基于基因编码的组蛋白-miniSOG可在蓝 光依赖的方式下诱导全基因组范围内的可遗传突变。该诱变方法操作简便、速度快、无需有毒化学试剂，非常适合用于正向遗传筛选和转基因整合。
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本文内容
摘要
摘要
在模式生物中进行正向遗传筛选是发现多种生物学过程中功能重要基因和通路的主要手段。在大多数基于诱变的筛选中，研究人员依赖使用有毒化学物质、致癌物或辐射，这些方法需要专用设备、安全防护措施和/或危险材料的处理。我们开发了一种简单的方法，利用在生殖系表达的组蛋白-miniSOG（一种光诱导的活性氧高效生成器）在C. elegans中诱导可遗传的突变。该诱变方法无需使用有毒化学物质，对实验室安全和废物管理的要求极低。所诱导的DNA修饰包括单核苷酸变化和小片段缺失，可补充经典化学诱变所引起的突变类型。该方法还可用于诱导染色体外转基因的整合。本文提供了LED装置的详细信息，以及标准诱变和转基因整合的实验方案。
引言
正向遗传筛选已被广泛用于在模式生物中产生破坏各种生物学过程的遗传突变体，例如 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）1对这类突变体的分析有助于发现功能重要的基因及其信号通路1,2. 传统上，诱变在 秀丽隐杆线虫 使用诱变化学物质、辐射或转座子实现2化学物质如乙基甲磺酸盐（EMS）和 N-乙基-N亚硝基脲（ENU）对人类具有毒性；γ射线或紫外（UV）辐射诱变需要特殊设备；而转座子活性菌株，例如突变株3，可能在维持过程中导致不必要的突变。我们开发了一种简单的方法，利用基因编码的光敏剂来诱导可遗传的突变4.
活性氧（ROS）可损伤DNA5。微型单线态氧生成器（miniSOG）是一种由106个氨基酸组成的绿色荧光蛋白，其源自拟南芥（Arabidopsis）向光素2的LOV（光、氧和电压）结构域6。在蓝光（~450 nm）照射下，miniSOG以黄素单核苷酸为辅因子生成包括单线态氧在内的活性氧6-8，而该辅因子存在于所有细胞中。我们通过将miniSOG与组蛋白H72（一种C. elegans组蛋白3的变体）的C末端融合，构建了His-mSOG融合蛋白。我们构建了一个单拷贝转基因
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方案
1. LED 照明器的构建
注意：所需LED设备已在材料列表中汇总。整个LED装置体积较小，可放置在实验室的任意位置，但我们建议将其置于暗室中，以控制线虫的光照暴露4。
- 使用电缆将 LED 连接到控制器（图 1A, D）。
- 使用 BNC 电缆将控制器连接至数字函数发生器/放大器（图 1A, C, D）。
- 使用定制支架将 LED 光源固定在载物台上方 10 cm 处（图 1A）。
注意：我们使用金属部件制作该支架。 - 部分遮盖 LED 照明装置，但避免热量积聚（图 1B），以免导致线虫不适。
注意：我们使用一个定制的硬质塑料罩，顶部和底部开放（图 1A）。该罩并非诱变实验本身所必需，但可用于限制蓝光对周围环境的非必要照射。建议不要完全遮盖 LED 装置（图 1B），以防止线虫过热。 - 佩戴激光防护眼镜。
注意：由于光线非常明亮，我们佩戴激光防护眼镜。普通太阳镜也可能起到类似作用。 - 将 LED 控制器的拨杆切换至“Int.”位置，以实现持续照明（图 1D），并将输出功率设置为最大功率的 ....
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结果
我们使用CZ20310 juSi164 unc-119(ed3) 进行了正向遗传学筛选，按照第2和第3节所述的标准方案进行30分钟光照处理。在对应于120个经诱变的单倍体基因组的60个F1平板中，我们发现有8个F1平板的F2线虫表现出可见的表型，例如体型异常（图3B）、运动不协调（图3C）以及成虫致死（图3D）。我们未观察到“第1天”与“第2天”平板之间突变体数量存在差异。单独培养的小型F2线虫及其后代和运动不协调的F2线虫的后代均表现出相应的表型，表明这些突变是可遗传的。完整的观察结果总结于表2中。平均而言，针对120个单倍体基因组的克隆筛选将产生约10个F1平板，其中线虫表现出如体形和运动能力等在体视显微镜下易于识别的可见表型。需要更定量的分析才能精确确定突变率4。.......
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讨论
本文介绍了一种利用在生殖系中表达的His-mSOG进行光遗传学诱变的详细实验流程，并提供了一个小规模正向遗传学筛选的示例。与传统的化学诱变方法相比，这种光遗传学诱变技术具有多项优势：首先，该方法无毒，可使实验室人员避免接触诸如EMS、ENU以及三甲基补骨脂素联合紫外线（TMP/UV）等有毒化学诱变剂；其次，诱变实验过程适用于少量P0代动物，且可在一小时内完成；第三，光遗传学诱变可产生广泛的突变类型，包括核苷酸替换 和染色体缺失；最后，该方法还可用于染色体外转基因的整合。
该诱变实验方案的关键步骤是确保LED装置在含有His-mSOG的菌株中以预期效率正常工作。我们建议按照第3部分实验方案所述，使用约100个单倍体基因组进行初步的克隆筛选。诱变实验可轻松从少量的初步克隆筛选扩展至非克隆筛选，方法是增加用于光照处理的P0个体数量。对于大规模非克隆筛选，建议将线虫同步至产卵期年轻成虫阶段，并用M9溶液将数百只线虫转移至含CuCl2的培养板上进行光照处理。据估计，步骤2和3中描述的标准条件的效率大约比广泛使用的50.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）资助。感谢本实验室成员在测试实验方案和修改稿件过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 超高压LED光源 | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED控制器 | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| 数字函数发生器/放大器 | PASCO | PI-9587C | PI-9587C 已不再供货，替代型号为 PI-8127。 |
| BNC公对公电缆 | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL接口 | Prizmatix | 可选 | |
| 光度计 | THORLABS | PM50 和 Model D10MM | |
| 滤纸 | Whatman | 1001-110 | |
| 体视显微镜 | Leica | MZ95 | |
| NGM平板 | 在1 L H2O中溶解5 g NaCl、2.5 g蛋白胨、20 g琼脂和10 µg/mL胆固醇。高压灭菌后，加入1 mM CaCl2、1 mM MgSO4和25 mM KH2PO4（pH 6.0）。 | ||
| 裂解液 | 10 mM Tris（pH 8.8）、50 mM KCl、0.1% Triton X-100、2.5 mM MgCl2、100 µg/mL 蛋白酶K |
参考文献
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P.
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重印与许可
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