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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
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Disclosures
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Materials
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Immunology and Infection

从HIV-1感染细胞的外来体基于SILAC蛋白质组学表征

Published: March 03, 2017
doi:
10.3791/54799
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, , , ,
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories,Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine,Warren Alpert Medical School, Brown University

Summary

在这里，我们描述了使用通过在细胞培养物（SILAC）氨基酸稳定同位素标记的技术来分析HIV-1感染的主机外来体蛋白质组的作用的定量蛋白质组学方法。该协议可以很容易地适应于不同的压力或感染的条件下的细胞。

Abstract

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introduction

许多人类疾病，包括病毒感染，通常与所发生和周围的影响的细胞独特的细胞过程有关。蛋白质，经常充当最终细胞效应，调解这些进程。蛋白质的分析往往可以提供宝贵的资料，受影响细胞的局部环境，并帮助我们理解疾病的发病机制的基本机制。在各种蛋白质分析技术，蛋白质组学拥有特别大的承诺。作为一个强大的，大规模的工具，蛋白质组学可以提供细胞过程的全身性的了解，特别是在功能和蛋白质相互作用的区域。判断特定蛋白质是通过标记技术，它允许研究者监测细胞成分，特别是蛋白质的表达的发展作出了简单，在调查的部位。虽然许多蛋白质组学分析都在细胞被执行蛋白质组的规模，对亚细胞区室蛋白质组学表征已被证明是特别信息1。这是在HIV-1感染的研究很好的例子。

外来体，通过广泛的细胞类型2，3，分泌30-100纳米膜囊泡间通讯以及分子运输的关键组成部分。他们先前发现的HIV-1出芽过程4,5发挥重要作用。通过蛋白质组学分析与解剖功能结合起来，我们发现，从HIV-1感染的细胞释放的外来体是由一个独特的和定量不同的蛋白质的签名和港口监管分子在邻国接受细胞，包括细胞凋亡与增殖6影响细胞特性的。该方法在此协议中描述，即SILAC从HIV-1感染细胞的外来体7基于蛋白质组学表征（在细胞培养物中的氨基酸稳定同位素标记）。类似的方法可以适用于通过调整试验应力的特定隔室或感兴趣的级分，使对所描述的程序进行必要的更改更好地理解发病期间其他亚细胞区室。

鉴于最近的定量蛋白质组学方法的发展，有许多从选择最有效的方法为一个特定的实验时选择。其中包括基于化学的iTRAQ（用于相对和绝对定量的等压标记）8和无标记MRM（多反应监测）9技术。这两种方法是强大的工具，并且是特定的设置很好的选择。对于一个典型的实验室主要与细胞系的工作，然而，这两种方法具有relativelÿ较高的成本，而且更费时相比SILAC基础的方法时。 SILAC是一个基于代谢标记技术并入的氨基酸从培养基进入细胞蛋白质的非放射性的同位素形式。通常情况下，SILAC实验开始与两种细胞群体，例如，感染和未感染的。每个不同标记在其特定的同位素环境满为止标注的实现。然后这些细胞的标记的外来体经受蛋白提取。一旦萃取，将标记的外来体的蛋白质是使用液相色谱串联质谱法10进行分析。最后，质谱结果和显著标记的蛋白质经受统计和生物信息学分析以及严格生物化学验证。我们以前的研究报告表明，SILAC /外来体程序更适合的细胞系比初级细胞，如细胞系通常是在一个活跃的增殖状态高效同位素标记，

