Method Article

一个优化的协议通过使用金纳米粒子的放射性标记效率 125我标记的叠氮辅基

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于一个125 I标记的叠氮化物的合成和dibenzocyclooctyne（DBCO） -基共轭，13纳米大小的金使用无铜点击反应的纳米粒子的放射性标记的详细过程进行说明。

Abstract

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在这里，我们展示了 125I 标记的叠氮化物辅基放射性合成的详细方案，以及其在使用无铜点击反应对 DBCO 基团功能化金纳米颗粒进行有效放射性标记中的应用。使用 [125I] NaI 和氯胺 T 作为氧化剂，在室温下 15 分钟对亚锡化前驱体 （2） 进行放射性碘化。对粗品进行 HPLC 纯化后，纯化的 125I 标记叠氮化物 （1） 具有高放射化学产率 （75 ± 10%，n = 8） 和优异的放射化学纯度 （>99%）。为了合成放射性标记的 13 nm 大小的金纳米颗粒，通过使用巯基化聚乙二醇聚合物制备了 DBCO 功能化的金纳米颗粒 （3）。1 和 3 之间的无铜点击反应得到 125个 I 标记的金纳米颗粒 （4），通过放射薄层色谱 （radio-TLC） 测定，放射化学产率超过 95%。这些结果清楚地表明，目前使用应变促进的无铜点击反应的放射性标记方法将有助于高效方便地对含有 DBCO 组的纳米材料进行放射性标记。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

叠氮化物和环辛炔之间的应变促进无铜点击反应已广泛应用于各种生物分子、纳米材料和活体受试者的高效生物正交标记1-7。由于该偶联反应具有出色的位点特异性和快速反应速率，它也被用于合成放射性标记的示踪剂。已经制备了一些 18个 F 标记的叠氮化物或 DBCO 假体基团，用于靶向肽和抗体的各种癌症的体外标记，以及用于肿瘤的体内预靶向成像8-13。除了这些例子之外，相同的共轭反应也被应用于纳米材料的金属放射性同位素标记，用于正电子发射断层扫描 （PET） 成像研究14-16。

几十年来，放射性碘一直通过 PET 成像 （124I）、单光子发射计算机断层扫描 （SPECT） 成像 （123I、125I） 和甲状腺癌治疗 （131I）17-21 用于生物医学研究和临床试验。因此，有效的放射性碘标记方法对于各种研究至关重要，包括分子成像研究、生物分子器官分布分析、生物标志物鉴定和药物开发。无铜点击反应策略可用于放射性碘标记。然而，这种应用还没有像 18个 F 标记的生物分子22-23 那样被广泛研究。在这里，我们将提供合成 125I 标记叠氮化物的分步方案，用于 DBCO 组衍生分子的放射性标记。本报告中的程序将包括亚锡化前驱体的放射性碘化、HPLC 纯化步骤和固相萃取。我们还展示了使用 125I 标记的叠氮化物对 DBCO 基团修饰的 13 nm 大小的金纳米颗粒进行有效的放射性标记。本报告中的详细方案将帮助合成化学家了解用于合成放射性标记产品的新放射性标记方法。

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Protocol

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注意:放射性碘的氧化形式是相当挥发性的，且必须有足够的铅屏蔽和铅的小瓶处理。所有放射化学步骤应在通风良好的木炭过滤通风橱中进行，实验程序需要通过放射性检测装置进行监控。

1.化学品和反向相萃取柱的制备125 I标记的叠氮合成

  1. 在溶液试剂的制备
    1. 溶解1毫克150微升叠氮化物前体（2）无水乙醇（ 图1）。
      注:叠氮化物前体的详细合成步骤（2）据报道，在以前的论文22。
    2. 在20μl1×磷酸盐缓冲盐水（pH = 7.4）的溶解1毫克的氯胺T。
    3. 溶解2毫克焦亚硫酸钠在20μlH 2 O
  2. Prepara墨盒化
    1. 用10ml无水乙醇，然后用10毫升水2 O洗tC18柱不干燥与空气筒的矩阵。

