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基于SILAC的HIV-1感染细胞外泌体蛋白质组学表征

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DOI：

10.3791/54799

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2017年3月3日

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

本文内容

摘要

本文介绍了一种定量蛋白质组学方法，该方法采用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记技术（SILAC），用于分析HIV-1感染对宿主外泌体蛋白质组的影响。该方案可轻松适用于处于不同应激或感染条件下的细胞。

摘要

蛋白质组学是对蛋白质进行的大规模分析。蛋白质组学技术（如液相色谱-串联质谱法，LC-MS/MS）可同时鉴定数千种蛋白质。这些强大的技术使我们能够系统地理解细胞在受到各种刺激（如感染、应激和特定实验条件）时发生的细胞变化。尽管近年来已有进展，分析外泌体蛋白质组仍然耗时，且通常涉及复杂的方法。此外，所产生的大规模数据集通常需要进行稳健且高效的分析，以便研究人员开展后续的下游研究。本文介绍了一种基于稳定同位素标记氨基酸（SILAC）的方法，用于表征HIV-1感染细胞后外泌体的蛋白质组。该方法基于简单的同位素标记，从不同标记的细胞中分离外泌体，并进行质谱分析，随后对蛋白质组学检测结果进行详细的数据挖掘和生物信息学分析。所得数据集和候选蛋白易于理解，通常可为下游分析提供丰富的信息。该方案同样适用于其他亚细胞结构和多种实验条件。

引言

许多人类疾病（包括病毒感染）通常与受累细胞内部及周围发生的独特细胞过程相关。蛋白质通常作为细胞的最终效应分子，介导这些过程。对蛋白质的分析往往能够提供有关病变细胞局部环境的宝贵信息，并有助于我们理解疾病发病机制的内在机理。在众多蛋白质分析技术中，蛋白质组学具有尤为广阔的应用前景。作为一种强大的高通量工具，蛋白质组学能够系统性地揭示细胞过程，特别是在蛋白质功能与相互作用领域。随着标记技术的发展，特定蛋白质的分析变得更加简便，这些技术使研究人员能够在目标部位监测细胞组分（尤其是蛋白质）的表达情况。尽管已有大量蛋白质组学研究在全细胞蛋白质组水平上开展，但针对亚细胞结构的蛋白质组学表征被证明具有特别重要的信息价值1。HIV-1感染的研究便是其中的典型例证。

外泌体是由多种细胞类型分泌的直径为30-100 nm的膜性小泡2,3，是细胞间通讯和分子转运的关键组分。先前研究发现，外泌体在HIV-1出芽过程中发挥重要作用4,5。通过整合蛋白质组学分析与功能解析，我们发现来自HIV-1感染细胞的外泌体具有独特且定量差异的蛋白质特征，并携带调控分子，可影响邻近受体细胞的细胞特性，包括细胞凋亡和增殖6。本实验方案详细描述了基于SILAC（细胞培养中氨基酸稳定同位素标记）7的HIV-1感染细胞来源外泌体的蛋白质组学表征方法。通过调整实验刺激条件以针对特定的亚细胞结构或组分，并对所述实验步骤进行必要修改，类似方法也可用于更深入地研究病原体致病过程中其他亚细胞区域的特性。

随着定量蛋白质组学方法的近期发展，在为特定实验选择最高效方法时有了多种选择。其中主要包括基于化学试剂的iTRAQ（同重标签相对与绝对定量）8 和无标记的MRM（多反应监测）9 技术。这两种方法均为强大的工具，在特定实验条件下是理想的选择。然而，对于主要使用细胞系的典型实验室而言，与基于SILAC的方法相比，这两种方法的成本相对较高，且耗时更长。SILAC是一种基于代谢标记的技术，通过培养基中的非放射性同位素标记氨基酸将其掺入细胞蛋白质中。通常，SILAC实验始于两组细胞群体，例如感染与未感染细胞。每组细胞在各自特定的同位素环境中进行差异标记，直至完成完全标记。随后，提取这些细胞的外泌体蛋白。蛋白提取完成后，利用液相色谱-串联质谱技术10对标记的外泌体蛋白进行分析。最后，对质谱结果及显著标记的蛋白质进行统计学与生物信息学分析，并辅以严格的生化验证。我们先前的研究报告表明，SILAC/外泌体流程相较于原代细胞更适用于细胞系，因为细胞系通常处于活跃增殖状态，有利于实现高效的同位素标记。

