一种从鱿鱼 Doryteuthis pealeii 中提取色素的方法

摘要

本文介绍了一种从鱿鱼Doryteuthis pealeii色素细胞的纳米结构颗粒中提取色素的实验方案。

摘要

头足类动物能够快速且适应性地改变皮肤颜色，以实现感知、交流、防御和繁殖等功能。这些能力部分依赖于称为色素细胞的着色器官的面积扩张与收缩。尽管已知色素细胞内含有由色素颗粒构成的锚定网络，但其结构与功能特性尚未被充分阐明。本文介绍了一种从鱿鱼Doryteuthis pealeii的色素细胞中分离纳米结构颗粒的方法，并展示了如何使用酸性溶剂提取其中相关的色素。为此，首先通过表层解剖手动分离含有色素细胞的皮肤层，再利用超声处理、离心和洗涤循环去除色素颗粒。随后，通过酸性甲醇溶液提取纯化后颗粒内的色素，使纳米结构直径减小并失去可见颜色。该提取方法可实现从颗粒中获得58%的可溶性色素产率。利用此方法，可确定色素细胞中色素的组成，进而为理解头足类动物适应性变色机制提供依据。

引言

鱿鱼、墨鱼和章鱼等头足类动物能够动态改变其外观，以实现伪装和信号传递功能^1-6。这种能力部分依赖于一种称为色素细胞（chromatophores）的着色器官的选择性面积扩张^4,7-9。色素细胞是一种柔软的执行器，其内部含有被包裹在细胞弹性囊泡中的纳米结构色素颗粒网络，该囊泡通过放射状排列的肌纤维固定^1,3。当色素细胞被激活时，其表面积可扩张至原来的500%，使颗粒在整个器官内均匀分布^3,7,10,11。当多个色素细胞协同作用时，动物整体的体色随之改变。尽管已知色素颗粒在这一变色过程中发挥重要作用，但其化学组成仍不清楚。本文描述了一种分离和纯化色素细胞中色素的方法，该方法可为后续的成分分析研究提供支持。

色素颗粒的分离涉及多步提取、匀浆和纯化过程。^3,12 通过精细切除从头足类动物中获取含有色素细胞的组织。随后采用消化和匀浆处理，以解离周围组织并分离色素细胞。然后通过反复超声处理和离心，从剩余的色素细胞中分离并纯化出具有纳米结构的颗粒。纯化后，采用经改良的酸性甲醇溶液法提取颗粒中的色素，该方法借鉴自蝴蝶翅膀可见颜色的提取技术。¹³ 采用扫描电子显微镜（SEM）和分光光度法确认该方法可成功提取色素细胞中的色素。

本方法描述了用于研究头足类动物体色分子机制的色素细胞颗粒的分离过程。¹² 从完整动物体中提取小分子通常是一个耗时且繁琐的过程。本文旨在为后续研究人员提供一种高效且简便的实验方案，用于获取头足类动物中具有纳米结构的颗粒内的色素。

方案

本文开展的无脊椎动物研究在美国不受相关法规管辖；因此，机构动物护理与使用委员会无权对此类实验方案进行审查。鉴于这些研究不属于美国法规的管辖范围，作者在此声明，本研究在实施过程中真诚地遵循了动物的伦理使用、护理和处理原则，尽可能减少了实验个体数量，且相关努力符合《巴塞尔宣言》以及国际实验动物科学理事会（ICLAS）的伦理指南。

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) 解剖

1. 从马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室的海洋资源部门或任何新鲜鱼类市场购买去头的鱿鱼 D. pealeii。请勿使用已被切片或经过其他处理的标本，以确保本实验方法的适用性。具体而言，标本上的色素细胞层必须保持完整。
   1. 若动物标本未立即使用，应将其储存在 -20 °C 环境中直至使用。解冻时，将标本置于室温水中浸泡 1 小时后再进行解剖。
2. 使用不锈钢直头精细解剖剪，在动物体后侧进行剪切。起始位置为腹侧外套膜基部，终止于鳍部区域。
3. 用解剖镊夹起所有内部器官（包括胃、鳃、墨腺、生殖器官、体心脏和臂心脏），并用解剖剪切断其连接组织，将其移除。将移除的器官丢弃至标本袋中。
4. 使用解剖T型针将外套膜（鳍面朝上）固定在一个标准的 11-1/2" x 7-1/2" x 1-1/2" 铝制解剖盘中，盘内需配有柔性解剖垫。将组织浸入 250 ml 经一次性聚苯乙烯真空过滤系统（滤膜孔径 0.2 µm）过滤的海水。
5. 用解剖镊小心剥离表皮层（呈不透明颜色），同时保持含有色素细胞的皮肤层完整。一旦表皮层被去除，将其丢弃至标本袋中。
6. 用镊子和解剖剪从色素细胞层上分离出小块（1 cm × 1 cm）组织片段。将样本收集至 1.5 ml 微离心管中（每管填充约一半体积的解剖组织）。
7. 向含有组织的离心管中加入 500 µl 过滤海水。样本可在 4 °C 下保存过夜。

