基于纳米级PCR技术对动物样本中呼吸道病原体的高通量检测

摘要

采用综合征性犬和马呼吸道PCR检测面板，描述了基于纳米级PCR技术对DNA和RNA病原体进行高通量检测的方法。

摘要

纳升级实时PCR利用空间多重技术，可在单块板上并行运行多个检测，而不会出现将反应混合在一起时常见的缺点。我们基于这一原理设计并评估了一种检测面板，用于快速鉴定患有急性呼吸道疾病的犬和马体内常见致病因子的存在。本文描述了一种用于样本制备、扩增及目标病原体序列分析的纳米级诊断PCR工作流程，重点介绍与微升级反应不同的操作步骤。在本研究所提出的呼吸道检测面板中，18种检测各自设置三个重复，每块板最多可容纳48个样本。我们优化了一种通用的提取与预扩增工作流程，以实现高通量样本制备，适用于多种样本基质以及基于DNA和RNA的病原体。本文展示了针对一种RNA靶标（甲型流感病毒基质基因）和一种DNA靶标（马疱疹病毒1型）的代表性数据。能够快速且准确地检测一组全面的、基于临床综合征的病原体，是提升诊断检测效率与操作便利性，以及改善急性呼吸道疾病诊断与管理的重要工具。

引言

在人类和动物临床诊断中，对快速、全面检测多种病原体的需求日益增加，若仅针对单一疾病检测大量样本，单一致病生物体的分子诊断方法尚可适用，否则将变得繁琐不堪。在兽医学领域，由于需要覆盖来自多种物种的病原体，高通量诊断技术显得尤为重要。例如，在食源性疾病防控和新发病原体监测的“同一健康”（OneHealth）策略中，检测需求涉及多种细菌、病毒（基于DNA或RNA）、寄生虫和真菌。将多种检测项目组合在一起（即多重检测）以提高检测效率，其面临的挑战可能包括灵敏度下降，以及检测方法在优化和验证过程中所需承担的巨大工作量。

纳升级实时聚合酶链式反应（PCR）是一种可替代多重检测技术的方法，能够在同一样本上同时运行多个独立的反应¹。OpenArray 平台正是该原理的一种应用²，它将微阵列技术与实时 PCR 相结合。基于空间多重检测的概念，每个样本在独立的通孔中针对大量靶标进行检测。该平台最初采用基于氰化染料的双链 DNA 结合化学法²，目前也可用于基于探针的化学检测，使用暗淬灭探针³。该平台主要用于人类⁴和动物⁵的基因分型分析。Grigorenko et al.⁶ 近期采用两步法逆转录/预扩增（preamp）程序，将其改进用于检测血液中的 DNA 和 RNA 病原体。

本文介绍一种基于一步预扩增的检测方法，可同时检测呼吸道分泌物及多种其他样本类型中的两类病原体，且整个流程可在标准工作日内完成。完成一步预扩增后，将样本转移至384孔板中，该板型符合本纳米级PCR平台配套的自动化液体处理系统的要求。该系统可同时在最多4块板（共192个样本和对照）的表面进行主混合液与样本的分配。完成加样后，我们进一步描述如何通过宏电子表格对样本进行扩增和分析，该表格可汇总每个样本-靶标组合三次技术重复的平均值，并将结果整合在一页打印纸上。

已建立一种利用该平台对样本中提取的DNA和/或RNA进行分析的统一方法。采用96孔板格式对多种类型的样本进行提取、反转录和预扩增，最大限度地减少了潜在误差。检测的呼吸道样本包括鼻拭子、深咽拭子、经气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液以及肺组织。由于部分被检病原体也可能存在于外周血或粪便中，因此本流程也纳入了此类样本类型。这种简化的操作流程通过基于检测面板的病原体和毒素基因高通量检测，替代逐一单独检测，相比在多个孔板上分别进行实验，显著节省了时间和资源。本研究所展示的呼吸道检测面板包含18种检测项目，每种以三份重复穿孔打印，每块板最多可容纳48个样本。检测到的马类病原体包括马腺病毒1型和2型、马动脉炎病毒、马鼻炎病毒A型和B型、马疱疹病毒（EHV）1型和4型，以及Streptococcus equi。犬类病原体包括犬呼吸道冠状病毒（乙型冠状病毒）、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬偏肺病毒、Bordetella bronchiseptica和Mycoplasma cynos。此外，还包含通用流感A病毒检测和内参对照（MS2 RNA噬菌体）。