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方案

1. 细胞培养与HIV-1感染

注意：在开始实验之前，建议通过台盼蓝染色法11检测细胞活力，并通过MTT法12检测细胞增殖情况。使用新配制的SILAC培养基至关重要。可使用多种细胞系，只要它们处于活跃增殖阶段，并且易感HIV-1感染或适用于所选的实验条件即可。在本方案中，以H9细胞系为例进行说明。

  1. 将 2 × 106 个 H9 细胞接种至每个细胞培养瓶中。一组细胞培养于 10 ml 标记的 RPMI 1640 培养基中，该培养基含有 10% 透析胎牛血清（FBS）、100 mg/L 13C6 L-赖氨酸和 100 mg/L 13C615N4 L-精氨酸；另一组细胞培养于 10 ml 未标记的 RPMI 1640 培养基中，含 10% 透析 FBS、100 mg/L L-赖氨酸和 100 mg/L L-精氨酸。
  2. 将细胞培养至完成六次倍增，此时标记培养基中的细胞蛋白质已几乎完全被重同位素氨基酸标记（>99%）。定期添加或更换新鲜培养基（每 1–3 天一次，具体频率取决于细胞类型；H9 细胞每 3 天更换一次）。在标记结束时，增加培养体积（例如 约 30 ml），以支持更多细胞的生长。
    注意：实验开始时应通过台盼蓝染色和细胞计数确定细胞的确切倍增时间。
  3. 使用标准的 HIV-1 感染方案13 对标记的细胞进行 HIV-1NL4-3 感染，持续 48 小时。将细胞与适量的病毒共同孵育，感染复数（MOI）约为 0.3。使用 HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒定量检测培养上清液中的 p24 蛋白，以评估 HIV-1 感染情况。进行免疫荧光分析14 以确认细胞感染成功。未标记的细胞继续在未标记培养基中培养，且不进行 HIV-1 感染。
  4. 在感染结束时（步骤 2.1）收集两组细胞的上清液。

2. 外泌体分离

注意：通过一系列超速离心步骤，可从培养上清中富集外泌体组分15。所有以下步骤均须在 4 °C 下进行，并使用能够达到至少 100,000 × g 转速的超速离心机转子。

  1. 将培养物的上清液收集到50 ml锥形管中，避免混入细胞。以300 × g离心10分钟，以去除残留的细胞。
  2. 将上清液转移至新的50 ml锥形管中，以2,000 × g离心10分钟，以去除死细胞。将所得上清液转移至可耐受超速离心的商品化转子兼容管中。
  3. 务必平衡超速离心管。以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。
  4. 将上清液收集到超速离心管中，以100,000 × g离心70分钟。弃去上清液。
  5. 用5 ml新鲜PBS重悬富含外泌体的沉淀。将悬液转移至新的超速离心管中，再次以100,000 × g离心70分钟。
  6. 弃去上清液。如需长期保存外泌体，可用50 µl PBS重悬沉淀，并于-80 °C保存。或者，可直接进行如下所示的蛋白质提取。

