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一种利用125I标记的叠氮基连接基团高效标记金纳米颗粒的优化方案

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DOI：

10.3791/54759

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2016年10月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文详细描述了一种125I标记叠氮化合物的合成方法，以及利用无铜点击反应对偶联了二苯并环辛炔（DBCO）基团、粒径为13 nm的金纳米颗粒进行放射性标记的过程。

摘要

本文展示了一种125I标记的叠氮基连接基团的放射性合成详细方案，并介绍了其在利用无铜点击反应对DBCO基团功能化的金纳米颗粒进行高效放射性标记中的应用。对锡烷基前体(2)的放射性碘标记采用[125I]NaI和氯胺T作为氧化剂，在室温下反应15分钟完成。粗产物经HPLC纯化后，得到高放射化学产率（75 ± 10%，n = 8）和优异放射化学纯度（>99%）的纯化125I标记叠氮化合物(1)。为合成放射性标记的13 nm金纳米颗粒，采用硫醇化聚乙二醇聚合物制备DBCO功能化的金纳米颗粒(3)。化合物1与3之间的无铜点击反应生成了125I标记的金纳米颗粒(4)，其放射化学产率超过95%，经放射性薄层色谱法（radio-TLC）测定确认。结果明确表明，本研究中采用的基于环张力促进的无铜点击反应的放射性标记方法，可用于含DBCO基团的纳米材料的高效且便捷的放射性标记。

引言

叠氮化物与环辛炔之间的应变促进型无铜点击反应已广泛应用于多种生物分子、纳米材料及活体样本的高效生物正交标记1-7由于该偶联反应具有优异的位点特异性和快速的反应速率，它也被用于合成放射性标记示踪剂。一些 18F标记的叠氮或DBCO假体基团已被制备用于 体外 靶向多种癌症的肽类和抗体的标记，以及用于 体内 肿瘤预靶向成像8-13除了这些示例之外，相同的偶联反应还被应用于纳米材料的金属放射性同位素标记，以开展正电子发射断层扫描（PET）成像研究。14-16.

几十年来，放射性碘已通过正电子发射断层成像（PET）（124I）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像（123I、125I）以及甲状腺癌治疗（131I）广泛应用于生物医学研究和临床试验17-21。因此，建立一种高效的放射性碘标记方法对于多种研究至关重要，包括分子影像学研究、生物分子器官分布分析、生物标志物鉴定以及药物开发。无铜点击反应策略可用于放射性碘标记，但相较于18F标记的生物分子，该方法在放射性碘标记中的应用尚未得到充分研究22-23。本文将提供一种125I标记叠氮化合物的逐步合成方案，用于对DBCO基团衍生分子进行放射性标记。本报告中的操作步骤包括对锡烷前体的放射性碘化、高效液相色谱（HPLC）纯化以及固相萃取。我们还展示了利用125I标记的叠氮化合物高效标记经DBCO基团修饰的13 nm金纳米颗粒的方法。本报告详述的实验方案将有助于合成化学家理解一种新型放射性标记技术，用于放射性标记产物的合成。

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方案

注意：放射性碘的氧化形式具有较强的挥发性，必须使用适当的铅屏蔽和铅制小瓶进行操作。所有放射性化学步骤应在通风良好的活性炭过滤罩内进行，并且实验过程需要通过放射性检测设备进行监测。

1. 用于合成125I标记叠氮化物的化学品及反相柱的准备

  1. 溶液中试剂的配制
    1. 将1 mg叠氮前体(2)溶解于150 µl无水乙醇中（图1）。
      注意：叠氮前体(2)的详细合成步骤已在先前的文献中报道22。
    2. 将1 mg氯胺T溶解于20 µl 1×磷酸盐缓冲液（pH = 7.4）中。
    3. 将2 mg亚硫酸氢钠溶解于20 µl H2O中。
  2. 色谱柱的准备
    1. 用10 ml无水乙醇冲洗tC18色谱柱，随后用10 ml H2O冲洗。切勿用空气将色谱柱填料吹干。

