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方法文章

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

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⸱

DOI：

10.3791/54795

⸱

2016年11月10日

 ,  ,  , 
1Biological Engineering Department, Utah State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。

摘要

免疫测定法利用抗体的存在来检测蛋白质。由于其在科研和临床环境中的广泛应用，目前已有大量配套的免疫测定仪器和材料。例如，市面上可提供96孔和384孔的聚苯乙烯板，其标准设计可适配不同厂家的紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计。此外，还有多种多样的免疫球蛋白、检测标记物和封闭剂可供选择，用于定制化免疫测定实验的设计，如酶联免疫吸附测定（ELISA）。

尽管已有相关基础设施，标准ELISA试剂盒仍无法满足所有研究需求，因此需要开发个性化的免疫分析方法，而这可能成本高昂且耗时较长。例如，ELISA试剂盒的多重检测能力（即同时检测多种分析物）较低，因其通常依赖荧光或比色法进行检测。由于光谱峰较宽，比色法和基于荧光的分析方法在多重检测方面能力有限。相比之下，基于拉曼光谱的方法因具有较窄的发射峰，具备更强的多重检测能力。拉曼光谱的另一个优势在于，拉曼报告分子的光漂白程度显著低于荧光标记物1。尽管拉曼报告分子相较于荧光和比色标记物具有诸多优势，但用于构建拉曼免疫分析的实验方案仍十分有限。本文旨在提供一种制备功能化探针的实验方案，该探针可与聚苯乙烯板联用，通过紫外-可见光分析（UV-Vis）和拉曼光谱法直接检测分析物。该方案将使研究人员能够采用自主构建的方式，利用现有基础设施实现未来的多分析物检测。

引言

典型的夹心免疫测定法使用两种抗体间接检测抗原的存在。捕获抗体结合在固相表面，当遇到相应的抗原时，形成抗体-抗原复合物。随后加入检测抗体，其与抗原结合。洗涤后，抗体/抗原/抗体复合物得以保留，并通过标记的检测抗体进行检测，如图1A所示。常规检测通常采用荧光或比色检测器，由于光谱峰较宽，多重检测能力通常限于10种分析物2,3。相比之下，基于拉曼的系统具有更窄的发射峰，因而显著提高了多重检测能力，有文献报道可同时检测多达100种分析物2,3。

已有大量文献资料涵盖了与免疫测定相关的各个方面4-6，例如创建个性化ELISA试剂盒的逐步操作细节。然而，这些实验方案仅适用于荧光或比色检测，限制了定制免疫测定的多重检测能力。为满足这一需求，本文提供了一种详细的实验流程，用于构建此前已发表的紫外-可见/拉曼免疫测定方法7，该方法适用于直接免疫测定，如图1B所示。

本方案包括基于功能化金纳米颗粒探针的制备，如图2所示。拉曼/紫外-可见（UV-Vis）探针的制备首先将拉曼报告分子结合到金纳米颗粒（AuNPs）表面。随后，将与聚乙二醇（PEG）相连的抗体对AuNPs进行功能化修饰。为防止后续分析过程中发生非特异性结合，使用甲氧基聚乙二醇硫醇（mPEG-SH）封闭AuNPs上剩余的结合位点。制备好的AuNP探针通过与固定在聚苯乙烯板孔中的抗原结合进行检测，如图1B所示。洗涤平板后，采用紫外-可见光谱法检测AuNP探针，同时利用拉曼光谱法检测与其相连的拉曼报告分子。结合紫外-可见光谱和拉曼光谱数据可提供两种分析方法，从而增强该免疫分析技术的检测能力。