3. 蛋白质提取与制备

  1. 将分离的外泌体沉淀物溶解于100–200 µl含蛋白酶抑制剂混合液的RIPA裂解与提取缓冲液中。该缓冲液组成为：25 mM Tris-盐酸、150 mM氯化钠、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠和0.1% SDS（十二烷基硫酸钠），pH值为7.6。蛋白酶抑制剂混合液应包含多种蛋白酶抑制剂，如抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽（bestatin）、亮肽素（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）和EDTA（乙二胺四乙酸），以抑制多种蛋白酶活性。
  2. 将溶解后的溶液在13,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，将澄清的上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中。
  3. 使用二喹啉甲酸（BCA）或Bradford法测定各外泌体样品的蛋白浓度16。
  4. 取标记与未标记样品中等量蛋白（2 µg）混合，将等量混合液在4–20% SDS-PAGE凝胶上以120 mA/200 V电泳30分钟。
  5. 用考马斯亮蓝染色凝胶，随后进行脱色17。
  6. 使用刀片从凝胶中切下样品泳道，再将凝胶条带切成10–15个等长片段，每一片段放入一个新的1.5 ml微量离心管中，共10–15个管。
  7. 将凝胶小块浸入含50%乙腈的25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，弃去上清液，重复两次。在真空浓缩仪中干燥凝胶小块18,19。
  8. 用10 mM二硫苏糖醇（DTT）重悬凝胶小块，涡旋混匀，短暂离心。在56 °C孵育1小时，弃去上清液。
  9. 将凝胶小块浸入55 mM碘乙酰胺溶液中，涡旋混匀，短暂离心。室温避光孵育45分钟，弃去上清液。
  10. 将凝胶小块浸入25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，离心，弃去上清液。
  11. 将凝胶小块浸入含50%乙腈的25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，离心。重复步骤3.9和3.10。
  12. 在真空浓缩仪中干燥凝胶小块。加入25 µl溶于25 mM NH4HCO3的测序级修饰胰蛋白酶，4 °C孵育30分钟，弃去多余溶液。将凝胶小块浸入不含胰蛋白酶的25 mM NH4HCO3溶液中，37 °C过夜孵育。
  13. 短暂离心凝胶小块，将所得肽段提取液转移至新管中。向凝胶小块中加入30 µl含5%甲酸的50%乙腈溶液，涡旋30分钟，离心。将上清液与提取液合并。用真空浓缩仪将肽段提取液浓缩至体积小于5 µl。
  14. 将样品送至质谱核心平台进行LC-MS/MS分析。质谱分析数据通常可通过开源软件生成，一般包括每种鉴定蛋白的登录号、标记/未标记比值以及鉴定出的独特肽段数量。

4. 蛋白质印迹验证

注意：建议使用蛋白质印迹法验证质谱结果。

  1. 遵循标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验流程，确保每组样品加载等量的蛋白质。使用针对目标蛋白的抗体（例如 膜联蛋白A5、乳酸脱氢酶B链）通过质谱鉴定。通过蛋白质印迹检测结合密度测定分析，可进一步验证质谱蛋白质鉴定与定量结果的准确性。

5. 蛋白质组学数据分析

注意：数据质量评估、数据预处理、计算以及显著性蛋白质候选物的确定需针对每个质谱重复样分别进行。上述分析完成后，再对各重复样的分析结果进行比较和整合6,20,21。

  1. 评估质谱数据的质量。
    1. 首先，在电子表格程序中对定量蛋白质的SILAC-MS标记/未标记比值进行log2转换。
    2. 在科学绘图和统计软件中，将比值划分为40–100个比值区间，并绘制每个区间内比值的数量以生成直方图。直方图呈正态分布表明质谱数据质量良好6。对所有质谱重复样本均执行此步骤。
  2. 为提高质谱肽段比值的置信度和准确性，可考虑剔除定量肽段少于两个的蛋白质。
  3. 为确定显著上调和下调的候选蛋白质，请按以下步骤计算显著性阈值22。
    1. 在科学绘图和统计软件中，对频率分布数据进行非线性回归或曲线拟合。该步骤可得到用于计算截断值的参数。根据中位数 ± 1.96 σ 计算95%置信区间的截断值，或根据 ± 2.56 σ 计算99%置信区间的截断值。
      注：有关截断值计算的具体细节，请参见Emmott et al.22。
    2. 选择比值高于中位数1.96（或2.56）倍标准差（显著高表达）或低于中位数1.96（或2.56）倍标准差（显著低表达）的候选蛋白质。
  4. 比较上述筛选出的显著候选蛋白在各重复样本中的结果，以确保一致性。候选蛋白需满足以下标准方可通过最终筛选：在所有重复样本中均被一致鉴定；且其在各重复样本中的调控方向一致（理想情况下，每个候选蛋白的至少3个重复样本中有2个呈现相同方向的上调或下调）。
  5. 对符合上述标准的候选蛋白，合并其各重复样本的数据，完成最终数据整理。