方案

本方案的开发未使用人类受试者或实验动物。对照品通过纯化经序列确认的扩增子获得。 体外 针对RNA靶标的转录。临床样本送至康奈尔动物健康诊断中心进行常规诊断检测。

1. 培养板设计

1. 使用引物设计软件，通过引物探针测试工具验证每个检测是否符合基于探针的实时荧光定量PCR标准扩增条件（选择定量探针设置并使用默认参数，退火温度为60 °C）。
   注意：本研究所用的代表性RNA靶标改编自Shu et al.⁷发表的针对甲型流感病毒通用基质基因的检测方法。引物和探针序列如下：正向引物：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC，反向引物：AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA，探针：Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY。本研究所用的代表性DNA检测方法改编自Elia et al.⁸发表的马疱疹病毒1型（EHV-1）检测方法。引物和探针序列如下：正向引物：GCTCTCAGGTTTTACGACATC，反向引物：CTTTACCCAGGCCCTTGAAA，探针：FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY。
2. 订购所需配置的纳米级PCR扩增板。
   注意：本研究采用18×3基因表达格式（表1）。需向制造商提供每个靶标的全部引物和探针序列（或已有的检测ID）。

2. 核酸提取

1. 采用任何所需方法提取总核酸（DNA 和 RNA）。
   注意：此处根据制造商说明书使用了自动化磁珠法提取试剂盒（详见材料表中的更多细节）。
2. 按以下步骤准备样品：
   1. 用 10% 漂白剂清洁每个样品容器的外表面，并彻底干燥。在处理不同样品之间，用 10% 漂白剂擦拭戴手套的手指指尖，以防止交叉污染。
   2. 将鼻拭子或深咽拭子放入任何无菌密封小瓶（例如红色盖子的血液采集管）中，并加入数滴生理盐水，以防止样品在处理前干燥。
      注意：棉质、塑料、木质手柄以及达克龙（Dacron）和其他合成材料制成的拭子均可使用，但应避免使用海藻酸钙拭子。
   3. 对于拭子和气管冲洗液，加入杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM），使液体总量至少为 1–2 ml。在管中剧烈涡旋混合拭子与 DMEM。然后使用移液器将约 1 ml 培养基转移至新管中。
   4. 使用组织破碎仪按照制造商说明书对组织（100–200 mg 置于 1 ml DMEM 中）进行机械裂解，随后以 825 × g 离心 3 分钟。将 500 µl 上清液转移至新管中。
   5. 对于粪便样品，将 400 mg 粪便与 800 µl pH 7.4 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）混合。涡旋悬浮液至少 1 分钟或更长时间，直至样品完全均质化或充分悬浮。均质化后，以 18,000 × g 离心 10 分钟，然后将 400 µl 上清液转移至新管中。
   6. 对于未凝固的全血样品，涡旋混匀后取 250 µl 分装。加入六滴裂解试剂，涡旋混匀。在 37 °C 下孵育 15 分钟。
3. 根据制造商说明书配制裂解缓冲液和洗涤缓冲液。在裂解缓冲液中加入 MS2 噬菌体或所选的内参对照，作为内部阳性提取对照⁹。
4. 向每根磁珠管中加入 235 µl 裂解缓冲液和 175 µl 样品（阴性对照使用 PBS）。继续按照制造商提供的操作流程进行。
   注意：此处纯化的总核酸最终洗脱于 90 µl 洗脱液中。

