方法文章

用于将物质靶向递送至中枢神经系统的 小鼠 微外科灌注技术 通过 颈内动脉

DOI：

10.3791/54804

⸱

2017年1月31日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

本文内容

摘要

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本方案描述了一种小鼠显微外科灌注技术，可通过颈内动脉将物质直接有效地递送至脑内。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中枢神经系统（CNS）疾病及其相关的血脑屏障破坏性疾病的动物模型，通常需要将外源性物质递送至脑组织。这些外源性物质可能引发损伤效应，也可能构成治疗策略的一部分。目前将外源性物质递送至脑内的最常用方法是全身性给药，例如皮下注射或静脉注射。尽管这些方法被广泛使用，但仍存在多种局限性，包括脑内递送效率较低。相比之下，将物质直接局部递送至中枢神经系统的外科方法更具特异性，并可避免其他器官对外源性物质的摄取。目前已有多种用于中枢神经系统递送的外科技术，但这些方法往往具有较高的创伤性。本文介绍一种小鼠灌注显微外科技术，可通过颈内动脉将物质高效递送至脑内，且创伤极小，不会干扰中枢神经系统的正常功能。

引言

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体内中枢神经系统（CNS）疾病模型需要将外源性物质（如药物、病原体或外泌体）有效递送至大脑。因此，理想的递送方法应对动物造成最小创伤，保持神经网络的完整性，并在大脑中实现较高的物质浓度1。

已有多种局部递送物质的外科手术方法被报道，包括鞘内、脑内和脑室内注射或植入2,3,4,5。然而，这些方法被认为会对中枢神经系统（CNS）造成创伤，且仅能给予少量目标物质。此外，有研究表明，外源性物质可能被脑脊液迅速清除6，且采用上述技术时，物质向脑实质的渗透范围有限7。全身性递送方法（如口服、肺部、皮下和静脉途径）在动物模型中更为常用，但由于其他器官的摄取作用，这些方法将物质递送至中枢神经系统的效率较低8,9。因此，这些递送途径需要使用较高剂量的给药物质，从而增加了副作用和毒性的风险10,11。

本文介绍了一种小鼠输注显微手术技术，该技术可通过颈内动脉直接将物质有效递送至脑内。除了能够靶向中枢神经系统递送外，该技术不会绕过正常的生理屏障，因此与治疗药物或病原体进入脑组织所涉及的生物学过程高度相关。

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方案

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以下方案所涉及的实验程序已获得迈阿密大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。此外，所有操作均在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。

1. 手术小鼠的准备

  1. 使用实验室麻醉系统，将异氟烷与氧气混合，对小鼠进行麻醉。异氟烷浓度设定在4-5%之间。 并在商用仪器上设置氧气流速为2 L/min（见材料表）。将动物转移至手术台面，在体视显微镜下通过鼻罩维持麻醉（使用异氟烷浓度1.5–2.5，氧气流速2 L/min）。
    1. 确保小鼠呼吸频率约为1 - 2次/秒，且无喘息现象。同时，确认动物无胡须刺激反应和足底反射（趾夹反射）。术中至少每5分钟监测一次呼吸频率和呼吸努力程度。. 遵循特定的机构动物护理和使用委员会以及兽医指南，对啮齿类动物麻醉进行监测。
  2. 使用无菌棉签在每只眼睛上涂抹一滴眼用润滑剂，以防止干燥。 建议给予抗炎药和镇痛药以缓解不适。
  3. 动物仰卧时，通过鼻罩维持麻醉。
  4. 用擦拭布对动物颈部区域擦拭三遍以清洁该区域 使用70%乙醇和氯己定进行消毒。用剃刀剃除动物手术区域的毛发（详见下文）。

2. 颈总动脉（CCA）的解剖分离

  1. 在体视显微镜下进行整个显微手术操作。使用手术剪和镊子在颈部正中做一浅表切口，从胸骨上方至下颌下方（约3至4厘米）。
  2. 用镊子仔细分离脂肪和结缔组织，暴露气管。
  3. 将一个枕头（圆形物体，直径约0.5厘米）置于小鼠颈部后方，以伸展颈部，进一步暴露手术区域。
  4. 使用组织牵开器或钩子分离组织。
  5. 在动物气管左侧，小心用镊子分开结缔组织，暴露左侧颈总动脉（CCA）。
  6. 用镊子仔细去除所有结缔组织，暴露颈总动脉分叉处以及颈外动脉和颈内动脉的起始段。