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方案

1. 缓冲液的配制

  1. 磷酸盐缓冲液（PBS）
    1. 将50 ml的10x PBS用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x PBS浓度的溶液。使用0.22 µm滤膜进行无菌过滤。
    2. 室温下储存溶液。
  2. 含吐温20的Tris缓冲盐水（TBST）的配制
    1. 将50 ml的10x Tris缓冲盐水（TBS）用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x浓度的溶液。加入250 μl的Tween-20，使其终浓度为0.05%（v/v）。使用0.22 μm滤膜进行无菌过滤。
    2. 室温下储存。
  3. 人血清白蛋白（HSA）封闭液的配制
    1. 称取0.45 g HSA加入15 ml经无菌过滤的1x PBS中，配制成3% w/v的HSA溶液。涡旋振荡至HSA完全溶解。
    2. 将HSA溶液在4 °C下储存。
      注：牛血清白蛋白（BSA）也可用作封闭液。
  4. 聚乙二醇化抗体（PEG-Ab）溶液的配制
    注：抗体溶液中必须不含载体蛋白或稳定蛋白（如BSA），因为这些蛋白会与n-羟基琥珀酰亚胺（NHS）结合位点竞争，干扰偶联反应。如果抗体溶于Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须进行缓冲液置换，以避免胺类或铵盐干扰NHS偶联反应。如果抗体为冻干粉形式，可按照生产商推荐的方法重悬于1–10 mg/ml的浓度。
    1. 对于溶于Tris或甘氨酸缓冲液中的抗体，使用脱盐柱将其缓冲液置换为100 mM碳酸氢钠溶液。使用该100 mM缓冲液将pH调至约8.5，以加快偶联反应速度。
    2. 用100 mM碳酸氢钠溶液溶解邻吡啶二硫化物-PEG-NHS（OPSS-PEG-NHS），配制成体积为1 ml、浓度为1 mg/ml或更高的溶液。
      注：OPSS-PEG-NHS应现配现用，并在约20分钟内使用完毕。在pH 8.5的水溶液中，OPSS-PEG-NHS上的NHS基团半衰期约为20分钟。
    3. 将OPSS-PEG-NHS以2:1（PEG: 抗体）的偶联比例加入抗体溶液中，用于测试样品。另取一支微量离心管，将OPSS-PEG-NHS以2:1的偶联比例加入抗原溶液中，用于对照组。
      注：2:1的比例假设偶联效率为50%。目标是每个抗体连接一条PEG链。在此步骤中，过度标记优于标记不足。使用以下公式计算所需的OPSS-PEG-NHS和抗体溶液的体积：
      显示溶液分离分析中体积与浓度比关系的公式。
      其中V表示体积，C表示浓度（单位为每毫升分子数或抗体数）。下标PEG和Ab分别代表OPSS-PEG-NHS和抗体。最终体积应约为250 μl。
    4. 将PEG-Ab溶液在4 °C下孵育8小时或过夜。将溶液分装成约25 μl的工作 aliquot，在-20 °C下保存，以减少冻融循环次数，并确保使用低吸附性离心管。

2. 准备紫外-可见/拉曼探针

  1. 制备裸金纳米颗粒（AuNP）溶液
    1. 制备2 ml浓度约为1 × 1011 个颗粒/ ml的AuNP溶液。
      1. 若需浓缩AuNP，将2,000 μl储备AuNP溶液加入低吸附离心管中，在5,000 × g条件下离心20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动AuNP沉淀。
      2. 将剩余的AuNP溶液合并至同一管中，并通过紫外-可见光谱（UV-Vis）测量估算其浓度，与已知浓度进行比对，因二者呈线性关系。
  2. 确定合适的拉曼报告分子标记比例
    1. 将拉曼报告分子溶于甲醇中，配制工作溶液。其浓度取决于所用报告分子。本实验中，配制3,3′-二乙基三碳菁碘化物（DTTC）工作溶液，浓度为200 μM。
    2. 假设每孔终体积为100 μl，向96孔板第一行各孔中加入适量拉曼报告分子工作溶液，使报告分子浓度范围为0.2 μM至10 μM。向每孔中加入足够量的HPLC级水，使液体体积达到80 μl。再向每孔加入20 μl AuNP溶液，使每孔终体积为100 μl。示例见表1。
    3. 使用酶标仪在400至700 nm范围内测量紫外-可见吸收光谱。合适浓度应为具有清晰吸收峰的最高浓度。逐步提高浓度重复步骤2.2.2，直至确定拉曼报告分子与AuNP的最高浓度比例。
      注：染料种类以及AuNP的形状、尺寸和生产商均会影响合适浓度。因此，必须根据所用组分评估并调整上述步骤。本方案使用带正电荷的染料，因此采用带负电荷的AuNP可增强其与报告分子的结合，本实验中使用柠檬酸盐包被的AuNP实现。详见讨论部分。
  3. 将拉曼报告分子和PEG化抗体（PEG-Ab）结合至AuNP
    1. 配制两份1.5 ml AuNP与拉曼报告分子的混合溶液，浓度为前一步确定的最优浓度，在室温下孵育30分钟，使报告分子充分结合至AuNP表面。
    2. 向其中一份AuNP-报告分子混合液中加入PEG化抗体（PEG-Ab），使抗体与颗粒的比例为200:1，该溶液用于检测样本。在另一离心管中，向另一份AuNP-报告分子混合液中加入PEG化抗原，同样按200:1的抗体/颗粒比例作为对照。室温孵育30分钟。
      注：抗体与颗粒的比例取决于所用AuNP和染料，需针对每种情况优化。目标是在避免颗粒聚集的前提下，使AuNP探针结合尽可能多的抗体。使用以下公式计算所需添加体积：
      免疫分析法中抗体-金纳米颗粒比例的计算公式；显示体积关系。
      其中V表示体积，C表示浓度，单位为每毫升颗粒数或抗体数。终体积应约为1.5 ml。
  4. 使用mPEG-SH封闭AuNP表面剩余位点
    1. 将甲氧基聚乙二醇硫醇（mPEG-SH）固体溶于水中，配制成200 μM的溶液。涡旋振荡至mPEG-SH完全溶解。
    2. 按40,000:1的比例向步骤2.3制备的AuNP-PEG-Ab溶液中加入mPEG-SH。室温孵育10分钟，确保金纳米颗粒表面剩余位点被充分封闭。使用以下公式确定所需添加体积：
      纳米颗粒表面修饰公式，用于计算PEG化参数的化学方程式。
      其中V表示体积，C表示浓度，单位为每毫升颗粒数或抗体数。终体积应约为1.5 ml。
  5. 回收功能化的拉曼探针
    1. 将颗粒在低吸附离心管中以5,000 × g离心20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心吸除上清液，避免扰动AuNP沉淀。
    2. 用1 ml预先配制的1× PBS溶液重悬颗粒。取少量溶液（3 μl）进行紫外-可见光谱测量，根据已知AuNP浓度的测量结果估算AuNP浓度。调整体积，使终浓度至少达到1 × 1011 个颗粒/ ml。
    3. 将溶液储存于4 °C，待用于免疫分析板的功能化修饰。溶液应在一周内使用完毕。
各组分需添加的体积（ml）
DTTC 最终浓度（mM）DTTC 工作液（200 mM）AuNP水
0.20.12079.9
0.60.32079.7
10.52079.5
21.02079
52.52077.5
73.52076.5
105.02075

