使用组蛋白-miniSOG在C. elegans中进行光遗传学随机诱变

摘要

基于基因编码的组蛋白-miniSOG可在蓝 光依赖的方式下诱导全基因组范围内的可遗传突变。该诱变方法操作简便、速度快、无需有毒化学试剂，非常适合用于正向遗传筛选和转基因整合。

摘要

在模式生物中进行正向遗传筛选是发现多种生物学过程中功能重要基因和通路的主要手段。在大多数基于诱变的筛选中，研究人员依赖使用有毒化学物质、致癌物或辐射，这些方法需要专用设备、安全防护措施和/或危险材料的处理。我们开发了一种简单的方法，利用在生殖系表达的组蛋白-miniSOG（一种光诱导的活性氧高效生成器）在C. elegans中诱导可遗传的突变。该诱变方法无需使用有毒化学物质，对实验室安全和废物管理的要求极低。所诱导的DNA修饰包括单核苷酸变化和小片段缺失，可补充经典化学诱变所引起的突变类型。该方法还可用于诱导染色体外转基因的整合。本文提供了LED装置的详细信息，以及标准诱变和转基因整合的实验方案。

引言

正向遗传筛选已被广泛用于在模式生物中产生破坏各种生物学过程的遗传突变体，例如 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）¹对这类突变体的分析有助于发现功能重要的基因及其信号通路^1,2. 传统上，诱变在 秀丽隐杆线虫 使用诱变化学物质、辐射或转座子实现²化学物质如乙基甲磺酸盐（EMS）和 N-乙基-N亚硝基脲（ENU）对人类具有毒性；γ射线或紫外（UV）辐射诱变需要特殊设备；而转座子活性菌株，例如突变株³，可能在维持过程中导致不必要的突变。我们开发了一种简单的方法，利用基因编码的光敏剂来诱导可遗传的突变⁴.

活性氧（ROS）可损伤DNA⁵。微型单线态氧生成器（miniSOG）是一种由106个氨基酸组成的绿色荧光蛋白，其源自拟南芥（Arabidopsis）向光素2的LOV（光、氧和电压）结构域⁶。在蓝光（~450 nm）照射下，miniSOG以黄素单核苷酸为辅因子生成包括单线态氧在内的活性氧^6-8，而该辅因子存在于所有细胞中。我们通过将miniSOG与组蛋白H72（一种C. elegans组蛋白3的变体）的C末端融合，构建了His-mSOG融合蛋白。我们构建了一个单拷贝转基因⁹，以在 C. elegans生殖系中表达His-mSOG。在黑暗条件下正常培养时，携带His-mSOG转基因的线虫具有正常的产卵量和寿命⁴。当暴露于蓝光LED照射后，这些His-mSOG线虫的后代中会产生可遗传的突变⁴。诱导突变的类型包括核苷酸替换（如G:C→T:A和G:C→C:G）以及小片段染色体缺失⁴。该诱变方法操作简便，且对实验室安全设施要求极低。本文中，我们描述了用于光遗传学诱变的LED照射装置及其实验操作流程。

方案

1. LED 照明器的构建

注意：所需LED设备已在材料列表中汇总。整个LED装置体积较小，可放置在实验室的任意位置，但我们建议将其置于暗室中，以控制线虫的光照暴露⁴。

1. 使用电缆将 LED 连接到控制器（图 1A, D）。
2. 使用 BNC 电缆将控制器连接至数字函数发生器/放大器（图 1A, C, D）。
3. 使用定制支架将 LED 光源固定在载物台上方 10 cm 处（图 1A）。
   注意：我们使用金属部件制作该支架。
4. 部分遮盖 LED 照明装置，但避免热量积聚（图 1B），以免导致线虫不适。
   注意：我们使用一个定制的硬质塑料罩，顶部和底部开放（图 1A）。该罩并非诱变实验本身所必需，但可用于限制蓝光对周围环境的非必要照射。建议不要完全遮盖 LED 装置（图 1B），以防止线虫过热。
5. 佩戴激光防护眼镜。
   注意：由于光线非常明亮，我们佩戴激光防护眼镜。普通太阳镜也可能起到类似作用。
6. 将 LED 控制器的拨杆切换至“Int.”位置，以实现持续照明（图 1D），并将输出功率设置为最大功率的 65%（图 1C）。
7. 按照制造商的操作规程，使用光度计测量线虫所在载物台上的蓝光强度。在持续照明条件下，该装置提供的光强为 2.0 mW/mm²。

2. 蓝光处理

注意：使用菌株 CZ20310 juSi164[Pmex-5-HIS-72::miniSOG-3'UTR(tbb-2) + Cb-unc-119(+)] unc-119(ed3)III⁴。该菌株可从秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC，http://www.cgc.cbs.umn.edu/）获取。

