本方案描述了用于区室化分析神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养方法。
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本文内容
摘要
摘要
正常的神经元发育与功能是发育中及成年大脑正常运作的前提。然而，迄今为止，对于高度受控的复杂神经网络的形成与维持机制尚未完全阐明。有关神经元在健康与疾病状态下的未解问题多种多样，范围从基本发育过程的理解到人类相关病理学的研究，例如 阿尔茨海默病和 精神分裂症。对神经元最详尽的分析可在体外（in vitro）进行。然而，神经元是难以培养的细胞，其长期存活需要星形胶质细胞的额外支持。这种细胞异质性与分别解析神经元和星形胶质细胞功能的研究目标相冲突。本文介绍一种细胞培养检测方法，可在物理分离的条件下，实现纯化的原代神经元与星形胶质细胞在相同的化学成分明确的培养基中长期共培养。在此体系中，细胞培养物可存活长达四周，该方法适用于多种关于神经元-胶质细胞相互作用的研究。
引言
在过去的几十年中，人们对神经胶质细胞功能的普遍认识不断演变 从对神经元功能仅起支持作用的观点转变为发挥主动调节作用1. 由于它们在健康和疾病状态下对脑内稳态具有显著影响2，星形胶质细胞尤其受到科学界的关注。近年来，大量研究聚焦于神经元-胶质细胞相互作用 体内 和 体外3然而，大多数培养系统无法分别分析这两种细胞类型及其各自的分泌组。
多种方法利用神经元与胶质细胞的直接共培养，以实现神经元网络的长期存活及符合生理特征的发育4-6本方案在保持两种细胞物理分离的同时，实现了相同的目标7与条件培养基方法相比8,9我们的系统可用于研究神经元与星形胶质细胞之间的双向通讯。在细胞于共用培养基中成熟的过程中，可监测分泌性信号分子的表达。这一优势尤为重要，因为星形胶质细胞会释放多种可溶性因子，如细胞因子、生长因子以及细胞外基质分子。10,11从而调控神经元的生长与功能7,12因此，已证明将血小板反应蛋白添加至视网膜神经节细胞 体外 诱导突触的形成13然而，还需要其他尚未明确的因素才能使突触具备功能13此外，为了理解神经元-胶质细胞相互作用的基础，必须鉴定星形胶质细胞释放的分子。
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方案
小鼠实验遵循德国法律及德国神经科学学会的动物饲养指南。波鸿鲁尔大学的动物护理与使用委员会已授予相应的许可。
1. 皮层星形胶质细胞的制备与培养
注意：在进行后续步骤前，至少需提前 7 天完成本方案的这些步骤，因为星形胶质细胞培养物应在神经元制备前发育成融合的单层。原代星形胶质细胞来源于出生后第 0–3 天（P0–3）小鼠幼崽的混合胶质细胞培养物。每瓶 T75 培养瓶使用三只小鼠（6 个皮层）。
- 在无菌条件下，通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10% v/v马血清和0.1% v/v庆大霉素配制星形胶质细胞培养基。培养基于4 °C保存，最多可保存2周。
- 用 10 µg/mL 的溶液包被 3 个 T75 培养瓶 聚-D-赖氨酸（PDL；溶于细胞培养级水）孵育至少 1 小时 在37 °C、6% v/v CO存在条件下2包被后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤烧瓶两次，以去除未结合的阳离子，并加入9 mL 星形胶质细胞培养基
- 对于脑组织的制备，加入10 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）至 1x 10 cm 培养皿，加入 1 mL 将HBSS加入1个15 mL离心管中（无论使用脑组织的数量）。操作过程中，将一把手术剪、两把精细镊子和一台双目显微镜置于方便取用的位置。
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结果
通过间接共培养系统对神经元培养物进行的分析具有多样性，可在培养物成熟的不同阶段进行。由于细胞可维持培养长达4周，因此能够对培养物开展长期研究。
左中侧面板中的示意图 图1 展示了共培养体系的设置。利用该系统可对两种细胞进行活细胞成像，如左上图（星形胶质细胞单层）和左下图（神经元网络）的相差显微图像所示。固定后可进行免疫细胞化学分析，如右上图和右下图所示。
在本模型中，神经元大约从第7天开始建立突触连接（数据未显示）。到第14天时，神经元网络内已形成多个突触，通过共免疫细胞化学方法检测突触前和突触后标记物可确认其存在（图1，右下图）。重要的是，该方法不仅能够可视化和定量突触标记物的点状结构，还能识别结构上完整的突触，这些突触最有可能参与神经网络的连接。
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讨论
本方案的主要目标是在保持神经元和星形胶质细胞共用培养基的同时，实现两者的完全分离。因此，应在实验开始时验证所获得培养物的纯度。我们推荐使用神经元特异性微管蛋白、神经丝蛋白或NeuN蛋白作为神经元标记物，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞标记物，O4抗原作为少突胶质前体细胞标记物，以及Iba1蛋白用于鉴定小胶质细胞。