3. 逆转录/预扩增（preamp）

注意：预扩增反应中使用的所有试剂和样品必须始终置于冰上。预扩增完成后，所有试剂应置于室温下保存。

1. 汇集洗脱的 DNA 和/或 RNA、PCR 反应混合液、无核酸酶水作为阴性对照，以及用于阳性扩增对照的混合标准品。
   注意：一个扩增板最多可运行 48 个样本（包括对照）；每个提取板至少应包含一个阴性提取对照，用于从中取出样本进行检测。
2. 打印样本布局图，并由第二人核对布局图与实际样本排布是否一致。
3. 在 1.5 ml 离心管中，加入以下组分以配制预扩增主混合液。
   注意：此处使用的终体积为 14 µl。
   1. 加入来自各靶标的预混引物池，使每种引物的终浓度为 900 nM。
      注意：此处使用的引物池为 10x 浓度，每反应加入 1.4 µl。
   2. 加入随机引物，使其终浓度为 600 nM 或 0.1x。
   3. 加入 2x RT-qPCR 混合液至终体积的一半（此处为 7 µl）。
   4. 轻轻涡旋混匀主混合液各组分，然后短暂离心。
4. 在标准 96 孔板上仅使用左侧半板（第 1–6 列）进行预扩增反应。
5. 向每孔中加入 8.5 µl 预扩增主混合液和 5.5 µl DNA/RNA 样本。
6. 在将所有试剂（样本、阳性对照和阴性对照与预扩增混合液）混合后，使用透明粘性封膜彻底密封标准 96 孔板。用刀片去除多余的封膜，以防止扩增循环过程中出现封膜缝隙。使用 PCR 板离心机对密封后的板离心 20 秒。检查确认所有试剂均位于孔底并充分混合。
7. 在常规热循环仪上运行预扩增程序，条件如下：50 °C 反应 15 分钟；95 °C 变性 1 分钟；95 °C 15 秒、60 °C 2 分钟，共 20 个循环；99.9 °C 延伸 10 分钟；4 °C 保存。请在开始前预先设置好上述程序。
8. 打开常规热循环仪，选择预扩增循环程序并启动。仅当热循环仪底部（非盖子）温度达到 cDNA 合成所需温度（50 °C）时，才将 96 孔板放入仪器中（通过屏幕温度读数监测）。在此之前，应保持板处于低温状态，以最大限度降低产生假阳性结果的风险。
9. 预扩增程序完成后，确认板仍保持密封状态。
10. 立即进入步骤 4.1。若需将该板过夜保存，请按照步骤 4.2 至 4.5 进行稀释操作，但不要松散覆盖板，而是使用透明粘性封膜密封板，并将其放入自封袋中，于 4 °C 保存。

4. 预扩增板的稀释

1. 从冰箱中取出适当数量的扩增板（每次最多可运行4块）。不要打开包装。让扩增板在室温下至少放置15分钟使其升温。记录扩增板的序列号和批号。
   注意：未开封的扩增板可在室温下存放最多24小时，但最佳操作规范是在使用前不超过30分钟再从冰箱中取出。
2. 使用PCR板离心机将完成预扩增的板离心20秒。打开扩增仪和计算机，并启动相应的程序。
3. 清除PCR准备区域中所有不必要的物品。戴上双层手套和袖套。
4. 撕去预扩增板的密封膜，小心脱去并丢弃外层手套。通过向96孔预扩增板第1至第6列的每个孔中加入56 µl TE缓冲液，并用移液器反复吹打混合，将预扩增产物按1:5比例稀释。移液时仅使用移液器的第一档，从孔底吸取液体，而在较高位置排液，避免产生气泡。无论孔是否使用，均需向全部6列中添加TE缓冲液。
5. 使用透明粘性封膜或铝箔密封膜重新密封该板，并使用PCR板离心机离心20秒。将此板暂时放置一旁（松散覆盖），直至完成步骤6.1。丢弃剩余的手套和袖套。