表1. DTTC稀释示例。 DTTC的不同稀释度及其对应的DTTC储备液、金纳米颗粒溶液和水的体积。

3. 免疫测定板的制备

  1. 将目标抗原结合到免疫测定板上。
    1. 准备足量的稀释抗原（50 μg/ml用溶液填充聚苯乙烯微孔板孔，涡旋混匀后立即加入到板孔中。室温孵育1小时，使抗原与板孔结合。
  2. 洗去未结合的抗原。
    1. 将多余的抗原溶液倒入废液容器中，并将板子轻击在铺有纸巾的桌面上以去除残留液体。
    2. 向孔中加入 TBST 洗涤表面，然后以先前所述相同方式移除洗涤液。重复此步骤两次。
  3. 封闭板孔以阻断剩余的结合位点，防止非特异性结合。
    1. 添加 70 μl 加入 HSA 封闭液至板的每孔中，室温孵育 30 分钟。
    2. 移除并按照步骤 3.2 中规定的相同程序冲洗平板。盖好平板，干燥保存于 4 °C 直至可进一步使用。
  4. 功能化免疫测定板
    1. 添加 70 μl 将第2节制备的探针纳米颗粒加入96孔板的第一列，并使用1:2倍比稀释法稀释后续各列。让该板孵育至少1小时。免疫分析板制备示例见 图3.
    2. 用 TBST 按照步骤 3.2 中所述方法洗涤平板 5 次，注意妥善处理金纳米颗粒（AuNPs）。最后一次洗涤后，加入 70 μl 向每孔加入 1x PBS，并用封板膜密封。
      注意：对照样品应为无色透明。若发生非特异性结合，对照样品将呈现与检测样品相似的颜色。
  5. 通过紫外-可见光谱和拉曼光谱检测分析方法的灵敏度。
    1. 使用酶标仪型紫外-可见分光光度计，对每个孔测定400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。
    2. 使用倒置拉曼显微镜，将物镜聚焦于含有金纳米粒子（AuNP）探针的孔板表面，获取该孔的拉曼光谱。采集范围为1,800 cm⁻¹至200 cm⁻¹的光谱。-1 至 400 cm-1对所有孔重复此步骤。
    3. 使用合适的光谱软件，执行 11th 拉曼光谱的三阶多项式基线校正及三rd 紫外-可见光谱的多项式拟合。
    4. 使用适当的光谱软件对拉曼光谱和紫外-可见光谱进行归一化处理。将最大值设为1，并相应地缩放所有其他数值。为归一化拉曼光谱，选择一个独特的聚苯乙烯峰并将其设为1，然后相应地缩放所有其他数值。
    5. 使用适当的光谱软件对每条光谱进行峰面积积分。对于拉曼光谱，代表拉曼报告分子的峰应位于无聚苯乙烯峰的区域。进行峰积分时，需为待测峰设定积分边界，并记录所有样品（包括对照组）中该峰的面积。
    6. 将目标物的平均峰面积对 AuNP 浓度的对数作图，每个数据点用误差棒表示其对应的标准偏差。将这些校准点拟合至四参数逻辑斯蒂曲线。
    7. 通过计算空白样品中目标峰面积的平均值，确定空白值的均值。计算这些峰面积的标准差，此即为空白值的标准差。
    8. 针对上一步中分析的同一峰，求其最低浓度下峰面积的标准偏差。
    9. 根据代表性结果部分所述，计算空白限和检测下限。将这些值与四参数逻辑（4PL）校准曲线结合，以确定金纳米颗粒（AuNP）浓度的定量下限（LLOD）。

