插入式培养小室放入24孔板中。每孔加入10 µg/mL多聚-D-赖氨酸（PDL，溶于细胞培养级水）于37 °C、6% v/v CO2条件下包被约1小时。孵育后，用PBS洗涤小室两次。在此期间，可同时进行星形胶质细胞的制备。
注意：加入PBS的插入式小室可保留至星形胶质细胞悬液准备就绪。 - 吸除星形胶质细胞培养基（含AraC），并用10 mL PBS洗涤培养物一次，以确保去除任何残留血清。
- 向培养瓶中加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），于37 °C、6% v/v CO2条件下孵育约10分钟，进行细胞消化。
- 在显微镜下通过目视检查细胞脱落情况，并通过轻敲培养瓶侧面以促进细胞脱落。
注意：步骤2.5–2.8至关重要，应在15–20分钟内完成。 - 消化完成后，将细胞轻轻重悬于7 mL星形胶质细胞培养基中，转移至15 mL离心管。以216 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。
- 使用细胞计数板对细胞进行计数。
- 向24孔板各孔底部加入500 µL星形胶质细胞培养基，并将含25,000个细胞的500 µL细胞悬液接种至每个插入式小室中。于37 °C、6% v/v CO2条件下孵育。
注意：培养42–72 h 后，细胞将达约100%汇合。此时可通过免疫细胞化学方法验证培养纯度11。汇合后的培养物可维持最多7天，直至进入下一步实验。每3天更换一半培养基。
3. 原代海马神经元的制备
注意：原代小鼠海马神经元应来源于妊娠时间明确的小鼠胚胎 E15.5 至 E16 时期。
- 制备神经元培养基（MEM，含10 mM丙酮酸钠，0.1% w/v卵白蛋白）， 2% v/v B27 培养基添加剂，0.1% v/v 庆大霉素（经无菌过滤），以及制备用培养基（HBSS 加 0.6% w/v 葡萄糖和 10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸））。将神经元培养基置于滤瓶中，在 37 °C、6% v/v CO₂ 条件下预温育并预平衡2.
- 将玻璃盖玻片（直径12 mm）放入24孔板的孔中（使用专用于细胞培养小室的带缺口盖玻片）。
- 至少孵育1小时，浓度为15 µg/mL 聚-DL-鸟氨酸水溶液（细胞培养级），37 °C 条件下使用。每孔至少加入 500 µL，确保完全覆盖盖玻片。用 PBS 洗涤孔板两次。加样前保持 PBS 留在孔内，防止孔板干燥。
- 为分离海马体，准备3个直径10 cm的培养皿，每皿中加入制备液，另准备1个2 mL离心管，内含1 mL制备液。准备好剪刀和两把精细镊子。
- 通过颈椎脱位处死怀孕小鼠，用70%（v/v）乙醇清洗腹部进行消毒，然后使用锋利的剪刀切开腹部。小心剪下串珠状子宫并转移至盛有1x 10 cm培养皿的预冷培养液中。
- 接下来，将胚胎从子宫中取出。小心切开子宫，使用两把镊子在不损伤胚胎的情况下移除羊膜。随后，用剪刀将每个胚胎的头部剪下，并将头部分别转移至另一个盛有制备液的10 cm培养皿中。
- 继续进行头部的制备（方法与1.4 - 1.7中所述的制备过程类似）。
- 用一对镊子固定头部，并在靠近后脑的颈部区域沿垂直于神经轴的方向切开颅骨和皮肤。用第二对镊子提起颅骨和皮肤 覆盖皮肤，并将柔软的颅顶向头部的吻端弯曲，从而暴露脑组织。
- 借助两把镊子，将脑组织从颅腔中分离。操作时，闭合其中一把镊子，从嗅球开始沿颅骨逐步分离脑组织，并继续向后移动 向后脑方向收集脑组织，并将其放入另一个盛有预冷培养基的10 cm培养皿中。
- 按照上述星形胶质细胞制备方法（步骤1.6）从皮层部分分离海马。取出每个半球的海马，并将其收集至装有制备液的2 mL离心管中。
- 解剖完成后，将试管转移至无菌超净工作台，用含有木瓜蛋白酶的1 mL消化液消化海马组织。消化液的配制方法见步骤1.9–1.10，但需使用MEM替代DMEM。
注意：步骤 3.9 - 3.12 至关重要，应在 10 - 15 分钟内完成。 - 消化完成后，用移液器轻轻抽吸，小心吸出消化液。
- 用神经元培养基清洗海马体3次，每次清洗循环中依次加入1 mL新鲜培养基，然后小心吸除。不要离心细胞悬液。
- 最后一步洗涤后，用1 mL神经元培养基小心地吹打组织。
- 使用计数板对细胞进行计数，并在24孔板（步骤3.2中提到的培养板）的每个孔中接种35,000个细胞，每孔加入500 µL神经元培养基。
注意：可选地，可用台盼蓝对细胞等分试样进行复染，以评估细胞制备物的活力。通过显微镜目视检查控制接种密度（通常使用标准10倍物镜时，每个视野90 - 110个细胞）。 - 将神经元置于37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中2 1小时。
- 孵育结束后，将已准备好的插入式培养小室（接种有融合星形胶质细胞单层）从培养箱中取出（参见步骤2.8）。通过吸除星形胶质细胞培养基，并替换为500 µl新鲜的神经元培养基，更换培养液。
注意：插入物在培养 2 - 3 天（DIV）后应形成融合的星形胶质细胞单层 体外). - 使用无菌镊子小心地将含有星形胶质细胞的插入物放入含有神经元培养物的孔中（步骤 3.13）。
- 将获得的间接神经元-星形胶质细胞共培养物放回37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中2.