5. 准备将样品转移至扩增板的384孔板

1. 准备好覆盖和密封扩增板所需的材料：板盖、封塞、浸没液注射器、压板器、乙醇喷瓶和无尘实验室擦拭纸。取下注射器帽，并用力将一个小的塑料吸头锁定到注射器上。将少量浸没液挤到纸巾上以排除积聚的空气（吸头中残留少量小气泡是可接受的）。在从真空密封的铝袋中取出注射器后的60分钟内使用浸没液。一旦打开注射器，切勿重新盖上帽以供后续使用。
2. 检查板加载液体处理仪的废液箱是否为空，并打开吸头盒。开启新吸头盒时，在吸头盒盖上注明吸头的失效日期，并确保吸头未过期。打开液体处理仪和计算机，启动液体处理仪软件，软件将执行自检程序。
3. 点击 "设置与加载". 点击 "浏览" 选择由 Sample Tracker 软件生成的 csv 文件。如果文件未显示，请前往 "仪器/编辑首选项" 然后点击 "改变" 由 "样本板 文件夹"选择保存 csv 文件的文件夹，然后单击 "设置与加载"，然后 "浏览" 并选择文件。
4. 接下来，单击 "浏览" 旁边 "平板架位置1" 并选择与该板具有相同序列号的由制造商提供的 TPF 文件。

6. 液体处理仪转移

注意：在完成上述所有步骤之前，请勿开始向384孔板加样。由于液体体积较小，蒸发问题需特别关注——切勿让含有液体的384孔板长时间敞口放置。

1. 完成上述所有步骤后，戴上新的、贴合良好的双层手套和袖套。然后，向384孔板中加入2.5 µl扩增主混合液。
2. 根据表2中的示意图，将2.5 µl稀释后的预扩增产物转移至384孔板中，并立即用铝箔封膜紧密封盖。丢弃外层手套和袖套。
3. 将384孔板在PCR板离心机中离心20秒。
4. 不要移除铝箔封膜，直接将384孔板放入液体处理仪中。
5. 打开装有封装扩增板的包装，小心地将其放入液体处理仪的第一个槽位，使序列号位于右侧——拿取外壳时应仅接触边缘，避免触碰板面。打开包装后，应在一小时内使用未封装的板。
   注意：外壳的作用是防止板被触碰，因为触碰可能干扰通孔内微量的引物和探针。
6. 待所有组件就位后，移除液体处理仪内384孔板上的铝箔封膜。点击“下一步”，并在每一步完成后勾选相应复选框。点击“确定”以启动运行。
7. 关闭液体处理仪的门，并立即开始填充过程。停留在液体处理仪旁，在板填充完成后立即进入下一步。
8. 在液体处理仪运行的同时，从外壳盖子的底部移除保护膜。
   注意：外壳盖子底部的粘合剂由红色胶带和一层保护膜覆盖。需先移除保护膜，才能接触到红色胶带。
   1. 在步骤6.15之前保持顶部薄膜原位。通过轻微拉扯释放红色胶带，使其脱离粘合剂，完成预处理。
9. 从液体处理仪中取出已加载（填充完成）的扩增板，轻轻将其放入压板机中，确保序列号位于右侧。
10. 将盖子置于板上，使缺口端朝右，粘合面朝下（朝向板面）。
11. 小心地向下压下压板机手柄，使其闭合；指示灯将闪烁20秒。在此期间请勿触碰压板机。当指示灯变为稳定绿色后，小心抬起手柄，并通过握住板的边缘小心取出已密封的板。
12. 用手垂直握住密封扩增板的外壳边缘，立即把注射器针头插入外壳末端的加样口，然后以轻柔、连续的动作缓慢注入浸没液，填满板与盖子之间的空间。当板完全浸没后，在角落处保留一个微小气泡。
13. 继续用手握住板的边缘保持垂直，通过将塞子插入加样口并顺时针旋转，密封加样口，施加足够压力直至手柄断裂脱落。牢固握住外壳边缘，防止因手柄断裂产生的力导致外壳掉落。若板掉落，则应丢弃。
14. 使用已充分喷洒乙醇的无尘布清洁外壳。为干燥外壳，用干净的布自上而下擦拭。操作时应轻柔处理外壳，确保不要对孔上方的玻璃施加压力。
15. 将密封好的板送至扩增仪。在屏幕下方的“主页”选项卡中，进入“运行”菜单，选择OpenArray。点击"仪器"选项卡，选择"仪器控制台"。选择扩增仪后，点击"打开门"按钮。
16. 将扩增板放入板适配器的第一个槽位，确认适配器正确对齐，A1位于左上角。放置板时，确保条形码朝上并面向仪器前方。点击"关闭门"按钮。注意适配器托盘的使用次数限制——最多使用10次。
17. 在屏幕底部的“主页”选项卡下的“运行”菜单中选择OpenArray。点击"获取板ID"。空白框将自动填充有关该板的信息。要开始运行，请点击"开始运行"。
18. 关闭液体处理仪软件并关闭设备电源。将吸头盖盖在吸头架上。从废液桶中清空废弃吸头并清洁废液桶。清洁并去污染所有物品，包括工作台面、移液器、废液桶和吸头盒。
19. 用透明压敏封膜重新密封预扩增板，并在-20 °C下保存。