1. 在标准线虫生长培养基（NGM）平板上避光培养 His-mSOG 菌株，并以 E. coli OP50，遵循标准方案^10,11.
   注意：在环境光下， juSi164含该菌株的突变率未超过自发突变率⁴使用卤素灯的解剖显微镜进行常规菌株传代通常也不会引起突变。尽管如此，仍应注意避免不必要的光照暴露。 例如， 将菌株置于标准的避光培养箱中，或用铝箔包裹菌株。建议在收到菌株后即进行分装冻存，以防随时间推移积累不必要的突变。
2. 挑选饱食的年轻成虫（约12小时） L4期后）动物用线虫挑取器¹¹.
   注意：较年轻的动物表现出的诱变效应较弱⁴而年长的动物可能产仔数量较少。
3. 将滤纸剪裁至适合60 mm培养皿，并在其中心剪出一个25 mm × 25 mm的方形孔，然后将其放置于未接种细胞的培养皿上（图1E).
   注意：可以使用方形打孔器，但 打孔的尺寸无需十分精确。
4. 加入 100 µL 100 mM CuCl 溶液₂ 将滤纸均匀覆盖在平板的方形孔上，以限制线虫在孔内活动。
5. 挑选所需数量的带有卵的年轻成年雌雄同体线虫（示例见步骤3），并转移至 CuCl 培养基中央₂ 平板
6. 佩戴激光防护眼镜。
7. 打开LED和函数发生器。
8. 将LED控制器的拨杆切换至“Ext.”，以通过函数发生器对其进行控制（图1D).
9. 将控制器设置为最大功率的65%，函数发生器设置为正弦波，4 Hz（图1C).
10. 将 CuCl 放置₂ 步骤2.5中未加盖的培养板置于LED光源下的载物台上图1A).
11. 用蓝光照射动物30分钟。
12. 将外观健康的线虫转移至已接种细菌的培养板中作为P代₀.
    注意：所需数量的 P₀ 取决于屏幕类型。示例见步骤 3。P₀ 光照处理后，线虫可能暂时表现出运动不协调，随后会随时间逐渐恢复。
13. 用锡箔覆盖线虫后置于培养箱或黑暗环境中；随后按照标准流程开始筛选其子代中目标表型^2,10.

3. 正向遗传筛选示例

注意：这是使用 120 个单倍体基因组进行克隆筛选的示例，用于检测 LED 和菌株是否正常工作。图 2 展示了该操作流程的示意图。

1. [第1天] 蓝光处理后，挑选五条形态健康的线虫至含OP50的NGM平板上作为P₀代，置于20 °C培养箱中培养，让其产卵1天（“第1天”平板）。
2. [第2天] 将P₀代转移至新的涂布平板上（“第2天”平板）。
3. [第3天] 在“第2天”平板上通过灼烧方式挑取并杀死P₀代。
4. [第4天] 从“第1天”平板上挑选30条带有卵的年轻成虫F₁代，分别转移至独立的平板上（共30个F₁代平板，对应“第1天”）。
5. [第5天] 对“第2天”平板重复步骤3.4（共30个F₁代平板，对应“第2天”）。
6. [第7–9天] 当F₂代线虫发育至成虫时，在体视显微镜下观察其相对于野生型菌株的异常形态和/或行为（图3A）。
   注意：若为高外显率的隐性可遗传突变，F₂代中约有四分之一的线虫会表现出相同的表型。然而，部分突变体可能生长缓慢和/或表现为不完全外显，因此平板上突变体数量可能少于四分之一。
7. 单独挑取具有明显表型的线虫，并检测该表型在下一代中的可遗传性。

4. 染色体外转基因整合示例

1. 按照标准注射方案^12,13，将目标DNA注射到CZ20310 juSi164[Pmex-5-HIS-72::miniSOG-3'UTR(tbb-2) + Cb-unc-119(+)] unc-119(ed3)线虫中，制备遗传传递率较低（10–30%）的转基因线虫。
   注意：也可将已建立的染色体外阵列通过杂交导入juSi164品系。为避免对juSi164进行基因分型，可使用juSi164杂合子作为P₀代，但效率可能降低。juSi164的基因分型方法见第5节。
2. [第1天] 将约20只转基因P₀代线虫按步骤2所述进行蓝光处理。
   注意：所需P₀代线虫数量取决于遗传传递率。转基因可通过表型或共注射标记进行鉴定^12,13。
3. 挑选10只状态健康的P₀代线虫，分别转移到独立的培养板上，置于20 °C培养箱中，让其产卵数天（P₀代培养板）。
4. [第4天] 从每块P₀代培养板中分别挑选20只转基因F₁代线虫，转移到各自的培养板上并让其产卵。（共10块P₀代板 × 20只F₁代线虫 = 总计200块F₁代培养板。）
5. [第7天] 筛选出F₂代转基因比例>75%的F₁代培养板。
6. 从转基因传递率>75%的F₁代培养板（即F₂代培养板）中，各挑选5只转基因线虫。
7. [第10天] 保留转基因传递率为100%的F₂代培养板，作为潜在的整合品系。
8. 采用标准流程¹⁰对潜在整合品系进行回交，以验证孟德尔式分离规律，并去除可能存在的背景突变。

