大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

摘要

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。

摘要

阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等进行性神经退行性疾病正日益威胁全球人类健康。尽管哺乳动物模型已为理解致病机制提供了重要见解，但哺乳动物系统的复杂性及其高昂的成本限制了其广泛应用。因此，简单而成熟的Drosophila模型系统 为研究这些疾病中受影响的分子通路提供了一种替代方案。神经退行性疾病除表现为行为缺陷外，还具有神经元死亡和轴突病变等组织病理学表型。为了量化神经元退变，并确定遗传和环境因素如何影响其进程，我们采用一种基于测量成年果蝇脑内空泡的组织学方法。为最大限度减少系统误差，并在同一制备样本中直接比较对照组与实验组果蝇的切片，我们使用石蜡切片的“ collar”法。随后通过测量果蝇脑内形成的空泡的大小和/或数量来评估神经退变。该方法既可聚焦于特定感兴趣区域，也可通过对覆盖整个头部的连续切片进行分析来评估全脑。因此，该方法不仅可用于检测严重的退变，还可检测仅在少数切片中可观察到的较轻微表型，例如正常衰老过程中出现的变化。

引言

随着预期寿命的增加，阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病已成为普通人群日益严重的健康威胁。根据美国国立卫生研究院的数据，预计到2050年，全球将有1.15亿人受到痴呆症的影响。尽管在识别至少部分此类疾病相关的基因和风险因素方面已取得显著进展，但对于其中许多疾病而言，其潜在的分子机制仍不清楚或尚未被充分理解。

诸如秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）等简单的无脊椎动物模式生物在研究神经退行性疾病机制方面具有多种实验优势，包括生命周期短、子代数量多，以及拥有成熟且有时独特的遗传学和分子生物学研究方法^1-12。此外，这些生物适用于无偏倚的相互作用筛选，能够通过其对神经退行性表型的加剧或缓解作用，鉴定出参与疾病发生的相关因子。

分析此类遗传相互作用并评估衰老效应，需要定量的实验方案来检测神经退行性变并衡量其严重程度。通过测量果蝇（Drosophila）的行为学特征，如嗅觉学习能力、负向趋地性或快速趋光性，可相对简便地实现这一评估，这些行为可提供量化的表现数值^13-21。此外，也可通过计数神经元来确定对神经元存活的影响。然而，这种方法仅适用于那些易于明确识别的特定神经元群体，例如在帕金森病（PD）中受影响的多巴胺能神经元；即便如此，相关研究结果仍存在争议^22-24。

本文所述方案采用套环法进行石蜡连续切片，该方法最初由Heisenberg和Böhl建立，用于分离果蝇（Drosophila）中具有解剖学脑部突变的个体²⁵。此后，该方法已被拓展应用于冰冻切片、振动切片和塑料切片等技术中^26-28。本文中，该方法被用于获取完整果蝇头部的连续切片，进而可用于测量具有神经退行性表型果蝇中出现的空泡化区域^16,21,29-32。这些测量可针对特定脑区进行，也可覆盖整个大脑；后者有助于识别即使在衰老过程中出现的微弱退行性表型。最后，使用套环时，最多可将20只果蝇作为同一批样本进行处理，这不仅节省时间，还可使对照组与实验组果蝇在同一制备样本中进行分析，从而最大限度地减少因制备条件细微变化所导致的人为假象。