7. 结果分析

1. 运行完成后，保存文件，然后点击屏幕底部带有运行名称的标签页上的 "X" 关闭文件。
2. 点击屏幕顶部的 "Open Door" 打开仪器门。取出扩增板，并检查是否有浸没液泄漏。然后点击屏幕顶部的 "Close Door" 关闭仪器门。
3. 点击 "Open" 并选择运行文件以打开。按下屏幕右上角的绿色 Analyze 按钮。点击屏幕左侧的 "Export"，然后点击 "Start Export" 导出结果（以 .txt 文件格式）。文件打开后将其最小化。然后点击 "Export QC Images."
4. 根据以下标准在图像分析程序中审查质控图像：
   1. 使用 PRE-READ_CHANNEL_4.tiff 和 POST-READ_CHANNEL_4.tiff 评估加样质量，检查是否存在暗斑或污迹。
      注：该通道检测的染料由制造商添加至引物和探针中，在反应加样时释放到溶液中。该通道的读数表明反应已正确加样，且含有染料的引物和探针已存在。
   2. 使用 S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp#_spotfind.tiff 检查加样后是否存在泄漏或板内扰动。若图像过暗，请增加亮度（按 Ctrl+Shift+C 打开控制面板），直至整个板清晰可见。检查图像是否均匀，无阴影、气泡或样本移位。
   3. 使用 STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff 和 STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff 评估盖子安装情况及盖下是否有异物（亮斑）。
5. 可选：打开包含“Results Macro”的电子表格文件（补充代码文件）。在导出的数据文件中，右键点击屏幕底部的标签页，选择 "Move or Copy"。在 "to book" 字段中选择 "Results Macro.xlsm"。点击 "Move to end"，并勾选 "Create copy" 复选框，然后点击确定。
   1. 如果在 "to book" 字段中未出现 Results Macro 选项，可直接复制导出数据文件工作表中的全部内容（点击左上角单元格以选中所有单元格，按 Ctrl+C），然后粘贴至新标签页中。
6. 删除旧的 "Export" 标签页，然后将新添加的标签页重命名为 "Export"。
7. 按下 "Alt-F8"（或点击“View”然后选择“Macros”），选择 "Macro" 并点击 "Run"。然后对 Macro2 重复此操作：按下 "Alt-F8"，选择 "Macro2"，并点击 "Run"。
8. 使用相关信息（日期和序列号）重命名 Results Macro 文件，将该信息置于表格上方，并以相同文件名保存至“Exported Results”文件夹中。最后，打印宏生成的结果表格。
9. 在扩增仪软件中，通过点击屏幕左侧的 Analysis/Amplification Plot，查看各样本和对照的扩增曲线，并与宏生成的表格进行比对。选择 Sample 标签页，逐一点击每个样本，确认表格中每个阳性结果均对应 2 或 3 条阳性扩增曲线。
10. 关闭扩增仪。