5. 基因分型

1. 采用标准方案¹⁴，用裂解缓冲液裂解20条异交F₂线虫。
2. 使用MosSCI插入引物⁹、juSi164（表1），在退火温度为58 °C的条件下进行PCR，操作遵循标准方案¹⁴。
   注意：无需对unc-119(ed3)进行基因型鉴定，因为在后续步骤5.4和5.5中移除拯救性转基因（juSi164）后，可通过观察运动不协调行为来检测unc-119(ed3)的存在。
3. 进行琼脂糖凝胶电泳¹⁵，检测条带大小（表1），以确定juSi164的野生型（WT ）。
4. 检查F₂后代中是否存在因携带unc-119(ed3)而导致的瘫痪线虫。
5. 若在步骤5.4中发现运动不协调的线虫，挑取数条运动正常的线虫进行单虫培养，以在下一代中获得全部运动正常的个体。

结果

我们使用 CZ20310 juSi164 unc-119(ed3) 进行了正向遗传筛选，按照第2和第3节所述的标准方案进行30分钟光照处理。在对应于120个诱变单倍体基因组的60个F₁平板中，我们发现有8个F₁平板的F₂代线虫表现出可见表型，例如体型缺陷（图3B）、运动不协调（图3C）以及成虫致死性（图3D）。我们在“第1天”和“第2天”处理的平板之间未观察到突变体数量的差异。单独挑选的小体型F₂线虫及其后代和运动不协调的F₂线虫后代均表现出相应的表型，表明这些是可遗传的突变体。完整的观察结果总结于表2。平均而言，针对120个单倍体基因组的克隆筛选将获得约10个F₁平板，其中包含可通过体视显微镜轻易观察到的身体形态或运动等明显表型的线虫。需要进一步的定量分析以精确确定突变率⁴

讨论

本文介绍了一种利用在生殖系中表达的His-mSOG进行光遗传学诱变的详细实验流程，并提供了一个小规模正向遗传学筛选的示例。与传统的化学诱变方法相比，这种光遗传学诱变技术具有多项优势：首先，该方法无毒，可使实验室人员避免接触诸如EMS、ENU以及三甲基补骨脂素联合紫外线（TMP/UV）等有毒化学诱变剂；其次，诱变实验过程适用于少量P₀代动物，且可在一小时内完成；第三，光遗传学诱变可产生广泛的突变类型，包括核苷酸替换 和染色体缺失；最后，该方法还可用于染色体外转基因的整合。

该诱变实验方案的关键步骤是确保LED装置在含有His-mSOG的菌株中以预期效率正常工作。我们建议按照第3部分实验方案所述，使用约100个单倍体基因组进行初步的克隆筛选。诱变实验可轻松从少量的初步克隆筛选扩展至非克隆筛选，方法是增加用于光照处理的P₀个体数量。对于大规模非克隆筛选，建议将线虫同步至产卵期年轻成虫阶段，并用M9溶液将数百只线虫转移至含CuCl₂的培养板上进行光照处理。据估计，步骤2和3中描述的标准条件的效率大约比广泛使用的50...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超高压LED光源	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED控制器	Prizmatix	UHPLCC-01
数字函数发生器/放大器	PASCO	PI-9587C	PI-9587C 已不再供货，替代型号为 PI-8127。
BNC公对公电缆	THORLABS	CA3136
USB-TTL接口	Prizmatix		可选
光度计	THORLABS	PM50 和 Model D10MM
滤纸	Whatman	1001-110
体视显微镜	Leica	MZ95
NGM平板			在1 L H2O中溶解5 g NaCl、2.5 g蛋白胨、20 g琼脂和10 µg/mL胆固醇。高压灭菌后，加入1 mM CaCl2、1 mM MgSO4和25 mM KH2PO4（pH 6.0）。
裂解液			10 mM Tris（pH 8.8）、50 mM KCl、0.1% Triton X-100、2.5 mM MgCl2、100 µg/mL 蛋白酶K