方案

1. 将头部固定在套环上并进行石蜡包埋

注意：固定过程中的所有步骤均应在通风橱中进行。苯甲酸甲酯虽无健康风险，但具有强烈独特的气味，若不在通风橱中操作，气味可能令人难以忍受。

1. 在麻醉果蝇之前，配制50 mL Carnoy溶液：将15 mL氯仿和5 mL冰醋酸加入30 mL 99%乙醇中（切勿将氯仿与冰醋酸直接混合）。将溶液倒入底部平坦的玻璃容器（如结晶皿）中，确保颈圈能够平放并完全浸没于溶液中。
2. 使用CO₂或乙醚麻醉果蝇。
3. 用镊子将果蝇（大多数颈圈可穿入最多20只）从颈部穿入颈圈中。注意使所有果蝇头部朝向一致，如图1A所示，并操作轻柔，避免对头部或眼睛造成损伤。
4. 随机穿入一些sine oculis果蝇（箭头所示，图1A），以便在切片中易于识别果蝇的排列顺序。此外，若实验果蝇眼色较浅或为白色，应在其中穿入若干红眼果蝇（如野生型），以确保有足够的色素用于染色。若使用多个颈圈，需在记录表上记录每只果蝇的顺序及其对应的颈圈编号。
5. 完成一个颈圈后，将其放入已配制好的Carnoy溶液中固定3.5–4小时。
6. 将Carnoy溶液倒入指定的废液容器中，开始乙醇洗涤步骤。倾倒时应缓慢进行，以免扰动容器中颈圈的位置。
7. 用99%乙醇洗涤颈圈两次，每次30分钟。
8. 用100%乙醇洗涤颈圈1小时。务必按时更换洗涤液，防止过度脱水。
9. 将颈圈置于甲基苯甲酸酯中，在室温下过夜。用Parafilm密封容器，防止甲基苯甲酸酯挥发。
10. 将甲基苯甲酸酯倒入通风橱内的合适一次性容器中。加入预先配制的1:1低熔点（56–57 °C）石蜡与甲基苯甲酸酯混合液，处理1小时。此后，颈圈需始终置于65 °C恒温箱中，以防止石蜡凝固。
11. 将甲基苯甲酸酯与石蜡混合液倒入合适的一次性容器中，然后将保持在65 °C的熔融纯石蜡倒入颈圈上。
12. 30分钟后更换石蜡，至少重复此步骤5次。总共应进行至少6–8次石蜡浸润。
13. 完成浸蜡后，将颈圈放入橡胶冰格盘中，冰格大小应与颈圈相近。倒入熔融石蜡，完全覆盖颈圈，过夜使其凝固（尽量避免产生气泡）。
14. 从冰格盘中取出含有颈圈的石蜡块。用刀片将石蜡块与颈圈分离，轻轻掰下颈圈。果蝇头部将保留在石蜡块中，而身体部分则留在颈圈内。石蜡块可在室温下保存。
15. 清洁颈圈时，将其在65 °C的脱蜡剂中浸泡以去除残留石蜡，轻柔刷洗后用乙醇冲洗，方可重复使用。

2. 切片与封片

1. 将加热板预热至 50 °C。将样品台（或金属固定块）和剃刀刀片放在加热板上，使其预热。
2. 根据所需的切片方向，将石蜡包埋块以头部朝侧边（用于水平切片）或朝上（用于冠状切片）的方式固定在预热的金属固定块上（短暂熔化接触面使石蜡块粘附）。将固定块从加热板上取下，静置冷却至少 10 分钟，确保石蜡充分硬化，以实现与固定块的良好密封。尽可能使头部排列成行并与固定块表面保持平行，以避免切片厚度不均。
3. 取一片剃刀刀片，修去果蝇头部周围的多余石蜡，仅保留包含头部的一小排组织（可预先加热刀片以方便修块）。注意不要过度修切，以免在切片过程中石蜡断裂（可在切片过程中进一步修整）。
4. 将固定块放入切片机的样品夹中，并确保头部排列方向尽可能与刀片边缘平行。
5. 在载玻片表面覆盖一层稀薄的多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液以进行预处理，室温干燥 5 分钟。使用前短暂用清水润湿载玻片。
6. 切取 7 µm 厚的切片，并将切片带转移至漂浮于水面上的载玻片上。
   注意：为获得完整的脑组织水平切片，我们从开始切到眼睛部位起，持续收集切片带，直至整个头部被完全切完（从喙部向脑部方向切片）。完整头部可能需要使用多张载玻片。
7. 将载玻片置于 37 °C 的加热板上，使切片带展开约 1 分钟。
8. 去除多余水分（通过倾倒或使用纸巾吸除），并将载玻片在室温下过夜干燥。
9. 将载玻片放入装有脱蜡剂的高型垂直玻片染色缸中（确保液体完全覆盖切片），以去除载玻片上的石蜡。进行 3 次洗涤，每次 30 至 60 分钟。
10. 从最后一次洗涤中取出载玻片，在切片区域滴加 2 滴封片介质，并加盖大片盖玻片。