Protocol

1.细胞培养和HIV-1感染注：在开始实验之前，建议通过MTT法12以检查细胞的通过台盼蓝染色11和生存能力它们的增殖。它也使用新制备SILAC介质的关键。各种细胞系都可以使用，只要它们是在一个主动增殖阶段，很容易受到HIV-1感染，或所选择的测试条件。在这个协议中，使用的H9细胞系作为例子。 种子2×10 6个 H9细胞到每个细胞培养瓶。生长一组在标有含有10％透析的胎牛血清（FBS），100毫克/升13 C 6 -L-赖氨酸和100毫克/升13 C- 6 15 N 4 L-精氨酸的RPMI 1640培养基中10毫升生长另一组在10毫升的未标记的RPMI 1640培养基中，用透析的FBS 10％，100毫克/升的L-赖氨酸和100mg / L的L-精氨酸。 生长的细胞与重氨基酸在该点在标记的培养基中的细胞的蛋白质实际上完全标记6倍增（> 99％）。 （取决于细胞类型每1-3天。对于H9细胞，改变每3天培养基）添加新鲜的培养基或定期更换介质。在标记结束时，增加培养物体积（ 例如约30毫升），以容纳更多的细胞的生长。 注：确定确切细胞在通过台盼蓝染色和细胞计数实验开始倍增时间。 感染标记细胞HIV-1 NL4-3使用标准的HIV-1感染的协议13 48小时用。孵育适当量的病毒与感染的周围0.3复数（MOI）将细胞。通过使用HIV-1 p24抗原ELISA试剂盒培养上清液的P24定量检查HIV-1感染。执行免疫荧光法14来确认细胞的成功感染。记p在不断增加中未标记的未标记的细胞无HIV-1感染。 在感染结束时（步骤2.1）收获两组上清液。 2.外来体隔离注：通过一系列的步骤，超速离心从培养上清液外体组分富集15。执行在4℃以下所有步骤，用超速离心机转子，可以达到至少100,000×g的速度。 收集培养物上清液在50ml锥形管中，避免了细胞。离心他们在300 xg离心10分钟以除去剩余的细胞。 收集在新50ml锥形管中的上清液并在2000 xg离心离心它们10分钟，以去除死细胞。转让所得上清液商业转子兼容管是能够承受超离心。 一定要平衡超速离心管。离心30分钟试管以10,000 xg离心以除去细胞碎片。 收集70分钟的超速离心管上清和离心机在100,000×g的。弃去上清液。 悬浮丰富的外来体颗粒在5毫升新鲜的PBS。在100,000×g的重新传送解决方案，以新鲜的超速离心管，离心70分钟。 丢弃上清液。来存储外来体长期，悬浮颗粒在50μlPBS中并存储在-80℃。或者，如下所示直接进行蛋白质提取。 3.蛋白提取和准备溶解在添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒100-200微升的RIPA裂解和提取缓冲液分离外来体粒料。缓冲区是由25毫摩尔Tris-盐酸盐，150mM氯化钠，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS（十二烷基硫酸钠）的，在pH 7.6。蛋白酶抑制剂鸡尾酒应含有多种蛋白酶抑制剂，如抑肽酶，苯丁抑制素，升eupeptin，胃蛋白酶抑制素A和EDTA（乙二胺四乙酸），能够抑制全方位的蛋白酶。 以13,000 xg离心（4℃）离心10分钟溶解的解决方案，以及清除上清液转移至新的1.5 ml微量离心管。 量化使用二辛可宁酸（BCA）或Bradford测定16的外来体的各样品的蛋白质浓度。 混合蛋白质从标记和未标记的样品等量（2微克），并在120毫安/运行在4-20％SDS-PAGE凝胶的等量混合物200伏30分钟。 随后脱色17用考马斯蓝染色凝胶。 用刀片从凝胶上切样品车道。然后切泳道成10-15等份。把每一块到一个新的1.5 ml离心管，总共10-15管。 沉浸在立方体25毫米NH 4 HCO 3在50％乙腈，旋涡，并丢弃上清液。重复两次。干立方体在真空浓缩器18，19。 再水合用10mM二硫苏糖醇（DTT），涡旋，并短暂离心立方体。孵育在56℃进行1小时。弃上清。 沉浸凝胶立方体55毫米碘乙酰胺，漩涡和旋转。在室温下孵育在黑暗中45分钟。弃上清。 浸入25毫米NH 4 HCO 3，旋涡，旋转立方体，弃上清。 沉浸在立方体25毫米NH 4 HCO 3在50％乙腈，涡旋和旋转。重复3.9和3.10。 干燥，在真空浓缩的立方体。添加25μl的测序级改良的胰蛋白酶在25mM的NH 4 HCO 3，孵育在4℃下进行30分钟，并弃去过量的溶液。浸入25毫米NH 4 HCO 3立方体没有胰蛋白酶，和孵育过夜在37℃。 旋转简要立方体下来，转移所产生的肽的额外克拉到新管中。在50％乙腈中添加30微升的5％的甲酸的立方体，涡旋30分钟，和自旋。结合上清液用提取物。干燥用真空浓缩所述肽萃取到小于5微升。 提交样品质谱核心设施用于LC-MS / MS分析。该MS分析数据，其可以从开放源码软件来产生，典型地包括用于标识的每个蛋白的登录号，标记/未标记的比率，并确定了独特肽的数量。 4.免疫印迹验证注：Western印迹，建议以验证质谱结果。 遵循标准Western印迹协议和保证蛋白的从各组等量装载。使用由MS来识别针对目标蛋白的抗体（ 例如膜联蛋白A5，乳酸脱氢酶B链）。免疫印迹检测，符合密度analysi一起S，可以重申，MS蛋白质鉴定和定量是正确的。 5.蛋白质组数据分析注：每个MS复制显著蛋白质候选人的数据质量评估，数据预处理，计算和确定单独完成。一旦上述分析完成后，从重复分析的数据进行比较和组合6，20，21。 评估MS数据的质量。 首先，LOG2改造SILAC-MS标记/定量蛋白质未标记的比例在电子表格程序。 在科学绘图和统计软件，组的比例为40-100比箱并绘制每仓比的数目，以产生一个直方图。直方图的正态分布表示MS数据6的优良品质。做到这一步对所有MS复制。 为了提高MS肽比率的信心和准确性，考虑取消有不到两个量化肽蛋白。 要确定显著上调和下调的蛋白质的考生，请使用以下步骤计算阈值的意义22。 在科学绘图和统计软件，生成一个非线性回归或曲线拟合到频率分布数据。此步骤产生可用于计算截止值的值。计算的截止值作为平均±1.96σ为95％置信限或2.56σ为99％置信限。 注：计算临界值的具体情况可以在艾默特等人发现。 22。 选择的候选蛋白质的比例，其要么是大于1.96（或2.56）的标准偏差的中位数（显著过表达）高于或低于1.96（或2.56）标准差低于中位数（显著下表达）。 比较上述标题显著候选人的重复来实现的一致性。确保它们符合以下条件，通过这最后的选择步骤：考生必须在所有重复被一致确定;和候选的重复必须在其调节的方向是一致的（优选地，至少2选自候选的3个重复的要么是上调或下调）。 最终确定由合并他们重复'数据符合上述标准的候选人的数据。 6.生物信息学检验和检定注：现有基因组和生物信息学的信息提供了丰富的信息，几乎所有的蛋白质。数据挖掘和生物信息学分析这些信息可以深入了解大量进入显著候选人的财产和功能的帮助。这PROCESS通常是必要的，以设计恰当下游湿实验室实验。 使用他们的GenBank登记号或的UniProt的ID，搜索针对当前外来体数据库的候选人（Exocarta 23 Evpedia 24），以验证该候选蛋白已在外来体先前已经找到。这一步增加了信心层的考生确实在外来体。 访问http://www.exocarta.org/，点击“查询”输入无论是基因或蛋白质名称/登录号。摘要页面将出现，并在外来体的证据将显示，提供，如果有任何。 搜索针对HIV-1和人类蛋白质相互作用数据库25的候选者。可替代地，搜索特定数据库能够提供关于所述候选蛋白质的相互作用和测试条件的信息。 在www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV访问数据库互动。在“蛋白质域名”条目，输入候选人的名称或登录号，然后点击搜索。搜索结果可以提供深入的HIV-1与蛋白质候选人之间的相互作用，并提出它的候选人可能是真正的HIV-1相关联。 进口GenBank登记号或考生进入GO分析软件（如FunRich，功能丰富的分析工具26）的UniProt ID和运行该软件。 下载在http://www.funrich.org/软件。安装完成后，打开软件，在富集分析，单击“添加数据集”，并上传的蛋白质/基因名单。接下来，选择图表类型的可视化分析GO。 注：GO的分析结果将在饼图的形式显示。此步骤有助于我们获得与生物过程（BP），蜂窝组件等领域的考生有关环球透视（CC）和分子功能（MF）。 访问DAVID在http://david.ncifcrf.gov/ 27，点击其网站上的“功能性注释工具”。进入候选列表中，选择基因“标识”，如“的UniProt ID”，选择“基因名单”和搜索。富集的GO术语，p值等参数可以通过点击在“Gene_Ontology”类别中的“注释摘要结果”页面中找到。 调查与其他蛋白质的候选潜在的相互作用，可以使用公开地可访问STRING数据库28阐明潜在的蛋白-蛋白相互作用和可能的生化途径。 注：GO分析和功能注释（6.3-6.4节），也可以使用最新的软件STRING执行。 在http://string-db.org/访问数据库。输入的蛋白质ID或子序列插入为S操作搜索框，然后选择分析正确的物种。点击“搜索”。结果会就直接（物理）和间接（功能）协会的信息。对于外来体的候选人的十大知名匹配结果将显示，并应考虑显著候选人的选择。 注：与考生相关的大量信息可以使用上面的步骤进行分析。最显著候选可以被选择用于进一步下游分子和生化分析。

