构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

摘要

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。

摘要

免疫测定法利用抗体的存在来检测蛋白质。由于其在科研和临床环境中的广泛应用，目前已有大量配套的免疫测定仪器和材料。例如，市面上可提供96孔和384孔的聚苯乙烯板，其标准设计可适配不同厂家的紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计。此外，还有多种多样的免疫球蛋白、检测标记物和封闭剂可供选择，用于定制化免疫测定实验的设计，如酶联免疫吸附测定（ELISA）。

尽管已有相关基础设施，标准ELISA试剂盒仍无法满足所有研究需求，因此需要开发个性化的免疫分析方法，而这可能成本高昂且耗时较长。例如，ELISA试剂盒的多重检测能力（即同时检测多种分析物）较低，因其通常依赖荧光或比色法进行检测。由于光谱峰较宽，比色法和基于荧光的分析方法在多重检测方面能力有限。相比之下，基于拉曼光谱的方法因具有较窄的发射峰，具备更强的多重检测能力。拉曼光谱的另一个优势在于，拉曼报告分子的光漂白程度显著低于荧光标记物¹。尽管拉曼报告分子相较于荧光和比色标记物具有诸多优势，但用于构建拉曼免疫分析的实验方案仍十分有限。本文旨在提供一种制备功能化探针的实验方案，该探针可与聚苯乙烯板联用，通过紫外-可见光分析（UV-Vis）和拉曼光谱法直接检测分析物。该方案将使研究人员能够采用自主构建的方式，利用现有基础设施实现未来的多分析物检测。

引言

典型的夹心免疫测定法使用两种抗体间接检测抗原的存在。捕获抗体结合在固相表面，当遇到相应的抗原时，形成抗体-抗原复合物。随后加入检测抗体，其与抗原结合。洗涤后，抗体/抗原/抗体复合物得以保留，并通过标记的检测抗体进行检测，如图1A所示。常规检测通常采用荧光或比色检测器，由于光谱峰较宽，多重检测能力通常限于10种分析物^2,3。相比之下，基于拉曼的系统具有更窄的发射峰，因而显著提高了多重检测能力，有文献报道可同时检测多达100种分析物^2,3。

已有大量文献资料涵盖了与免疫测定相关的各个方面^4-6，例如创建个性化ELISA试剂盒的逐步操作细节。然而，这些实验方案仅适用于荧光或比色检测，限制了定制免疫测定的多重检测能力。为满足这一需求，本文提供了一种详细的实验流程，用于构建此前已发表的紫外-可见/拉曼免疫测定方法⁷，该方法适用于直接免疫测定，如图1B所示。

本方案包括基于功能化金纳米颗粒探针的制备，如图2所示。拉曼/紫外-可见（UV-Vis）探针的制备首先将拉曼报告分子结合到金纳米颗粒（AuNPs）表面。随后，将与聚乙二醇（PEG）相连的抗体对AuNPs进行功能化修饰。为防止后续分析过程中发生非特异性....

方案

1. 缓冲液的配制

1. 磷酸盐缓冲液（PBS）
   1. 将50 ml的10x PBS用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x PBS浓度的溶液。使用0.22 µm滤膜进行无菌过滤。
   2. 室温下储存溶液。
2. 含吐温20的Tris缓冲盐水（TBST）的配制
   1. 将50 ml的10x Tris缓冲盐水（TBS）用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x浓度的溶液。加入250 μl的Tween-20，使其终浓度为0.05%（v/v）。使用0.22 μm滤膜进行无菌过滤。
   2. 室温下储存。
3. 人血清白蛋白（HSA）封闭液的配制
   1. 称取0.45 g HSA加入15 ml经无菌过滤的1x PBS中，配制成3% w/v的HSA溶液。涡旋振荡至HSA完全溶解。
   2. 将HSA溶液在4 °C下储存。
      注：牛血清白蛋白（BSA）也可用作封闭液。
4. 聚乙二醇化抗体（PEG-Ab）溶液的配制
   注：抗体溶液中必须不含载体蛋白或稳定蛋白（如BSA），因为这些蛋白会与n-羟基琥珀酰亚胺（NHS）结合位点竞争，干扰偶联反应。如果抗体溶于Tr....