6. 生物信息学验证与表征

注意：现有的基因组学和生物信息学数据几乎为每种蛋白质都提供了大量信息。对这些信息进行数据挖掘和生物信息学分析，有助于深入理解重要候选蛋白的性质与功能。该过程通常对于设计合理的后续湿实验至关重要。

  1. 利用候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID，将其与现有的外泌体数据库（Exocarta23、Evpedia24）进行比对，以确认这些候选蛋白是否曾被发现在外泌体中存在。此步骤可进一步增强候选蛋白确实在外泌体中的可信度。
    1. 访问 http://www.exocarta.org/，点击“Query”，输入基因或蛋白名称/登录号。若存在相关信息，将显示摘要页面，并展示该蛋白在外泌体中的证据。
  2. 将候选蛋白与 HIV-1 和人类蛋白相互作用数据库25 进行比对。或者，也可检索能够提供候选蛋白与实验条件之间相互作用信息的特定数据库。
    1. 访问数据库网站 www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions。在“protein domain name”输入框中输入候选蛋白的名称或登录号，点击搜索。搜索结果可揭示 HIV-1 与候选蛋白之间的相互作用，并提示哪些候选蛋白可能真正与 HIV-1 相关。
  3. 将候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID 导入 GO 分析软件（如 FunRich，功能富集分析工具26），并运行该软件。
    1. 在 http://www.funrich.org/ 下载软件。安装后打开软件，在“enrichment analysis”下点击“Add Data Set”，上传蛋白/基因列表。随后选择图表类型以可视化 GO 分析结果。
      注意：GO 分析结果将以饼图形式呈现。此步骤有助于我们全面了解候选蛋白在生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）方面的相关性。
  4. 访问 DAVID 网站 http://david.ncifcrf.gov/27，点击其网站上的“Functional Annotation Tool”。输入候选蛋白列表，选择基因的“Identifier”（如“UniProt ID”），选择“Gene List”并进行搜索。在“Gene_Ontology”类别下点击“Annotation Summary Results”页面，即可查看富集的 GO 条目、p 值及其他参数。
  5. 为探究候选蛋白与其他蛋白之间的潜在相互作用，可使用公开可访问的 STRING 数据库28 来阐明潜在的蛋白-蛋白相互作用及可能的生化通路。
    注意：GO 分析和功能注释（第 6.3–6.4 节）也可通过最新版本的 STRING 软件完成。
    1. 访问数据库网站 http://string-db.org/。将蛋白 ID 或序列输入指定的搜索框，并选择正确的物种进行分析。点击“Search”。结果将提供直接（物理）和间接（功能）关联的信息。外泌体候选蛋白的前十个已知匹配结果将被显示，应将其纳入重要候选蛋白的筛选考虑范围。
      注意：通过上述步骤可分析与候选蛋白相关的大量信息。可从中选择最具显著性的候选蛋白，用于后续的分子和生化分析。

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结果

图1A 是概述SILAC标记流程的流程图21。为了纯化外泌体，样品必须通过离心机离心沉淀。图1B 展示了通过连续超速离心纯化外泌体的步骤21。纯化完成后，外泌体将按照所述实验流程进行蛋白质组学分析。

图2A 是从蛋白质组学数据中确定显著性候选蛋白的流程图21。所筛选出的候选蛋白将用于后续的蛋白质组学分析。图2B 为SILAC直方图示例，显示了典型蛋白质定量结果的代表性比值（该图已根据Li et al.6 修改），而表1 则为根据这些SILAC比值直方图确定显著性候选蛋白截断值的示...