Representative Results

图1A是概述SILAC标记程序21的流程图。为了净化外来体，样品必须通过离心纺丝下来。 图1B示出了通过串行超速离心21外来体纯化的步骤。一旦纯化，如在程序中概述的外来体受实验蛋白质组学分析。 图2A是用于从蛋白质组数据21确定显…

Discussion

在本文中描述的方法，我们证明了SILAC技术的应用来调查HIV-1感染的主机上的外来体蛋白质组的效果。最初，未感染和HIV-1感染的细胞中差异同位素标记。然后差异标记外泌体进行蛋白质提取前进行纯化。接着，液相色谱 – 串联质谱法被用来分析外来体的蛋白质组。最后，将得到的质谱数据以及潜在的候选蛋白质进​​行统计和生物信息学的前下游生化解剖分析。

整个协议的?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作是由ARRA补充，寿命/塔夫茨/布朗恒虚警，P30AI042853-13S1，NIH P20GM103421，P01AA019072，R01HD072693和K24HD080539为BR支持。这项工作也是由寿命试验研究基金（＃701- 5857），罗得岛基金会医学研究资助（＃20133969），和NIH COBRE URI / RIH试点研究基金（P20GM104317）到ML支持。我们感谢詹姆斯的美荷和Vy党与手稿图制作提供帮助。

Materials

H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1NL4-3   NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000g
50mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details
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Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).
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