3. 拍摄与分析切片

1. 将制备好的玻片干燥 1 - 2 天，然后在荧光显微镜下用蓝光观察。
2. 使用较低倍镜确定果蝇的方向，若关注特定区域，可借此找到目标区域。
   注意：对于 sws 果蝇（见图 2），我们寻找包含大联合（great commissure）的切片并拍摄图像（通常使用 40 倍放大）。当分析整个大脑时（如图 3所示），逐层扫描头部的所有切片，拍摄表型最严重的切片图像，或所有出现空泡的切片图像。
3. 进行双盲分析时，在不明确基因型的情况下拍摄并编号图像，同时记录每只果蝇的项圈编号及其在排布中的位置，以便后续识别。
4. 图像拍摄完成后，使用图像分析软件进行分析。
5. 统计每张切片或每只果蝇头部的空泡数量。为测量空泡大小，将图像导入软件程序，使用选区工具圈选空泡，测定所选空泡内的像素数量。
6. 为转换为 µm²，需在拍摄样本所用的放大倍数下拍摄载物台微尺校准玻片的照片，测定 100 µm² 对应的像素数量，以计算转换系数。
7. 将总像素数除以上述步骤计算出的转换系数，即可得到以 µm² 为单位的面积。

结果

采用所述方法可获得由眼色素染色的连续切片³³，这些切片涵盖整个果蝇头部。其中一部分如图1B所示，图中单个果蝇头部的切片自上而下排列。本示例中，不同果蝇的切片从左至右排列。为便于定位和识别果蝇个体，在第3位插入了一只无眼果蝇（sine oculis）作为标记（箭头，图1B）。

为了量化神经退行性变，我们测量在这些切片中可检测到的空泡形成情况。空泡定义为位于绿色荧光神经 Neuropil 内的圆形深色斑点（箭头所示）。 图2 和 3）或大脑皮层，并且在果蝇脑的至少连续两个切片中可见。通过测量空泡来量化神经退行性变化，可以针对特定脑区进行，也可以对整个大脑进行分析。当突变仅影响特定脑区时，将分析限定于脑的特定区域尤为有用，例如嗅觉叶 futsch^olk

讨论

本方法提供了一种量化 Drosophila 大脑中神经退行性变的手段。尽管其他方法（如计数特定类型的细胞）也可用于识别神经退行性变，但本方法的优势在于其适用范围更广。细胞计数要求能够通过特异性抗体或细胞特异性标记物的表达来可靠地识别这些细胞，而这些条件并非总是具备。此外，已有研究表明，使用该方法可能获得截然不同的结果²⁴，推测原因在于标记和检测过程中所采用的条件不同。另一种检测变性细胞的方法是使用细胞死亡标志物，例如抗活化caspase 3。然而，这种方法仅能识别正处于细胞死亡过程中的细胞 ，一旦细胞死亡完成，便不再可被检测。本方法的另一优势在于无需染色，因为眼色素自身的自发荧光即可实现观察，从而节省时间，并减少因染色条件变化而引起的伪影。需要注意的是，使用本方法时，果蝇的眼睛必须含有足够的色素以使载玻片充分着色。如果眼色过浅，建议在切片中加入一些野生型果蝇，以确保载玻片上染色充分且均匀。本方法的额外优势还在于可同时检测多个区域，甚至在同一头部样本中进行。尽管本文未展示相关数据，但我们已利用这些切片检测了视网膜中的神经退行性变以及视叶皮层中的胶质细胞丢失^30,36。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号
切片环（Collar）	Genesee Scientific	TS 48-100	我们使用的是定制的切片环，由一整块金属制成，而非Genesee公司产品那样的多层结构。有关如何制作切片环的说明可参见http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
用于包埋的橡胶冰格盘	家用商店		可通过粘贴附加隔板来自定义尺寸
结晶皿	Fisher Scientific公司	08-762-3
乙醚	Fisher Scientific公司	E138-1
乙醇	Decon Laboratories Inc.	2701
氯仿	Fisher Scientific公司	C298-500
冰醋酸	Fisher Scientific公司	A38-212
苯甲酸甲酯	Fisher Scientific公司	M205-500	气味明显——请在通风橱中使用！
低熔点石蜡	Fisher Scientific公司	T565	确保在65°C水浴中额外保存已熔化的石蜡
切片机	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
显微镜载玻片	Fisher Scientific公司	12-550D
显微镜盖玻片	Fisher Scientific公司	12-545-M
SafeClear透明剂	Fisher Scientific公司	314-629	用于洗涤的三个不同容器
带盖垂直染色缸	Ted Pella Inc.	432-1
Permount中性树胶	Fisher Scientific公司	SP15-500
多聚-L-赖氨酸溶液（PLL）	Sigma Life Science	P8290-500