结果

代表性RNA检测（流感病毒基质基因）和DNA检测（EHV-1）的结果如图1和图2所示，样本包括阳性对照和提交用于常规诊断检测的临床样本。图1显示了整个典型扩增反应过程中产生的荧光信号，横轴为扩增循环数，纵轴为每循环的原始荧光值。所有相对循环阈值（Ct）值均由扩增仪软件自动计算生成。背景荧光被用作评估加样质量的独立指标，而非在计算Ct值前将其纳入荧光读数中进行校正。

每个靶标的分析检测限（LOD）是根据所有靶标对照组中95%检测水平下Ct值的总平均值加2个标准差计算得出。在代表性检测中，至少95%重复样本呈阳性的最高稀释度为50拷贝；50%重复样本可成功检测到5拷贝。两种检测方法在低于1拷贝时均未检测到信号。RNA和DNA检测的LOD分别计算为Ct值21.92和20.05。这些值被用作判断结果为阳性与可疑（可能不可重复）的阈值。

通过在三天内对混合阳性对照进行连续稀释，评估了各检测靶标的其他分析性能指标（图2）。代表性RNA和DNA检测的平均扩增效率分别为101.1%和106.6%；所有靶标的总体平均效率为101.3%。各项检测还表现出良好的线性关系（R²>0.98）。临床样本和对照品在重复孔之间的变异通常标准差在0.2以内。各靶标之间未观察到任何交叉反应性。

补充文件中的“最终结果”工作表展示了10个临床诊断样本和4个对照样本的代表性定量结果。这些临床样本是常规检测样本类型的子集，包括鼻/口咽拭子、肺组织和粪便样本。本组样本中有一个（马）粪便样本的MS2内参对照检测失败，表明样本中存在抑制物。通常可通过稀释洗脱后的样本和/或重新提取核酸来处理此问题。如本例所示，阴性扩增对照对所有检测靶标均应呈阴性，而阴性提取对照应仅检出内参对照。在该临床样本组中，检测到β冠状病毒、Bordetella bronchiseptica、犬瘟热病毒A型、犬副流感病毒、犬肺炎病毒以及甲型流感病毒的Ct值。

图1. 扩增曲线图。 RNA检测（A）和DNA检测（B）的荧光读数相对于扩增循环数作图。三角形表示Ct值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 标准曲线。 绘制了在三天不同时间测试的 RNA 和 DNA 检测的标准曲线，以展示使用阳性对照时扩增的线性关系和检测范围。循环阈值（Ct）值相对于 RNA（A）或 DNA（B）标准品拷贝数的以10为底的对数（log(10)）进行绘图。 请点击此处查看该图的放大版本。

表 1. 扩增板及靶标位置示意图。 本平台用于纳米级实时 PCR 检测的芯片板尺寸与显微镜载玻片相当，由 48 个亚阵列组成，每个亚阵列包含 64 个通孔，共 3,072 个通孔，用于独立反应。图中显示一个亚阵列，包含 18 个靶标，每个靶标设三个重复。每个样本由液体处理系统加入一个亚阵列中。芯片板表面涂有亲水性和疏水性化合物，通过表面张力将试剂保留在通孔内。不锈钢芯片“通过光刻图形化和湿法刻蚀工艺加工成矩形阵列，包含 3,072 个微加工通孔，每个通孔直径为 320 µm，容积为 33 nl”²。靶标缩写如下：BCOR，犬呼吸道冠状病毒（β冠状病毒）；BORD，Bordetella bronchiseptica；CAV，犬腺病毒；CPIV，犬副流感病毒；CPNV，犬肺病毒；DISTA/B，犬瘟热病毒 A 和 B 型；EADV1/2，马腺病毒 1/2 型；EAV，马动脉炎病毒；EHV1/4，马疱疹病毒 1/4 型；ERVA/B，马鼻炎病毒 A/B 型；IVM，流感 A 型基质基因；MCYNOS，Mycoplasma cynos；MS2，内参对照（MS2 RNA 噬菌体）；SEQU，Streptococcus equi。