2. 125 I标记的叠氮化辅基的放射合成

  1. 前体的放射性碘化反应
    1. 添加叠氮化物前体溶液（1毫克150微升绝对乙醇）和乙酸（10微升）到1.5ml微量离心管中。
    2. 在0.1M的NaOH（50微升）添加的[125 I]碘化钠150活度到反应混合物中。
    3. 添加氯胺T溶液（1mg在20μl1×磷酸盐缓冲盐水），并关闭含有微量离心管反应混合物。
    4. 在室温下孵育该反应混合物15分钟，直到放射性碘化反应完成。
    5. 一个焦亚硫酸钠溶液（2毫克在20μlH 2 O）加入到该反应混合物以猝灭放射性碘化反应。
    6. 撤回0.2微升粗产物，然后用100微升的溶液稀释（H 2 O / CH 3 CN，1:1）进行HPLC分析。
      注:对于所有的HPLC实验中，使用含有H 2 O（溶剂A）0.1％甲酸和0.1％甲酸含酸乙腈（溶剂B）作为洗脱剂。
    7. 通过使用反相分析放射性HPLC（分析稀释粗产物C18反相柱;流速:1ml /分钟;洗脱剂梯度:0-2分钟，20％溶剂B，20-80％溶剂B为2-22分钟，为22-23分钟80-100％溶剂B，和100％溶剂B为23-28分钟;保留时间:16.4分钟）（ 图2）。
  2. 用制备HPLC纯化粗产物
    注意:提供围绕型HPLC份足够铅屏蔽诸如喷射器，柱，检测器，收集瓶，并在其中流出物被收集在容器。
    1. 第撤Ë整个反应混合物倒入HPLC小瓶。冲洗，用乙腈（0.5毫升）的反应管中，加入漂洗到相同的注射小瓶中。稀释用H 2 O（1毫升）中收集的溶液。
    2. 注入粗产物到制备放射性HPLC（C18反相柱;流速:10ml /分钟;洗脱剂梯度:20％溶剂B为0-2分钟，20-80％溶剂B为2-22分钟，为22-23分钟80-100％溶剂B，以及用于23-28分钟100％溶剂B）。
    3. 收集表示125 I标记的叠氮化物（1）的放射性峰（ 叔 R这些HPLC条件下是17.8-18.8分钟）中的玻璃试管（ 图2）。
    4. 测量使用根据制造商的协议的放射性剂量校准馏分的放射化学产率。
    5. 注入纯化产品上使用，用于确定产物的放射化学纯度的相同HPLC条件分析放射性HPLC。
  3. 固相萃取的产物
    1. 稀释含用40ml纯H 2 O所需的产物（1）的级分
    2. 添加稀释的溶液成预处理tC18柱。
    3. 用另外的15毫升水2 O洗盒
    4. 洗脱被困在盒用2毫升丙酮到由一铅屏蔽保护的10-ml玻璃管制瓶内的产品（1）。测量使用根据制造商的协议的放射性剂量校准洗脱产物的放射性。
      注:二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇也可用于从盒中的产品的溶出。放射性的约5-10％，通常粘附在盒中，而剩余的放射性标记的产物不能通过使用过量的有机溶剂完全洗脱。
    5. 蒸发用氮气或氩气的气流的丙酮。
    6. 化解重用DMSO（100-200微升）为下放射性标记步骤sidue。

3. DBCO群结合的金纳米粒子的合成

  1. 13纳米大小的金表面改性与DBCO含基的聚乙二醇纳米粒
    1. 制备钠-柠檬酸盐稳定的金纳米粒子（3）（平均粒度= 13纳米）根据先前的报告24。
    2. 添加吐温20（1毫米，1.5毫升）的水溶液的柠檬酸盐稳定的金纳米粒子（10纳米，15毫升）。摇上轨道摇床进行20分钟的溶液中。
    3. 添加DBCO含有基团的聚乙二醇硫醇（平均分子量= 5,000，100μM，1.5毫升）的水溶液。摇上轨道摇床2小时的溶液中。
  2. 所述DBCO团改性金纳米颗粒的纯化
    1. 净化DBCO团改性的金纳米粒子（4）</ STRONG>是通过连续离心（11400 XG，15分钟×3）。
    2. 倒出上清液并加入纯水金纳米颗粒粒料再悬浮。

