一种新型人中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞亚群的建立与鉴定 体外

摘要

本文介绍了一种获取并鉴定新近表征的中性粒细胞来源巨噬细胞亚群的方法。这些细胞由新鲜的人类血液中性粒细胞在体外培养中发育而成，具有吞噬作用、自噬能力、体积巨大以及寿命显著延长等特征。该方法对于进一步研究这一独特的中性粒细胞来源亚群至关重要。

摘要

中性粒细胞（PMN）最广为人知的功能是针对入侵病原体和微生物的吞噬作用。在白细胞中，它们的半衰期最短，在未活化的状态下会持续性地走向凋亡。当被募集到炎症部位以消除炎症时，它们会产生一系列具有强效抗菌杀伤能力的细胞毒性分子。然而，当这些强效的细胞毒性分子不受控制地释放时，可能对周围组织造成损伤。近年来，越来越多的证据表明中性粒细胞具有多功能性，展现出可塑性和免疫调节功能。我们最近鉴定出一种新的中性粒细胞来源的亚群，该亚群在标准培养条件下无需添加细胞因子或生长因子（如粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）或白细胞介素（IL）-4）即可自发形成。这些细胞通过吞噬中性粒细胞残余物显著增大体积，因此被称为巨噬细胞（Gϕ）。与中性粒细胞不同，Gϕ在体外培养中寿命较长。它们表达分化簇（CD）中性粒细胞标志物CD66b/CD63/CD15/CD11b/髓过氧化物酶（MPO）/中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），但不表达单核细胞系标志物CD14/CD16/CD163以及树突状细胞标志物CD1c/CD141。它们还能摄取乳胶颗粒和酵母聚糖，并在经调理的酵母聚糖和PMA刺激下产生氧化爆发反应。此外，Gϕ表达清道夫受体CD68/CD36，与中性粒细胞不同的是，它们能够内吞氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）。更重要的是，与新鲜中性粒细胞或培养的单核细胞不同，它们在摄取oxLDL后会增强活性氧（ROS）的产生。此外，这些吞噬细胞含有微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）包被的空泡，提示自噬被激活。使用特异性抑制剂的研究表明，吞噬作用和自噬均为其发育所必需，并且可能依赖于NADPH氧化酶产生的ROS。本文介绍了一种在体外培养中制备这种长寿、中性粒细胞来源的吞噬细胞亚群的方法，以及其鉴定手段和目前已知的特征。该实验方案对于获得并表征Gϕ，进而深入研究其生物学意义和功能至关重要。

引言

多形核中性粒细胞（PMN）是血液中数量最多的白细胞群体，通过产生多种细胞毒性分子，在抵御病原体入侵中发挥第一道防线的作用。传统观点长期以来认为，中性粒细胞是寿命短暂、在血液中循环的专业吞噬细胞，能够最先到达急性炎症部位，以对抗感染并协助清除病原体及有害颗粒。¹ 在未活化状态下，中性粒细胞会持续进入凋亡程序。当中性粒细胞从血液迁移至炎症部位时，会被激活以促进炎症的消退。它们通过产生活性氧（ROS）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和具有强效杀菌活性的组织蛋白酶等裂解酶类，吞噬并杀灭入侵的微生物。为了捕获病原体，中性粒细胞还会释放由核染色质纤维构成的胞外诱捕网（NETs），其中包含抗菌肽和多种裂解酶。然而，中性粒细胞若不受控制地释放这些细胞毒性分子，也可能持续引发炎症反应，并对周围组织造成损伤。² 因此，巨噬细胞（Mϕ）和树突状细胞（DC）有效清除凋亡的中性粒细胞，对于炎症的消退至关重要。^3,4,5,6

然而近年来，中性粒细胞是功能高度多样化的细胞这一观点日益明确，其功能远不止吞噬作用和病原体杀伤。^6,7 通过启动或活化过程，中性粒细胞的可塑性正逐渐受到关注。例如，受到细菌和分枝杆菌刺激的中性粒细胞被证实可分泌白细胞介素（IL）-10并调控炎症反应，提示存在免疫调节反应。⁸ 有丝分裂后的中性粒细胞在细胞因子和生长因子处理下，可转分化为类似巨噬细胞（Mϕ-like）或类似树突状细胞（DC-like）的细胞，并具有消化和呈递抗原片段的能力。^9,10 因此，在整合先天免疫与适应性免疫应答中发挥关键作用。^3,6 生长因子的激活促进了凋亡中性粒细胞或细胞碎片的吞噬，从而有助于清除炎症部位的碎片并促进炎症消退。^3,9 特别是当巨噬细胞/树突状细胞清除系统功能不足或超负荷时，^11,12 提示可能存在“自我调节”机制，有助于缓解炎症反应。这是因为凋亡是一种受调控的自主性细胞死亡形式，可抑制细胞毒性物质向胞外释放，从而防止对周围组织造成损伤。⁶