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结果

本研究中使用了60 nm的金颗粒进行紫外-可见光谱分析。收集了400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱，并利用开源光谱分析软件8确定每种AuNP浓度的峰面积。在进行峰面积积分之前，对收集到的光谱采用三点多项式拟合进行基线校正。利用峰面积生成对数校准曲线，如图4所示。需要注意的是，图4和图5均采用了对数校准曲线。使用非线性校准曲线可显著扩展检测方法的动态范围，现已成为需要低浓度检测能力的各种免疫分析方法中的公认实践9,10。

为定量评估该检测方法的灵敏度，按下述方法计算空白限（LOB）和最低检测限（LLOD）：

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讨论

在详细方案中，有几个关键点需要说明。其一是拉曼报告分子和金纳米颗粒的选择。尽管本方案的编写旨在适用于个性化调整，但以DTTC作为拉曼报告分子的示例进行了说明。DTTC是一种带正电荷的报告分子，可结合于带负电荷的表面，例如柠檬酸盐包被的AuNPs。若使用表面带正电荷的金纳米颗粒，该方案也可适用于带负电荷的报告分子。例如，聚乙烯亚胺（PEI）包被的AuNPs具有正电荷表面，可更有效地与带负电荷的报告分子结合。

维持蛋白质与纳米颗粒之间的平衡是本方案中的关键步骤。该平衡通过以优化的抗体与金纳米颗粒比例（200:1）添加聚乙二醇化抗体来实现。若聚乙二醇化抗体的添加比例显著高于此值，则可能发生离子诱导的颗粒聚集；反之，若比例过低，则会导致蛋白质聚集和不溶性现象。该比例需在每种具体情况下分别确定。

另一个关键的实验步骤是将OPSS-PEG-NHS与抗体进行偶联。该步骤之前需将OPSS-PEG-NHS悬浮于碳酸氢钠溶液中，使NHS基团与抗体结合。如前所述，该偶联反应会与不利的水解反应相竞争7。水解反应随着时间的推移更易...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了犹他州立大学研究催化剂奖的支持。作者感谢Annelise Dykes、Cameron Zabriskie和Donald Wooley的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 nm 金纳米颗粒Ted Pella, Inc.15708-6这些是柠檬酸盐包被的金纳米颗粒。有关拉曼探针与金纳米颗粒表面电荷之间的关系及其对金纳米颗粒和/或拉曼探针正确选择的重要性，请参见讨论部分。
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-500
甲醇Pharmco-Aaper339000000
Tris 缓冲盐水（10x），pH 7.5Scy TekTBD999
瓶顶过滤装置VWR97066-202
Tween 20（聚山梨酯 20）Scy TekTWN500用作洗涤步骤中的乳化剂。
磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液，pH 7.4Scy TekPBD999
蛋白 LoBind 管 2.0 mlEppendorf Tubes22431102LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
蛋白 LoBind 管 0.5 mlEppendorf Tubes22431064LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
Microplate Devices UniSealGE Healthcare7704-0001用于密封和储存功能化微孔板。
检测板，带低蒸发盖，96 孔平底Costar3370
高效液相色谱级水Sigma Aldrich270733-4L
3,3′-二乙基三碳菁碘化物（DTTC）Sigma Aldrich381306-250MG拉曼探针
mPEG-硫醇，分子量 5,000 - 1 克Laysan Bio, Inc.MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA，分子量 5,000 - 1 克Laysan Bio, Inc.OPSS-PEG-SVA-5000-1gOPSS-PEG-SVA 具有 NHS 末端。
小鼠 IgG 全分子对照Thermo Fisher Scientific31903抗原
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗Thermo Fisher Scientific31164抗体
人血清白蛋白封闭液Sigma AldrichA1887-1G可使用牛血清白蛋白替代。
迷你离心机Fisher Scientific12-006-900
紫外-可见分光光度计Thermo ScientificNanodrop 2000c
紫外-可见分光光度计BioTekSynergy 2
脱盐柱Thermo Scientific87766
自制 785 nm 倒置拉曼显微镜系统N/AN/A倒置拉曼显微镜最适合对微孔板表面进行精确聚焦。否则，由于 96 孔板的高度限制，将不得不使用非常低的放大倍数。本研究使用自制系统，因其成本低于从供应商购买成品。然而，任何市售的倒置拉曼显微镜系统均可使用。

参考文献

  1. Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582(2015).
  2. Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
  3. Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
  4. The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
  5. Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
  6. ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
  7. Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
  8. Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
  9. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
  10. Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
  11. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
  12. EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
  13. Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084(2013).
  14. Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582(2015).
  15. Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).
  16. Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).
  17. McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).

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