2. 放射性合成125I标记的叠氮基连接基团

  1. 前体的放射性碘标记反应
    1. 将叠氮前体溶液（1 mg 溶于 150 µl 无水乙醇）和乙酸（10 µl）加入 1.5 ml 微量离心管中。
    2. 向反应混合物中加入 [125I]NaI（150 MBq，溶于 0.1 M NaOH，50 µl）。
    3. 加入氯胺T溶液（1 mg 溶于 20 µl 1×磷酸盐缓冲液），并盖紧含有反应混合物的微量离心管。
    4. 室温孵育反应混合物 15 分钟，直至放射性碘标记反应完成。
    5. 向反应混合物中加入亚硫酸氢钠溶液（2 mg 溶于 20 µl H2O），以终止放射性碘标记反应。
    6. 取 0.2 µl 粗产物，用 100 µl 溶液（H2O/CH3CN，1:1）稀释，用于 HPLC 分析。
      注：所有 HPLC 实验均使用含 0.1% 甲酸的 H2O（溶剂 A）和含 0.1% 甲酸的乙腈（溶剂 B）作为流动相。
    7. 采用反相分析型放射性 HPLC（C18 反相色谱柱；流速：1 ml/min；洗脱梯度：0–2 分钟为 20% 溶剂 B，2–22 分钟为 20–80% 溶剂 B，22–23 分钟为 80–100% 溶剂 B，23–28 分钟为 100% 溶剂 B；保留时间：16.4 分钟）分析稀释后的粗产物（图 2）。
  2. 采用制备型 HPLC 纯化粗产物
    注：在 HPLC 的进样器、色谱柱、检测器、收集管以及流出液收集容器等部件周围应提供足够的铅屏蔽。
    1. 将全部反应混合物转移至 HPLC 进样瓶中。用乙腈（0.5 ml）冲洗反应管，并将冲洗液加入同一进样瓶中。用 H2O（1 ml）稀释收集的溶液。
    2. 将粗产物注入制备型放射性 HPLC（C18 反相色谱柱；流速：10 ml/min；洗脱梯度：0–2 分钟为 20% 溶剂 B，2–22 分钟为 20–80% 溶剂 B，22–23 分钟为 80–100% 溶剂 B，23–28 分钟为 100% 溶剂 B）。
    3. 在玻璃试管中收集代表 125I 标记叠氮化合物 (1) 的放射性峰（在该 HPLC 条件下，tR 为 17.8–18.8 分钟）（图 2）。
    4. 按照制造商的操作规程，使用放射性活度剂量校准仪测定该馏分的放射化学产率。
    5. 将纯化后的产物在相同 HPLC 条件下注入分析型放射性 HPLC，以测定产物的放射化学纯度。
  3. 产物的固相萃取
    1. 用 40 ml 纯 H2O 稀释含有目标产物 (1) 的馏分。
    2. 将稀释后的溶液加入预处理过的 tC18 小柱中。
    3. 用额外的 15 ml H2O 洗涤小柱。
    4. 用 2 ml 丙酮将截留在小柱中的产物 (1) 洗脱至一个由铅屏蔽保护的 10 ml 玻璃小瓶中。按照制造商的操作规程，使用放射性活度剂量校准仪测定洗脱产物的放射性活度。
      注：也可使用二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇进行洗脱。通常约有 5–10% 的放射性会残留在小柱上，即使使用过量有机溶剂也无法完全洗脱剩余的放射性标记产物。
    5. 用氮气或氩气流吹干丙酮。
    6. 用 DMSO（100–200 µl）溶解残留物，用于下一步放射性标记反应。

3. DBCO基团偶联金纳米颗粒的合成

  1. 用含 DBCO 基团的聚乙二醇对 13 nm 金纳米颗粒进行表面修饰
    1. 根据先前报道的方法24制备柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒 (3)（平均粒径 = 13 nm）。
    2. 将吐温 20 水溶液（1 mM，1.5 ml）加入柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒（10 nM，15 ml）中。在旋转摇床上振荡 20 分钟。
    3. 加入含 DBCO 基团的聚乙二醇硫醇水溶液（平均分子量 = 5,000，100 μM，1.5 ml）。在旋转摇床上振荡 2 小时。
  2. DBCO 基团修饰金纳米颗粒的纯化
    1. 通过连续离心（11,400 × g，15 分钟 × 3 次）纯化 DBCO 基团修饰的金纳米颗粒 (4)。
    2. 倾去上清液，并加入纯水以重新悬浮金纳米颗粒沉淀。