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讨论

在本文所述的实验流程中，我们展示了如何应用SILAC技术研究HIV-1感染对宿主细胞外泌体蛋白质组的影响。首先，对未感染和HIV-1感染的细胞进行差异性同位素标记。随后，分离带有不同标记的细胞外泌体，并进行蛋白质提取。接下来，采用液相色谱-串联质谱法分析细胞外泌体的蛋白质组。最后，对获得的质谱数据及潜在候选蛋白进行统计学和生物信息学分析，再开展下游的生化深入研究。

在整个实验方案中，必须遵循若干关键步骤才能获得优化的结果。在实验的初始阶段，SILAC标记可能受到细胞类型和标记培养基的影响。应使用状态良好且增殖活跃的细胞，以实现高效的标记效果。关键的是，标记培养基应使用透析胎牛血清（FBS）而非普通FBS新鲜配制。透析FBS中的氨基酸和肽类已被去除，因此更不易干扰SILAC标记过程。然而需要注意的是，透析血清可能并不适用于某些细胞系，尤其是原代细胞。在采用SILAC策略之前，应先确认细胞在含透析FBS的培养基中能够正常生长。此外，使用双倍 "重" 同位素标记13C6 L-赖氨酸和 13C6

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究获得了Lifespan/Tufts/Brown艾滋病研究中心（CFAR）ARRA补充基金（P30AI042853-13S1）、NIH P20GM103421、P01AA019072、R01HD072693以及K24HD080539（授予BR）的资助。本研究还获得了Lifespan试点研究基金（#701-5857）、罗德岛基金会医学研究基金（#20133969）以及NIH COBRE URI/RIH试点研究基金（P20GM104317）（授予ML）的支持。我们感谢James Myall和Vy Dang在稿件撰写和图表准备过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
H9 细胞系ATCCHTB-176
台盼蓝Thermo Fisher15250061
MTT 检测试剂盒Thermo FisherV13154
透析胎牛血清（FBS）Thermo Fisher26400044
SILAC 蛋白定量试剂盒 – RPMI 1640Thermo Fisher89982DMEM 版本 (89983)
L-盐酸精氨酸，13C6，15N4，用于 SILACThermo Fisher88434
L-盐酸赖氨酸，13C6，用于 SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH 艾滋病试剂计划2480
Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 检测试剂盒PerkinElmerNEK050001KT
制冷型超高速离心机Eppendorf22628045
制冷型超速离心机Beckman Coulter363118应能达到 100,000 × g
50 mL 圆锥形离心管Thermo Fisher14-432-22
超速离心管Beckman Coulter326823
SW 32 Ti 转子Beckman Coulter369694
RIPA 裂解缓冲液Thermo Fisher89900
蛋白酶抑制剂混合物Thermo Fisher 78430
ThermoMixer Eppendorf5384000020
BCA 蛋白定量检测试剂盒 Thermo Fisher23250
分光光度计Biorad1702525
SDS-PAGE 凝胶电泳装置Thermo FisherEI0001
Novex 4-20% Tris-甘氨酸迷你凝胶NovexXV04200PK20
凝胶染色试剂Sigma AldrichG1041
测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111
SpeedVac 浓缩仪Thermo FisherSPD131DDA
抗人膜联蛋白 A5 抗体Abcamab14196
抗人乳酸脱氢酶 B 链抗体Abcamab53292
绘图与统计分析软件Systat SigmaPlot 或 GraphPad Prism
定量蛋白质组学软件套件马克斯·普朗克生物化学研究所Maxquant 
软件与数据库多个供应商详见正文

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SILAC HIV 1 LC MS MS SDS PAGE GO STRING

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