4.通过无铜点击反应DBCO团改性金纳米粒子的放射性标记

  1. 使用125 I标记的叠氮化物125 I标记的金纳米颗粒的合成（1）
    1. 通过使用离心分离（11400 xg离心，15分钟）制备DBCO团改性金纳米颗粒的浓溶液，并调整金纳米颗粒的浓度为2μM。
    2. 添加在DMSO（5微升）的125 I标记的叠氮化物（1）的4.1活度的悬浮液金纳米粒子（4）（2μM，50微升）。
    3. 孵育在40℃下将所得反应混合物60分钟。
    4. 从粗产物撤回等分试样（0.2微升），并将其应用到二氧化硅 - 共ated薄层色谱（TLC）板。
    5. 开发使用乙酸乙酯作为流动相的TLC板上。
    6. 放置在无线电型TLC扫描器TLC板上并运行扫描器监视根据制造商的方案的放射性标记反应（ 图3）。
  2. 粗产物的纯化
    1. 净化含有125 I标记的金纳米颗粒（4）通过离心（11400 xg离心，15分钟），将反应混合物。
    2. 倒出上清液并加入纯水金纳米颗粒粒料再悬浮。
    3. 从纯化的产物撤回等分试样（0.2微升），并将其应用到一个二氧化硅包覆TLC板上。
    4. 开发使用乙酸乙酯作为流动相的TLC板上。
    5. 放置在无线电型TLC扫描器TLC板上并运行扫描器，以确定125 I标记勒的放射化学产率和放射化学纯度ð纳米颗粒（4）（ 图3）根据制造商的协议。

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Results

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所述stannylated前体（2）的放射性碘化反应进行了使用[125 I]碘化钠，乙酸，和氯胺T 150活度在室温下15分钟，以提供放射性标记的产物（1）。粗混合物的制备HPLC纯化后，用放射化学产率的75±10％（N = 8）中得到所需产物。分析性HPLC显示，125 I标记产物的放射化学纯度是99％以上（ 图2），和产品1所观察到的比放射性40.7活度/微摩尔。通过使用盒含有纯化产物的组分的固相萃取提供的1的丙酮溶液。使用氮气或氩气的气流中，该有机溶剂可以被蒸发，然后将残余物可以再次在DMSO或无水乙醇中溶解为下STE页。

对于聚乙二醇修饰的金纳米颗粒的125 I标记，通过在图1中...

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Discussion

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在一般情况下，纯化的125 I标记的叠氮化物（1）所观察到的放射化学产率为75±10％（N = 8）。放射性标记用放射性50-150活度完成，放射化学的结果是相当一致的。如果[125 I]碘化钠（T 1/2 = 59.4 D）将经历放射性衰变了一个多月的放射性碘化反应时，观察到1放化收益率将略有下降（53-65％）。因此，我们建议，因为它产生的[125 I]碘化钠尽快利用或递送到实验室，以便获得优化的放射化学产率。此外，新制备的氯胺T溶液也应在反应中使用，以获得所需的放射化学产率。

因为前体（2）是相当疏水的，150微升绝对乙醇应加以溶解1毫克的 2的放射性碘化反应。否则，整个反应混合物可能成为加入氧化剂的水溶液和[125 I]碘化钠后浑浊。前体的溶解度下降往往导致1的低放射化学产量。 DMSO也可用于对放...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了韩国国家研究基金会的资助，由大韩民国政府资助（资助号2012M2B2B1055245和2012M2A2A6011335）和韩国原子能研究所RI-Biomics中心。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
氯胺 T 三水合物 Sigma402869
[125I]NaI 水溶液。NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
焦亚硫酸钠 SigmaS9000
甲酸Sigma251364
Sep-Pak tC18 plus 滤芯WatersWAT036800
二甲基亚砜 SigmaD2650
丙酮Sigma650501
乙醇Sigma459844
氯化金 （III） 三水合物Sigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH （MW 5,000）NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC 硅胶 60 F254Merck
分析型 HPLCAgilent1290 Infinity型号
制备型 HPLCAgilent1260 Infinity型号
分析型 C18 反相色谱柱AgilentZorbax Eclipse XDB-C18
制备型 C18 反相色谱柱AgilentPrepHT XDB-C18
无线电 TLC 扫描仪BioscanAR-2000型号
放射性同位素剂量校准器Capintec， IncCRC -25R 剂量校准器型号

References

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