2. 分离色素细胞中的色素颗粒

1. 组织消化
   1. 木瓜蛋白酶/胶原酶的配制
      1. 使用 4" x 4" 低氮称量纸称取 30 mg 胶原酶和 5 mg 木瓜蛋白酶。将酶转移至一个带螺帽的 50 ml 聚丙烯离心管中。
      2. 使用刻度移液管量取 10 ml 去离子水，直接加入含有木瓜蛋白酶/胶原酶的管中。涡旋振荡至溶液澄清，使用最高转速。
   2. 去除细胞外组织
      1. 将步骤 1.7 中收集的色素细胞组织在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上层海水至塑料废液桶中。
      2. 使用 P1000 多通道可调体积微量移液器向组织中加入 500 µl 木瓜蛋白酶/胶原酶溶液。每份样品在最高转速下涡旋振荡 1–2 分钟。
      3. 将样品在 40 kHz 频率下超声处理 5 分钟，以使细胞从周围组织中解离。
      4. 在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。将上清液弃入塑料废液桶中。
      5. 将收集的色素细胞组织再次在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上层海水至塑料废液桶中。重复此步骤一次。
      6. 在进行下一步之前，使用镊子手动去除在此过程中未消化的任何残留大块组织。
2. 色素颗粒的分离
   1. 匀浆缓冲液的配制
      1. 称取 2.38 g (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸) (HEPES, 100 mM)、0.095 g 氯化镁 (10 mM)、0.856 g 谷氨酸钾 (50 mM) 和 0.015 g 二硫苏糖醇 (1 mM)，转移至一个带螺帽的 150 ml 聚苯乙烯容器中。加入一片商用蛋白酶抑制剂小片。
      2. 使用量筒量取 100 ml 去离子水，直接加入含有匀浆盐的容器中。涡旋振荡至溶液澄清。
   2. 色素颗粒的匀浆处理
      1. 将步骤 2.1 中获得的每份样品在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液至塑料废液桶中。此样品应不含细胞外组织。
      2. 向每根离心管中加入 500 µl 匀浆缓冲液，每管涡旋振荡 1–2 分钟以充分混匀样品。将样品超声处理 30 分钟（约 40 kHz），随后在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。
      3. 将上清液弃入塑料废液桶中，并重复上述步骤 2–3 次，以确保完全消化色素细胞囊和蛋白锚定结构。最终剩余溶液应包含淡黄色上清液和含有分离色素颗粒的红色沉淀。

3. 色素提取

1. 酸性甲醇（HCl-MeOH）的制备
   1. 小心地将 25 µl 浓盐酸（36.5–38% (w/w)）加入 5 ml 甲醇（MeOH）中。将 HCl-MeOH 溶液储存于带螺口盖的玻璃样品瓶中。轻轻旋转以充分混匀溶液。
      注意：溶液酸性越强，第一次提取时获得的色素越多。
2. 色素提取
   1. 将色素颗粒悬液（来自 2.2.2 步骤）在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟，并将上清液弃入塑料废液桶中。
   2. 向每个样品中加入 500 µl HCl-MeOH 溶液，涡旋混匀约 3–4 分钟。随后将样品超声处理 10 分钟（约 40 kHz），再在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。
   3. 使用移液管将上清液收集至 1 dram 螺口玻璃小瓶中。上清液应呈深红色。
   4. 重复步骤 3.2.2，直至无进一步颜色析出（约洗涤 4–5 次）。
      注意：每次提取可获得约 1.5 ml 色素。剩余的无色沉淀即为已提取色素的颗粒。注意：无色颗粒和提取的色素均可在 4 °C 水中保存，直至后续使用。