延长存活是中性粒细胞活化的另一特征，可通过多种宿主来源因子处理加以证明，例如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、炎症性细胞因子如干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α，以及/或病原体来源的产物，从而使得中性粒细胞能够调节其存活反应。⁶ 事实上，中性粒细胞的存活是其可塑性的前提，并与其执行吞噬作用的能力相关。^6,13 相应地，该过程还被证实与表型和功能的改变相关，这些改变依赖于基因表达的上调，通过诱导合成参与延长中性粒细胞寿命及抑制凋亡的新蛋白而实现。¹⁰

与寿命较短、在培养中会持续发生凋亡的中性粒细胞，或如上所述需依赖细胞因子/生长因子激活从而延长寿命的中性粒细胞不同，我们近期发现了一类新的、数量稀少的中性粒细胞亚群。这类细胞可在标准培养条件下，由 freshly isolated human blood neutrophils（新鲜分离的人外周血中性粒细胞）自发形成，无需外源性添加任何细胞因子或生长因子。¹⁴ 这些此前文献中未曾报道的中性粒细胞来源的细胞被命名为巨噬样吞噬细胞（giant phagocytes, Gϕ）。Gϕ在体外培养中具有较长的寿命，通常在培养5–7天后完全成熟，其特征表现为独特的形态学结构、表型表达及功能特性。Gϕ体积显著增大，这是由于其通过自噬作用吞噬了死亡中性粒细胞的残余物质所致；细胞呈现空泡化，并含有吞噬溶酶体。Gϕ表达特异性的中性粒细胞颗粒标志物——分化簇（cluster of differentiation, CD）66b，嗜天青颗粒标志物CD63和髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO），以及其他中性粒细胞标志物，如CD11b、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、CD15、NADPH氧化酶亚基gp91-phox和p22-phox，以及自噬标志物LC3BII^14,15。在功能方面，Gϕ能够主动吞噬乳胶微球和酵母聚糖（zymosan）颗粒，并在酵母聚糖或佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸盐（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）刺激下产生活性氧（ROS）。有趣的是，与新鲜中性粒细胞不同，Gϕ还强烈表达清道夫受体CD68和CD36，能够摄取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, oxLDL），并在oxLDL刺激下产生ROS。此外，Gϕ不表达单核细胞系标志物CD14、CD16和CD163，也不表达树突状细胞标志物CD1c和CD141。更重要的是，吞噬作用、自噬作用以及功能完整的NADPH氧化酶是Gϕ形成的前提条件。这是因为吞噬抑制剂细胞松弛素B（cytochalasin B）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3-MA）和巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1, BafA1），以及NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘𬭩（diphenylene iodonium, DPI）均能阻断Gϕ的生成。此外，单核细胞/中性粒细胞共培养体系以及间歇性缺氧环境也会抑制Gϕ的发育，而中性粒细胞对持续性缺氧的适应则有利于其形成^14,15。Gϕ在体外培养中的发育过程如图1所示。本文所述实验方案详细描述了从新鲜分离的人外周血中性粒细胞制备Gϕ的步骤，包括其发育、鉴定及部分基本特性的检测方法。该方案可用于进一步研究这些新发现且具有重要意义的中性粒细胞来源Gϕ的广泛功能及其生物学作用，以明确其潜在功能与生物学价值。

图1： 7天中性粒细胞培养中巨细胞发育的示意图 建议在炎症部位（1) 中性粒细胞发生凋亡性细胞死亡，且（2释放包含细胞核碎片、颗粒（绿色和红色点状物）及其他亚细胞成分的膜包被片段，从而触发自噬机制。3巨噬样吞噬细胞（Gϕ）可在无细胞因子或生长因子的长期中性粒细胞培养体系中形成，其通过吞噬凋亡小体及中性粒细胞碎片而发育，并保持功能性NADPH氧化酶活性。Gϕ表达多种中性粒细胞标志物，包括CD66b+/CD63+/MPO+/CD15+/CD11b+/NE，具有包裹颗粒和细胞碎片的大吞噬体，并表达清道夫受体CD36与CD68。Gϕ多为单核细胞，能够吞噬多种颗粒及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），并产生活性氧（ROS）。填充Gϕ的空泡膜上含有LC3B（深蓝色标记），为自噬体膜的标志物，提示自噬过程与巨噬样吞噬细胞形成之间存在密切关联。在含有GM-CSF/IL-4的培养基中，Gϕ无法形成。此外，多种抑制剂可阻断其生成，包括NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘𬭩（DPI）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和巴佛洛霉素（BafA1），以及吞噬作用抑制剂细胞松弛素B（Cyto. B）。4) 潜在的 Gϕ 函数 体内 可能具有抗炎或促炎特性，并参与动脉粥样硬化过程（此图基于我们的研究结果）^14,15 并根据随附的贝尔顿社论进行了修改²⁰). 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