3. 准备用于物质输注的CCA

  1. 使用镊子将两段尼龙缝合线（每段约 1 cm）插入颈外动脉（ECA）下方。
  2. 在 ECA 尽可能高的位置打一个永久结。
  3. 在 ECA 尽可能低的位置、紧邻颈总动脉（CCA）分叉上方，打一个可拆除的结。此结应比上方的结更松。
  4. 在尽可能低的位置，使用血管夹闭合颈总动脉（CCA）。
  5. 使用血管夹闭合颈内动脉（ICA）。
  6. 使用显微解剖弹簧剪在两个结之间的 ECA 上做一个小切口（约 2 mm）。

4. 物质输注 通过 ICA

  1. 组装灌注系统。将一段长约6英寸的毛细管（理想尺寸：2.5 mm × 1.2 mm）连接至含有250 µl待灌注物质（如药物、病原体、细胞外囊泡等）的结核菌素注射器上，并将毛细管尖端轻轻插入步骤3.6中制作的切口。
  2. 继续缓慢推进毛细管，使其到达颈外动脉分叉处与夹闭颈总动脉（CCA）的夹子之间的中点位置。
  3. 结扎下方的颈外动脉（ECA）结。确认结扎松紧适度，既能保证毛细管具有一定活动性，又可防止液体泄漏。
  4. 移除颈内动脉（ICA）上的夹子。
  5. 轻柔地推动注射器活塞，以大约10 µl/秒的速度进行物质灌注。

5. 输注后操作步骤

  1. 将夹子重新放回颈内动脉（ICA）上。
  2. 轻柔地移除毛细管管路。
  3. 完全结扎远端颈外动脉（ECA）的结。
  4. 移除颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA）上的夹子。

6. 切口关闭与术后护理

  1. 移除牵开器或组织钩以及垫枕。
  2. 使用无菌生理盐水清洁缝合区域。
  3. 使用尼龙缝线/缝合针和镊子关闭切口。
  4. 给予抗炎药和镇痛药以缓解术后不适。
  5. 将动物置于放置在加热垫上的笼子中至少1小时，并监测其恢复情况。

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结果

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本文所述的小鼠输注显微手术技术具有很高的通用性，已用于将不同物质直接递送至脑内，包括在脑转移形成的一个代表性模型中递送肿瘤细胞1,12。

该技术也适用于评估不同病原体在中枢神经系统（CNS）中的病理特征。在一种HIV感染的小鼠模型中，通过灌注手术将病毒颗粒直接注入颈总动脉（CCA）。我们发现，术后7天，通过实时PCR检测，中枢神经系统呈HIV阳性。此外，同侧半脑的感染水平比对侧半脑高6-10倍（图2）。

本文所述输注手术的另一种适用方法是将细胞外囊泡（ECVs），主要是外泌体，递送至中枢神经系统。图3显示在输注24小时后，小鼠同侧脑组织中存在携带绿色...

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讨论

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本文所述的输注显微手术已被证明在将具有各种生物学特性的外源性物质递送至中枢神经系统（CNS）方面非常成功，同时可防止其在体内广泛扩散1,12。血脑屏障的破坏是多种中枢神经系统相关疾病的病理特征；因此，评估外源性物质与血脑屏障之间关系具有重要的研究意义和科学价值。

本手术模型对动物造成的创伤较小，且与极低的死亡率相关1,12。此外，该操作不会干扰中枢神经系统功能或脑血流1,12。该手术最关键的步骤是在颈外动脉（ECA）上进行正确切口，切口大小应仅允许毛细管插入。若切口过大，将导致输注物质外漏，从而需要在对侧重新进行ECA手术。为避免此情况，毛细管的直径应大于切口，并应具有锋利的边缘，以利于其进入动脉。从技术层面而言，经过充分培训的人员可...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢Lei Chen博士（纽约西奈山医学院）首次在我们的实验室中建立了该模型的应用，感谢Gretchen Wolff博士（德国海德堡德国癌症研究中心）在我们实验室中推广了该技术。本研究部分得到以下基金支持：HL126559、DA039576、MH098891、MH63022、MH072567、DA027569以及NSC 2015/17/B/NZ7/02985。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉仪器Vetequip901806
手术剪Fine Science Tool14558-09
直头手术镊Fine Science Tool00108-11
弯头手术镊Fine Science Tool00109-11
弹簧剪Fine Science Tool15000-08
尼龙缝合线Braintree ScientificSUT-S 104
毛细管（Micro-Renathane 0.010” x 0.005” 每英尺） Braintree ScientificMRE01050
缝合用缝线VWR95057-036
异氟烷Piramal
2,3,5-三苯基氯化四氮唑FisherScientific50-121-8005

参考文献

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  1. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
  2. Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
  3. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  4. Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
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