注意：在这些条件下，神经元可在完全定义的培养基中培养长达4周，无需更换培养基。对于长期培养，建议在24孔板的空孔中加入无菌水，以减少培养液蒸发。 - 执行 体外 在所需的培养周期后进行细胞分析（例如， 用于 免疫细胞化学、PCR、蛋白质印迹、电生理记录（膜片钳或微电极阵列）7,15,18.
注意：该培养系统也适用于对培养物进行急性和慢性药物处理11.
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结果
通过间接共培养系统对神经元培养物进行的分析具有多样性，可在培养物成熟的不同阶段进行。由于细胞可维持培养长达4周，因此能够对培养物开展长期研究。
左中侧面板中的示意图 图1 展示了共培养体系的设置。利用该系统可对两种细胞进行活细胞成像，如左上图（星形胶质细胞单层）和左下图（神经元网络）的相差显微图像所示。固定后可进行免疫细胞化学分析，如右上图和右下图所示。
在本模型中，神经元大约从第7天开始建立突触连接（数据未显示）。到第14天时，神经元网络内已形成多个突触，通过共免疫细胞化学方法检测突触前和突触后标记物可确认其存在（图1，右下图）。重要的是，该方法不仅能够可视化和定量突触标记物的点状结构，还能识别结构上完整的突触，这些突触最有可能参与神经网络的连接。
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讨论
本方案的主要目标是在保持神经元和星形胶质细胞共用培养基的同时，实现两者的完全分离。因此，应在实验开始时验证所获得培养物的纯度。我们推荐使用神经元特异性微管蛋白、神经丝蛋白或NeuN蛋白作为神经元标记物，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞标记物，O4抗原作为少突胶质前体细胞标记物，以及Iba1蛋白用于鉴定小胶质细胞。
在执行方案中由“注意”标注的关键步骤时需格外小心。需注意原代神经元和星形胶质细胞培养均较为敏感，因此在操作初期可能出现多种问题。若星形胶质细胞在接种后10天（DIV）未能在T75培养瓶中形成融合的单层细胞（方案第1部分），应检查星形胶质细胞培养基各组分的有效期。此外，可增加用于启动培养的皮层组织量（最多每瓶10个皮层）。若星形胶质细胞在接种至细胞培养小室后72小时仍未能形成融合的单层细胞 （方案第2节），检查星形胶质细胞培养基和多聚赖氨酸（PDL）的组分（查看有效期）。尽量接种 freshly prepared 培养物，接种前测定活细胞比例，并据此调整细胞数量（例如，使用台盼蓝复染）。若在24小时后观察到神经元存活率较低，则可能是海...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG：GRK 736，Fa 159/22-1）、波鸿鲁尔大学研究生院（GSC98/1）以及重点计划 SSP 1172“胶质细胞与突触”（Fa 159/11-1,2,3）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| B27 | Gibco（Life Technologies） | 17504-044 | |
| 细胞培养级水 | MilliQ | ||
| 胞嘧啶-β-D-阿糖呋喃糖苷（AraC） | Sigma-Aldrich | C1768 | 警告：H317，H361 |
| DMEM | Gibco（Life Technologies） | 41966-029 | |
| DNA酶 | 沃辛顿 | LS002007 | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1397 | 警告：H317-334 |
| 葡萄糖 | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco（Life Technologies） | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco（Life Technologies） | 15630-056 | |
| 马血清 | Biochrom AG | S9135 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco（Life Technologies） | 31095-029 | |
| 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A7641 | 警告：H334 |
| 木瓜蛋白酶 | 沃辛顿 | 3126 | |
| PBS | 自制 | ||
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco（Life Technologies） | 25300054 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 24孔板 | 赛默飞/努恩 | 142475 | |
| 24孔板（用于 间接共培养 | BD Falcon | 353504 | |
| 双眼前 | Leica | MZ6 | |
| 细胞培养小室 | BD Falcon | 353095 | |
| 离心 | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| 计数室 | Marienfeld | 650010 | |
| 镊子 | FST Dumont（#5） | 11254-20 | |
| 玻璃盖玻片（12 mm | 卡尔·罗思（Menzel- Gläser | P231.1 | |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Heracell 240i | |
| 微型离心管（2 mL） | Sarstedt | 72,691 | |
| 显微镜 | Leica | DMIL | |
| Millex 注射器驱动滤器单元 | Millipore | SLGV013SL | |
| 轨道摇床 | 新不伦瑞克科学公司 | Innova 4000 | |
| Parafilm | 贝米斯 | PM-996 | |
| 培养皿（10 cm） | Sarstedt | 833,902 | |
| 移液器（1 mL） | Gilson | Pipetman 1000 | |
| 无菌操作台 | The Baker Company | 层流无菌洁净台 SterilGARD III | |
| 手术剪 | FST Dumont | 14094-11 | |
| 注射器 | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 培养瓶 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| 离心管（15 mL） | Sarstedt | 64,554,502 | |
| 水浴锅 | GFL | 水浴锅型号 1004 |
参考文献
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