表 2. 样品板转移图。 图示为使用固定间距8通道移液器将样品从96孔预扩增板转移至384孔板的彩色编码转移图。也可使用可调间距移液器完成操作。无论样品板中样品数量多少，每次均执行相同的操作流程。

补充文件。 提供了一个启用宏的电子表格文件，其中包含两个宏，用于将结果格式化为摘要表格（如实验方案中所述）。该文件中包含了由宏生成的典型结果表格（位于“最终结果”工作表下）。这两个宏会自动填写第一列中的样本名称（最多支持48个样本），并对每个目标基因的三次Ct值取平均值（仅针对阳性结果）；请注意，在本表中未扩增的目标基因将显示为空白。该表格可轻松打印在一张纸上，作为高效核对原始数据的参考。在“最终结果”标签页中，展示了10个临床样本和4个对照样本的代表性结果。检测名称的缩写见表1图注。 请点击此处下载该文件。

讨论

该方法已在本实验室用于呼吸道病原体的常规检测，持续六个月（每周2-3次）。我们还成功应用相同流程，通过另行定制的微孔板对粪便样本和细菌分离株进行肠道病原体谱分析。一旦制备好微孔板，经验丰富的工作人员可在标准工作日内完成步骤2至7。最关键的步骤包括预扩增板的正确密封、预扩增样本在板间的转移（必须快速完成以防止蒸发）以及扩增板的最终封膜。使用宏电子表格作为结果分析的指导（检查样本和对照的扩增曲线）也至关重要，因为它显著减少了该过程所需的时间和文书工作量。所提供的宏电子表格仅为示例，若用于不同配置的微孔板，则需对其进行修改或重新创建。具备基础电子表格知识的人员即可轻松完成此项工作。

由于加载到扩增板上的样本量非常少（33 nl），因此需要进行预扩增。在本方案的优化过程中（未显示），我们比较了多种预扩增参数，包括主混合液、随机引物的添加、循环次数、退火时间以及扩增前的稀释倍数。每个靶标都有其最佳条件，此处描述的条件是针对本检测 panel 整体检测限最优的结果。该 panel 涵盖了常规兽医诊断检测中常见的多种病原靶标和样本类型，但对于不同的 panel，可能需要对预扩增程序进行相应调整。制造商优化的扩增条件基于标准的探针法实时 PCR 协议，包括在 95 °C 下酶活化 10 分钟，随后在 95 °C 下变性，在 60 °C 下退火/延伸。引物和探针已根据制造商优化的条件预先点样在板上，因此无需进行滴定。为了保持工作流程的高效性，必须将所有样本（无论靶标类型如何）的逆转录和预扩增步骤合并进行。对所有样本均进行逆转录也有利于最大限度地提高检测灵敏度。此外，使用专为最小化抑制物影响而优化的预扩增主混合液，可实现将不同类型样本在同一块板上混合处理的灵活性。

Shu 等⁷ 描述的美国疾病控制与预防中心（CDC）流感基质蛋白（matrix）检测方法在此被改进用于纳升级反应，是一种适用于检测人类及伴侣动物样本的通用甲型流感病毒检测方法。该方法最初设计用于在微升级反应体系中通用检测所有甲型流感病毒的基质基因。该检测方法已在全球范围内作为 CDC 人甲型流感病毒检测组合和 CDC 猪流感检测组合的一部分被广泛应用。本文所改进的马疱疹病毒-1（EHV-1）检测方法⁸ 可检测马的重要呼吸道病原体，该病毒可导致流产和神经系统疾病（Pusterla 和 Hussey¹⁰ 已综述）。将这些检测方法改进为高通量平台并引入一种与物种无关的内参对照，其重要意义在于可将其整合到“同一健康”（OneHealth）监测策略中。将这两种检测方法同时应用于高通量检测平台，将有助于临床机构、动物收容所和赛事活动的应急准备工作。

