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方法文章

可视化斑马鱼肾间组织类固醇生成组织及其血管微环境

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DOI：

10.3791/54820

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2016年12月21日

 ,  ,  , 
1Department of Life Science, Tunghai University

本文内容

摘要

斑马鱼的间肾腺是哺乳动物肾上腺的硬骨鱼类对应器官。本方案介绍了如何进行3-β-羟基类固醇脱氢酶（Δ5-4 异构酶；3β-Hsd）酶活性检测，该检测可用于识别发育中斑马鱼体内已分化的类固醇生成细胞。

摘要

本方案介绍了如何通过一种简单的整体酶活性检测方法来识别已分化的间肾类固醇生成细胞。通过显色组织化学染色检测3-β-羟基类固醇脱氢酶/Δ5-4异构酶（3β-Hsd）活性阳性细胞，对于分别监测哺乳动物肾上腺皮质组织和硬骨鱼类间肾组织的形态与分化状态至关重要。在斑马鱼模型中，发育中的胚胎和幼体具有光学透明性和良好的组织通透性，使得能够对3β-Hsd活性进行整体染色。该染色方案若应用于标记发育中前肾细胞和内皮细胞的转基因荧光报告品系，可同时检测类固醇生成性的间肾组织、肾脏以及邻近血管系统。结合振动切片、免疫组织化学染色和共聚焦显微镜技术，我们能够可视化并分析间肾类固醇生成组织的血管微环境。由于目前尚无适用于标记斑马鱼类固醇生成细胞的合适抗体，3β-Hsd活性检测对于研究斑马鱼间肾器官的细胞生物学具有重要意义。此外，该检测方法快速且简便，因此可作为强有力的工具，用于针对肾上腺（间肾）遗传性疾病的相关突变体筛选，以及在药物学或毒理学研究中评估化学物质对类固醇生成过程的干扰效应。

引言

肾上腺是下丘脑-垂体-肾上腺轴的关键组成部分，能够分泌类固醇激素，并协调类固醇的稳态以及机体对压力的反应。肾上腺由外层的皮质和内层的髓质构成，其中皮质以分区特异性的方式分泌类固醇，而髓质则合成儿茶酚胺。在硬骨鱼类中，肾间腺相当于哺乳动物的肾上腺，由类固醇生成性的肾间细胞和嗜铬细胞组成，分别在功能上对应于肾上腺的皮质和髓质1-3。利用斑马鱼模型开展的研究表明，类固醇生成细胞和嗜铬细胞谱系的形成所涉及的分子与细胞机制与哺乳动物高度相似1,2。因此，斑马鱼是研究下丘脑-垂体-肾上腺（肾间腺）轴相关遗传性疾病、神经内分泌调控及系统生物学的有力模型。

在肾上腺中，3β-Hsd 催化孕烯醇酮转化为孕酮、17α-羟孕烯醇酮转化为17α-羟基孕酮，以及脱氢表雄酮转化为雄烯二酮4,53β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）对于合成所有类别的类固醇激素至关重要，包括孕酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雄激素和雌激素。人类的两种3β-HSD同工酶HSD3B1和HSD3B2具有差异性表达。6HSD3B1 在胎盘和外周组织中表达，而 HSD3B2 在肾上腺皮质和性腺中表达。人类 HSD3B1 和 HSD3B2 是斑马鱼的共直系同源基因。 hsd3b1，该基因在间肾组织和成体性腺中表达；斑马鱼 hsd3b2 是一个母系表达的基因，其转录本在器官发生前消失7斑马鱼整体3β-Hsd酶活性检测的全组织实验方案是通过改进Levy的方法并根据Milano的描述建立的 等，对八种硬骨鱼类的冷冻切片8由于斑马鱼在发育过程中具有组织通透性和光学透明性，整体3β-Hsd组织化学染色可成功应用于固定后的斑马鱼胚胎和幼鱼，特异性地显示已分化的间肾组织。