4. 提取过程中的表征

1. 扫描电子显微镜
   1. 使用扫描电子显微镜（SEM）对颗粒（来自步骤2.2.1的未反应颗粒和来自步骤3.2.3的色素提取后颗粒）进行成像，以验证提取过程的纯度。
   2. 为制备用于成像的颗粒样品，首先将未反应颗粒和色素提取后的颗粒在14,000 × g条件下离心5分钟，并将上清液弃入塑料废液桶中。用1 ml乙醇重悬颗粒，然后使用移液管将2–3滴颗粒悬液滴加到铝制SEM样品台上。
   3. 样品在室温下干燥过夜后，进行金-铂溅射镀膜，镀膜时间为3分钟，获得约15 nm厚度的导电层。
   4. 使用配备肖特基电子源和二次电子探测器的扫描电子显微镜对样品进行成像，电子束电压设置为5–7 kV，工作距离控制在8–9 mm之间。
2. 紫外-可见（UV-vis）分光光度法测量
   1. 使用双光束分光光度计在200–800 nm波长范围内，监测所有三种条件下的吸光度曲线（来自步骤2.2.2的未反应颗粒、来自步骤3.2.3的提取色素以及来自步骤3.2.4的色素提取后颗粒）。
   2. 对于未反应颗粒和色素提取后颗粒，使用去离子水在1 ml比色皿中采集空白对照，然后分别采集两种样品的紫外-可见吸收光谱。
   3. 对于提取的色素，使用酸性甲醇溶液在1 ml比色皿中采集空白对照，并采集样品的紫外-可见吸收光谱。
   4. 通过确定吸光度峰值达到相对最高点时所对应的波长，确定各样品的最大吸收波长。

结果

从 D. pealeii 背部外套膜中分离出色素细胞（图1A，图1B）。去除后，通过离心和洗涤循环裂解并纯化色素细胞，以分离出含色素的颗粒（图2A，图2B）。使用酸性甲醇溶液（HCl-MeOH）从颗粒中提取色素（图2C），得到可溶性色素提取物和不溶性的、无色的脱色颗粒。

提取过程会减小颗粒的平均直径，这一现象可通过扫描电子显微镜（SEM）观察到。在颗粒暴露于HCl-MeOH之前，其平均直径为(527.3 ± 91.8) nm（N = 100，误差为标准偏差；图3A）。当色素从颗粒中被提取后，颗粒尺寸减小至(202.6 ± 32.2) nm（N = 100，误差为标准偏差；图3B）。该尺寸减小现象被认为...

讨论

我们已展示了一种从乌贼色素细胞颗粒中提取色素的方法。通过特异性地靶向这些颗粒，我们的目标是确定其在介导适应性体色变化中的作用。该方法不同于以往使用整体组织样本¹⁴或冻干皮肤¹⁵来表征头足类色素的研究报道。

尽管该方案在提取色素细胞色素方面是有效的，但其仅适用于小规模反应。解剖一只鱿鱼可获得约 11 mg 纯化的颗粒。其中约 58% 的质量含有可溶性色素，该色素使用 HCl-MeOH 溶液提取¹²。起始用色素细胞组织的纯度直接影响单次解剖所得产物的产量。如果样品在解剖过程中混入过多表皮组织或虹彩细胞组织而出现污染，则最好将样品内容物分离出来，重新悬浮于额外缓冲液中，并重新开始匀浆步骤。从色素细胞组织中分离出纯的色素颗粒群体可能需要多达八次、每次 4 小时的超声处理循环，整个过程可能持续 4 天。在分离过程中保持耐心至关重要，以确保获得纯的色素颗粒群体。

起始颗粒溶液的纯度也会影响使用 HCl-MeOH 进行的色素提取步骤。如果颗粒被未消化的组织包裹，只需将样品涡旋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶	Alfa Aesar	9001-12-1	无危害
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	3482-12-3	刺激性，急性毒性
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	轻度刺激性
盐酸	EMD Chemicals	7647-01-0	腐蚀性
k-天冬氨酸钾	Sigma-Aldrich	1115-63-5	与氧化剂剧烈反应
氯化镁	Sigma-Aldrich	7786-30-3	轻度眼刺激
甲醇	Pharmco-AAPER	67-56-1	高度易燃
微型蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	469315-90-01	对金属和皮肤具有腐蚀性
木瓜蛋白酶	Sigma-Aldrich	9001-73-4	刺激性