上述结果代表了板上所有靶标的典型表现，Mycoplasma cynos 除外，该靶标在分析性能上表现出明显更大的变异性。这可能是由于引物的熔解温度（T_m）次优，理想情况下应为 58–60 °C（探针的理想 Tm 为 68–70 °C）。该平台的一个局限性在于，相较于单独订购探针，设计和制造此类板所需时间更长，从而限制了快速修改序列的能力。实时 PCR 普遍存在的另一个局限性是无法检测新出现或意料之外的病原体。在一定程度上，可通过设计匹配多个物种序列的检测方法来克服这一问题，但基于无偏全基因组测序的方法更适用于新病原体的发现。^11,12

纳米级实时PCR技术实现了一种基于综合征而非基于物种的检测新范式，有助于降低高通量分子诊断中的试剂和人力成本。通过该方法进行的大规模检测面板有助于实现“同一健康”（OneHealth）监测工作，例如Dunne和Gurfield¹³以及Moutailler et al.¹⁴所描述的工作。在临床症状出现后尽早采集拭子样本，通常在发病3天内，可最大程度提高检测到呼吸道病原体的可能性。传染病的暴发往往难以预测，而无需调整试剂即可在不同物种上实施的检测方法，非常适合用于疫情应对准备。该技术未来的应用可能包括病原分型、抗菌药物耐药性分析以及更多基于综合征的临床诊断检测面板。纳米级实时PCR最适用于对多种样本和病原体类型进行快速、高通量的筛查，同时可结合无偏倚或部分有偏倚的基于测序的方法，用于识别新型和新发的病原体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Zap-OGlobin II 裂解试剂	Beckman Coulter	7546138	用于制备血液样本的可选试剂。
提取试剂盒（MagMAX 总核酸分离试剂盒）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	可根据所需样本类型选用其他适用的提取试剂盒。该试剂盒包含 PBS、裂解缓冲液和洗涤缓冲液。
2x 一步法 RT-qPCR 混合液（qScript XLT 一步法 RT-qPCR ToughMix）	Quanta Biosciences	95134-500
基因特异性引物混合液	IDT	定制订购	可由用户自行设计，或随扩增板一同购买。
随机引物混合液	New England Biolabs	S1330S
标准 96 孔板	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	可使用任何适用于常规 PCR 仪的孔板。
扩增主混合液（OpenArray 主混合液）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
透明粘性封膜	Thermo-Fisher	430611
铝箔封膜	Excel Scientific	AF-100
384 孔板	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
扩增板（QuantStudio 12K Flex OpenArray 板）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	可根据标准 TaqMan 条件定制任何检测项目。
配件试剂盒	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	包含外壳盖、塞子和浸没液。
AccuFill 加样头	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
扩增仪（QuantStudio 12K Flex 实时 PCR 系统）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
液体处理系统（OpenArray AccuFill 系统）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	需与扩增仪一并购买。
引物设计软件（Primer Express）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	引物和探针的具体参数请参考制造商说明书。
图像分析程序（ImageJ）	NIH		可从 http://imagej.nih.gov/ij/ 获取。
电子表格程序（Excel）	Microsoft		可从 https://products.office.com/en-us/excel 获取。
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
组织破碎仪（TissueLyser II）	Qiagen	85300
常规热循环仪（Veriti）	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	任何带加热盖的常规热循环仪均可使用。
PCR 板离心机	VWR	89184-608	该设备仅有一个转速（2,500 rpm）；关闭盖子时转子启动，按下按钮时停止。
TE 缓冲液	Millipore	8890-100ML	10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐，1 mM 乙二胺四乙酸，pH 8.0