这种灵敏且快速的检测方法已应用于多种突变体和形态发生异常的样本，以展示不同类型的间肾发育异常。在间肾组织特化受到特异性敲低Ff1b转录因子干扰的胚胎中，间肾3β-Hsd活性缺失；而在Ff1b共调节因子Prox1被敲低导致间肾分化受损的情况下，3β-Hsd活性则降低9,10。值得注意的是，在具有严重早期发育缺陷的突变体（如one-eyed pinhead和squint）中仍可检测到3β-Hsd活性，此时3β-Hsd组织化学染色可清晰揭示间肾细胞迁移过程所受到的影响11。即使在完全缺乏血液和脉管系统的情况下，间肾组织的分化也不受影响。因此，可通过该方法明确内皮来源信号如何调控发育中的一肾器官12,13。总体而言，该组织化学检测方法已成功用于研究斑马鱼模型中类固醇生成细胞的特化、分化和迁移过程。因此，它应成为针对肾上腺及间肾器官疾病开展遗传学或化学筛选的一种高效且可靠的工具。

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方案

伦理声明：所有关于斑马鱼的实验操作均经东海大学机构动物照护与使用委员会批准（IRB 批准编号：101-12），并依照批准的指导原则进行。

1. 3β-HSD酶活性染色用储备溶液

  1. 配制反式脱氢表雄酮溶液 [10 mg/ml，溶于二甲基亚砜（DMSO）中]。
  2. 配制β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物溶液（1.2 mg/ml，溶于0.1 M磷酸缓冲液中，pH 7.2）。
  3. 配制烟酰胺（维生素B3，50 mg/ml，溶于H2O中）。
  4. 配制4-硝基蓝四氮唑盐溶液（50 mg/ml，溶于70%二甲基甲酰胺中）。
  5. 将上述各组分分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
    注意：根据我们的经验，上述溶液分装后反复冻融不会影响3β-Hsd活性染色的强度。

2. 全胚胎3β-Hsd活性染色

注意：当在28.5 °C条件下培养时，斑马鱼胚胎在受精后28小时（hpf）即可检测到3β-Hsd酶活性，这与hsd3b12,7 mRNA表达的起始时间一致。本研究中采用的整胚3β-Hsd活性染色方案基于先前描述的方法8，并已证实可在发育中的斑马鱼中成功应用至受精后7天9。在分析肾间类固醇生成组织的血管微环境时，必须将整胚3β-Hsd活性染色应用于表达内皮特异性荧光的转基因品系，例如Tg(kdrl:EGFP)s843 14和Tg(kdrl:mCherry)ci5 15。若结合斑马鱼肾脏发育来分析肾间类固醇生成组织，可将3β-Hsd活性染色应用于Tg(wt1b:GFP)li1 品系鱼类16，该品系可清晰显示肾小球及原肾小管的形成过程。

  1. 从12至24小时发育阶段（hpf）开始，将斑马鱼胚胎在含0.03%苯硫脲的卵水中（去离子水中含0.06 mg/L珊瑚盐）孵育，以抑制色素形成。
  2. 将去壳的胚胎或幼鱼固定于：(A) 含0.1% Tween 20的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBST）中，室温（RT）孵育1小时；或 (B) 含0.1% Tween 20的2% PFA固定液中，4 °C过夜或4 °C孵育2小时，随后室温孵育4小时。
    警告：PFA经吸入和皮肤接触有毒，对皮肤、黏膜、眼睛及上呼吸道有强烈刺激性和腐蚀性。
  3. 在含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）中，室温下清洗胚胎4次，每次10分钟。
    注意：更换清洗液时务必避免样本干燥。
  4. 在反应前新鲜配制染色液（表1）。将A组分和B组分分别在不同离心管中配制、涡旋混匀并离心。
    注意：若将所有组分直接加入同一管中，会导致严重沉淀。
  5. 将A组分溶液全部加入B组分溶液中，充分混匀以配制染色液，并立即向每管含有固定并清洗后的胚胎的微量离心管中各加入1 ml染色液。
  6. 用铝箔包裹微量离心管以避光，置于旋转仪或摇床上，在室温下轻柔振荡孵育。
  7. 通过显微镜观察显色信号，经验性确定反应时间。反应过程中会逐渐出现轻微沉淀，但不会干扰反应进程。
    注意：对于在28 hpf固定的胚胎，在25 °C染色4小时可在肾间组织中获得清晰信号。
  8. 用PBST清洗4次，每次10分钟，以终止反应。若无需进一步进行免疫组织化学（IHC）分析，则用4% PFAT在室温下对染色后的胚胎进行后固定60分钟；否则将清洗后的胚胎于4 °C保存，以备后续使用。
  9. 进行整体显微观察时，将染色、后固定并清洗后的胚胎用含50%甘油的PBS透明化处理，在载玻片上以背侧朝上方向摆放，使用正置显微镜在明场照明下观察。
    注意：为获得肾间组织形态的高分辨率图像，建议对3β-Hsd活性染色并去卵黄的胚胎进行平铺制片分析。由于肾间类固醇生成组织位于卵黄囊正上方，对肾间组织进行腹侧平铺分析可直接且清晰地观察其形态结构17。