4. 通过无铜点击反应对含有 DBCO 基团的金纳米颗粒进行放射性标记

  1. 使用125I标记的叠氮化物（1）合成125I标记的金纳米颗粒
    1. 通过离心（11,400 × g，15 分钟）制备含DBCO基团修饰的金纳米颗粒的浓缩溶液，并将金纳米颗粒浓度调整至 2 µM。
    2. 将溶于DMSO（5 µl）中的4.1 MBq 125I标记的叠氮化物（1）加入金纳米颗粒悬浮液（4）（2 μM，50 µl）中。
    3. 将所得反应混合物在 40 °C 下孵育 60 分钟。
    4. 从粗产物中取出一份等分试样（0.2 µl），点样于硅胶涂层的薄层色谱（TLC）板上。
    5. 以乙酸乙酯作为流动相展开TLC板。
    6. 将TLC板置于放射性TLC扫描仪上，按照仪器制造商的操作说明运行扫描，以监测放射性标记反应（图3）。
  2. 粗产物的纯化
    1. 通过离心（11,400 × g，15 分钟）纯化含有125I标记的金纳米颗粒（4）的反应混合物。
    2. 倾去上清液，加入纯水以重新悬浮金纳米颗粒沉淀。
    3. 从纯化后的产物中取出一份等分试样（0.2 µl），点样于硅胶涂层的TLC板上。
    4. 以乙酸乙酯作为流动相展开TLC板。
    5. 将TLC板置于放射性TLC扫描仪上，按照仪器制造商的操作说明运行扫描，测定125I标记的金纳米颗粒（4）的放射化学产率和放射化学纯度（图3）。

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结果

使用150 MBq的[125I]NaI、乙酸和氯胺T在室温下反应15分钟，对锡化前体(2)进行放射性碘标记，得到放射性标记产物(1)。经制备型HPLC对粗产物混合物进行纯化后，目标产物的放射化学产率为75 ± 10%（n = 8）。分析型HPLC结果显示，125I标记产物的放射化学纯度超过99%（图2），产物1的实测比放射性为40.7 MBq/µmol。使用固相萃取小柱对含有纯化产物的馏分进行处理，可得到产物1的丙酮溶液。通过通入氮气或氩气流除去有机溶剂后，残留物可重新溶解于DMSO或无水乙醇中，用于后续步骤。

对于 125聚乙二醇修饰的金纳米颗粒的碘标记，通过如下步骤制备叠氮化二苯并环辛炔（DBCO）基团修饰的金纳米颗...

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讨论

通常情况下，纯化的125I标记叠氮化合物(1)的放化产率为75 ± 10%（n = 8）。放射性标记反应使用的放射性活度为50–150 MBq，放化结果具有良好的一致性。如果在放射性碘标记反应中使用了放射性衰变超过一个月的[125I]NaI（t1/2 = 59.4 d），则化合物1的放化产率略有下降（53–65%）。因此，建议在[125I]NaI制备完成或送达实验室后尽快使用，以获得最佳的放化产率。此外，反应中也应使用新鲜配制的氯胺T溶液，以达到理想的放化产率。

由于前体(2)具有较强的疏水性，在放射性碘标记反应中，应加入150 µl无水乙醇以溶解1 mg的2。否则，在加入氧化剂和[125I]NaI的水溶液后，整个反应体系可能变得浑浊。前体溶解度降低通常会导致1的放射化学产率下降。在放射性...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了韩国国家研究基金会（由大韩民国政府资助）（资助编号：2012M2B2B1055245 和 2012M2A2A6011335）以及韩国原子能研究所 RI-Biomics 中心的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三水合氯胺TSigma402869
[125I]NaI 水溶液中的 NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
焦亚硫酸钠 SigmaS9000
甲酸Sigma251364
Sep-Pak tC18 plus 小柱WatersWAT036800
二甲基亚砜 SigmaD2650
丙酮Sigma650501
乙醇Sigma459844
三水合氯化金(III)Sigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH（分子量 5,000）NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC 硅胶 60 F254Merck
分析型高效液相色谱仪Agilent1290 Infinity型号
制备型高效液相色谱仪Agilent1260 Infinity型号
分析型C18反相色谱柱AgilentZorbax Eclipse XDB-C18
制备型C18反相色谱柱AgilentPrepHT XDB-C18
放射性薄层色谱扫描仪BioscanAR-2000型号
放射性核素活度计Capintec, IncCRC -25R 剂量校准仪型号

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标签

125 DBCO

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