在执行方案中由“注意”标注的关键步骤时需格外小心。需注意原代神经元和星形胶质细胞培养均较为敏感，因此在操作初期可能出现多种问题。若星形胶质细胞在接种后10天（DIV）未能在T75培养瓶中形成融合的单层细胞（方案第1部分），应检查星形胶质细胞培养基各组分的有效期。此外，可增加用于启动培养的皮层组织量（最多每瓶10个皮层）。若星形胶质细胞在接种至细胞培养小室后72小时仍未能形成融合的单层细胞 （方案第2节），检查星形胶质细胞培养基和多聚赖氨酸（PDL）的组分（查看有效期）。尽量接种 freshly prepared 培养物，接种前测定活细胞比例，并据此调整细胞数量（例如，使用台盼蓝复染）。若在24小时后观察到神经元存活率较低，则可能是海.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG：GRK 736，Fa 159/22-1）、波鸿鲁尔大学研究生院（GSC98/1）以及重点计划 SSP 1172“胶质细胞与突触”（Fa 159/11-1,2,3）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| B27 | Gibco（Life Technologies） | 17504-044 | |
| 细胞培养级水 | MilliQ | ||
| 胞嘧啶-β-D-阿糖呋喃糖苷（AraC） | Sigma-Aldrich | C1768 | 警告：H317，H361 |
| DMEM | Gibco（Life Technologies） | 41966-029 | |
| DNA酶 | 沃辛顿 | LS002007 | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1397 | 警告：H317-334 |
| 葡萄糖 | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco（Life Technologies） | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco（Life Technologies） | 15630-056 | |
| 马血清 | Biochrom AG | S9135 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco（Life Technologies） | 31095-029 | |
| 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A7641 | 警告：H334 |
| 木瓜蛋白酶 | 沃辛顿 | 3126 | |
| PBS | 自制 | ||
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco（Life Technologies） | 25300054 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 24孔板 | 赛默飞/努恩 | 142475 | |
| 24孔板（用于 间接共培养 | BD Falcon | 353504 | |
| 双眼前 | Leica | MZ6 | |
| 细胞培养小室 | BD Falcon | 353095 | |
| 离心 | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| 计数室 | Marienfeld | 650010 | |
| 镊子 | FST Dumont（#5） | 11254-20 | |
| 玻璃盖玻片（12 mm | 卡尔·罗思（Menzel- Gläser | P231.1 | |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Heracell 240i | |
| 微型离心管（2 mL） | Sarstedt | 72,691 | |
| 显微镜 | Leica | DMIL | |
| Millex 注射器驱动滤器单元 | Millipore | SLGV013SL | |
| 轨道摇床 | 新不伦瑞克科学公司 | Innova 4000 | |
| Parafilm | 贝米斯 | PM-996 | |
| 培养皿（10 cm） | Sarstedt | 833,902 | |
| 移液器（1 mL） | Gilson | Pipetman 1000 | |
| 无菌操作台 | The Baker Company | 层流无菌洁净台 SterilGARD III | |
| 手术剪 | FST Dumont | 14094-11 | |
| 注射器 | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 培养瓶 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| 离心管（15 mL） | Sarstedt | 64,554,502 | |
| 水浴锅 | GFL | 水浴锅型号 1004 |
参考文献
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for....
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