3. 3β-Hsd 活性染色胚胎的免疫组化分析

注意：为了分析类固醇生成组织的血管微环境，需对携带转基因内皮特异性荧光报告基因且经3β-Hsd活性染色的胚胎进行横断面振动切片，随后进行免疫组织化学分析12,18。

  1. 后固定
    1. 用含1% Triton X-100的2% PFA在4 °C下对经3β-Hsd活性染色并洗涤后的胚胎进行后固定，持续1小时，随后在含1% Triton X-100的PBS（PBSTx）中于室温下洗涤4次，每次10分钟。
  2. 包埋
    1. 将琼脂糖溶于 PBS 中，配制成 4% 低熔点琼脂糖溶液，于 95 °C 溶解后分装至微量离心管中，4–8 °C 保存。
    2. 将4%低熔点琼脂糖 aliquot 在70 °C下融化10分钟，随后保持在47 °C。将每个胚胎包埋于1.5 ml 微离心管盖（作为模具）中的熔融4%低熔点琼脂糖中，冷却至凝固。
  3. 振动切片机切片
    1. 将一条纸胶带粘贴到振动切片机的干燥平台上。
    2. 用剃刀从模具中取出凝固的琼脂糖块。在平台的纸胶带上涂抹超级胶水，将琼脂糖块固定在纸胶带上，使样品的腹侧朝上。将琼脂糖块修整成梯形棱柱状，上表面和下表面的边长分别约为 4 mm 和 8 mm。
    3. 使用移液管，用含0.5% Triton X-100的冷PBS（0.5% PBSTx）冲洗含有样品的琼脂糖块。
    4. 根据振动切片机的说明书，将琼脂糖块切成100 µm的切片。持续冲洗琼脂糖块以防止干燥。每切出一片，即用26 G注射器针头将其从振动切片机上取下，并转移至含有冷的0.5% PBSTx（500 µl/孔）的斑点板中。
    5. 在解剖显微镜下检查并收集3β-Hsd活性阳性的组织切片，使用末端剪去一段的移液枪头（开口处内径约1 mm）将切片转移至含有冷的0.5% PBSTx（每孔150 µl）的96孔板中。通常在此步骤后，组织样本会从琼脂糖块上解离下来。
  4. 透化与洗涤
    1. 用0.5% PBSTx在室温下洗涤切片6次，每次15分钟，然后在PBS中洗涤10分钟，再用添加1%牛血清白蛋白/1% DMSO/0.1% Triton X-100的PBS（PBDTx）洗涤4次，每次10分钟。
  5. 封闭
    1. 在室温下，将切片置于含2%胎牛血清（FCS）的PBDTx溶液中孵育1小时。
  6. 一抗反应
    1. 将切片在含有初级抗体的 PBDTx 中孵育 1.5 天例如，兔多克隆抗人纤连蛋白抗体和鼠抗人黏着斑激酶抗体）于4 °C孵育。
  7. 洗涤
    1. 在室温下用 PBDTx 溶液洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤 6 次。
  8. 封闭
    1. 在室温下，将切片置于含2% FCS的PBDTx中孵育1小时。
  9. 二抗反应
    1. 在4 °C下，将切片在含有二抗（荧光素偶联的山羊抗兔或抗小鼠IgG）的PBDTx中孵育1.5天。
  10. 洗涤
    1. 用PBDTx在室温下洗涤切片6次，每次10分钟，再用PBST在室温下洗涤4次，每次10分钟。
      注意：进行共聚焦显微镜分析时，用 PBS 配制的 50% 甘油对样品进行透明处理。