结果

本研究中使用了60 nm的金颗粒进行紫外-可见光谱分析。收集了400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱，并利用开源光谱分析软件⁸确定每种AuNP浓度的峰面积。在进行峰面积积分之前，对收集到的光谱采用三点多项式拟合进行基线校正。利用峰面积生成对数校准曲线，如图4所示。需要注意的是，图4和图5均采用了对数校准曲线。使用非线性校准曲线可显著扩展检测方法的动态范围，现已成为需要低浓度检测能力的各种免疫分析方法中的公认实践^9,10。

为定量评估该检测方法的灵敏度，按下述方法计算空白限（LOB）和最低检测限（LLOD）：

讨论

在详细方案中，有几个关键点需要说明。其一是拉曼报告分子和金纳米颗粒的选择。尽管本方案的编写旨在适用于个性化调整，但以DTTC作为拉曼报告分子的示例进行了说明。DTTC是一种带正电荷的报告分子，可结合于带负电荷的表面，例如柠檬酸盐包被的AuNPs。若使用表面带正电荷的金纳米颗粒，该方案也可适用于带负电荷的报告分子。例如，聚乙烯亚胺（PEI）包被的AuNPs具有正电荷表面，可更有效地与带负电荷的报告分子结合。

维持蛋白质与纳米颗粒之间的平衡是本方案中的关键步骤。该平衡通过以优化的抗体与金纳米颗粒比例（200:1）添加聚乙二醇化抗体来实现。若聚乙二醇化抗体的添加比例显著高于此值，则可能发生离子诱导的颗粒聚集；反之，若比例过低，则会导致蛋白质聚集和不溶性现象。该比例需在每种具体情况下分别确定。

另一个关键的实验步骤是将OPSS-PEG-NHS与抗体进行偶联。该步骤之前需将OPSS-PEG-NHS悬浮于碳酸氢钠溶液中，使NHS基团与抗体结合。如前所述，该偶联反应会与不利的水解反应相竞争⁷。水解反应随着时间的推移更易.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 nm 金纳米颗粒	Ted Pella, Inc.	15708-6	这些是柠檬酸盐包被的金纳米颗粒。有关拉曼探针与金纳米颗粒表面电荷之间的关系及其对金纳米颗粒和/或拉曼探针正确选择的重要性，请参见讨论部分。
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233-500
甲醇	Pharmco-Aaper	339000000
Tris 缓冲盐水（10x），pH 7.5	Scy Tek	TBD999
瓶顶过滤装置	VWR	97066-202
Tween 20（聚山梨酯 20）	Scy Tek	TWN500	用作洗涤步骤中的乳化剂。
磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液，pH 7.4	Scy Tek	PBD999
蛋白 LoBind 管 2.0 ml	Eppendorf Tubes	22431102	LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
蛋白 LoBind 管 0.5 ml	Eppendorf Tubes	22431064	LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
Microplate Devices UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	用于密封和储存功能化微孔板。
检测板，带低蒸发盖，96 孔平底	Costar	3370
高效液相色谱级水	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-二乙基三碳菁碘化物（DTTC）	Sigma Aldrich	381306-250MG	拉曼探针
mPEG-硫醇，分子量 5,000 - 1 克	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA，分子量 5,000 - 1 克	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA 具有 NHS 末端。
小鼠 IgG 全分子对照	Thermo Fisher Scientific	31903	抗原
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗	Thermo Fisher Scientific	31164	抗体
人血清白蛋白封闭液	Sigma Aldrich	A1887-1G	可使用牛血清白蛋白替代。
迷你离心机	Fisher Scientific	12-006-900
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
紫外-可见分光光度计	BioTek	Synergy 2
脱盐柱	Thermo Scientific	87766
自制 785 nm 倒置拉曼显微镜系统	N/A	N/A	倒置拉曼显微镜最适合对微孔板表面进行精确聚焦。否则，由于 96 孔板的高度限制，将不得不使用非常低的放大倍数。本研究使用自制系统，因其成本低于从供应商购买成品。然而，任何市售的倒置拉曼显微镜系统均可使用。