4. 共聚焦分析

  1. 使用配备10X/0.5和20X/0.75物镜的共聚焦显微镜观察整体胚胎样本及切片。
  2. 为同时检测荧光信号与3β-Hsd染色，设置多通道模式如下：采用488 nm氩激光和505-530 nm带通滤光片检测GFP；采用543 nm氦氖激光和560-615 nm带通滤光片检测mCherry；使用透射光通道检测3β-Hsd染色。针孔大小设为1 Airey单位，分辨率为1,024 x 1,024像素。
  3. 利用共聚焦显微镜内置软件，将Z轴堆栈图像（间隔6 μm）合并为三维投影，并将该投影与明场图像进行叠加。

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结果

为了确定类固醇生成性的间肾组织如何与前肾肾小球及其新生血管系统共同发育，对双转基因Tg(wt1b:GFP)li1;Tg(kdrl:mCherry)ci5胚胎在34小时（hpf）时进行了3β-Hsd酶活性检测（图1）。在此阶段，显示3β-Hsd酶活性的类固醇生成组织位于中线右侧，紧邻前肾肾小球的尾侧；部分类固醇生成细胞已开始跨越中线，在背侧观察时形成一个突出的边缘。该类固醇生成组织与背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）紧密关联。

对Tg(kdrl:GFP)s843胚胎进行的3β-Hsd酶活性检测可清晰显示肾间组织周围的血管结构，包括背主动脉（DA）、尾静脉（PCV）以及肾间血管（IRV；图2）。对显示3β-Hsd活性染色的胚胎进行振动切片，并通过免疫组织化学（IHC）分析检测细胞外基质蛋...

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讨论

3β-Hsd 活性的信号强度随着反应进程逐渐增强。在发育阶段为28 hpf及以后的样本中，反应进行4小时后即可检测到清晰的3β-Hsd活性信号。然而，反应时长需根据实验目的通过经验确定。在需要过夜染色的情况下，样本通常会出现轻微的蓝灰色背景。该问题可通过在进行3β-Hsd活性染色前延长固定时间（例如，在室温下用4% PFAT固定4小时）来克服。相反，过度固定（如在室温下用4% PFAT固定过夜）会导致背景极为清晰，但需要更长时间才能获得理想的信号强度。我们注意到，在进行3β-Hsd活性染色前，使用2%而非4% PFAT对样本进行过夜固定，通常可在后续的荧光报告基因观察或免疫组化（IHC）分析中获得更理想的结果。然而，使用4% PFAT固定胚胎可实现对3β-Hsd活性的快速检测（可在1天内完成），因此更适用于针对间肾类固醇生成组织的遗传学或化学筛选实验。

在3β-Hsd活性染色后对胚胎进行后固定至关重要，因为即使经过充分洗涤，染色样品中仍可能残留微量化学成分，长期储存后会导致背景信号升高。然而，如果3β-Hsd活性染色的胚胎需进一步进行免疫组化（IHC）分析，则将已...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

我们感谢Christoph Englert教授和Didier Stainier教授分别惠赠Tg(wt1b:GFP) li1和Tg(kdrl:EGFP)s843 品系，感谢中国台湾斑马鱼核心设施提供Tg(kdrl:mCherry)ci5。本研究得到了中国台湾科技部资助（项目编号：96-2628-B-029-002-MY3、101-2313-B-029-001、102-2628-B-029-002-MY3、102-2321-B-400-018）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦显微镜Carl Zeiss LSM510 
DMSOSigmaD8418 
甘油USBUS16374
Hyclone 胎牛血清 GE Healthcare Life SciencesSH30073
烟酰胺SigmaN0636
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物SigmaN1636
4-硝基蓝四氮唑PromegaS380C
Nusieve GTGLonza50081
多聚甲醛SigmaP6148
苯硫脲Sigma P7629
磷酸盐缓冲液SigmaP4417-100Tab
PYREX 点板Corning7220-85
珊瑚盐AZOOAZ28001
反式-去氢表雄酮SigmaD4000
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
振动切片机LeicaVT1000M

参考文献

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