该方案已根据《赫尔辛基宣言》获得当地人权委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书。

1. 中性粒细胞的分离及体外培养中粒细胞的发育

注意：所有步骤均须在生物安全超净工作台内，使用无菌组织级无脂多糖（LPS）溶液进行操作。请勿向罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基中添加抗生素、细胞因子或生长因子。

1. 从年轻健康成人处使用无菌头皮静脉采血套装采集至少 40 ml 静脉血。将血液抽入含有乙二胺四乙酸 K 的真空采血管中₃ 盐（K₃EDTA）并轻轻混匀。将血液置于室温下保存。
2. 使用密度分别为1.119 g/ml和1.077 g/ml的多蔗糖溶液，通过两步不连续密度梯度离心法分离中性粒细胞。使用前将溶液恢复至室温。
   注意：离心过程中，红细胞（RBCs）因多蔗糖聚合物的作用而聚集，并迅速沉降。单个核细胞（单核细胞/淋巴细胞）位于上层血浆与多蔗糖溶液-1,077 的界面处，而中性粒细胞则位于红细胞层上方，处于多蔗糖溶液-1,077 与 1,119 的界面处（参见 图2该方法可从同一个体中同时分离单个核细胞和中性粒细胞。

图2：从人全血中分离中性粒细胞。 将密度为1.077 g/ml的聚蔗糖小心地叠加在密度为1.119 g/ml的聚蔗糖之上，形成不连续梯度。然后将稀释后的全血叠加在1.077 g/ml聚蔗糖上方。立即将离心管在室温下以700 × g离心30分钟，不启用刹车。可见三个明显条带：(A) 单个核细胞，(B) 多形核细胞（PMN），以及(C) 位于管底的红细胞（RBC）。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 向一个50 ml无菌聚丙烯圆锥形离心管底部加入12 ml聚蔗糖-1119。
2. 小心地将12 ml的聚蔗糖-1077液层加在聚蔗糖-1119液层之上。
3. 将10–12 ml全血用含2%热灭活胎牛血清（HI-FCS）的无离子磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终体积24 ml。将24 ml稀释后的全血小心地铺加到离心管上层梯度液上方。
4. 在室温（20 - 24 °C）下以 700 x g 离心 30 分钟，不使用刹车。
   注意：较低温度下离心可能导致细胞结块和回收率降低。
5. 小心地从离心机中取出试管，避免扰动密度梯度。应观察到两个不透明的层（A：单个核细胞和B：中性粒细胞，如图所示） 图2).
6. 吸弃层A上方0.5 cm处的液体。将此层的细胞转移（或弃去）至标记为“单个核”的试管中。
7. 吸弃并移除B层上方0.5 cm处的剩余液体。将该层中的细胞转移至标记为“PMN”的离心管中。
8. 合并每两根梯度管中的PMN，用含2% HI-FCS的PBS洗涤至终体积30 ml。200 × g离心12分钟，弃去上清液。
9. 为去除污染的红细胞（RBC），在冰上用1 ml无菌移液枪头轻轻吹打重悬沉淀，同时加入3 ml冰冷的0.2%低渗无菌NaCl溶液，继续冰浴30秒。
10. 30秒后，向管中加入3 ml无菌的冰冻1.6% NaCl溶液，恢复等渗状态。
11. 向6 ml等渗盐水中加入6 ml预热（37 °C）的含2% HI-FCS的RPMI-1640培养基，于250 × g离心12分钟。弃去上清液。中性粒细胞沉淀应无红细胞污染。
    注意：若被红细胞污染，中性粒细胞沉淀呈红色。
12. 如果仍有部分污染的红细胞残留，请重复步骤9和10一次。
13. 将细胞沉淀重悬于4 ml RPMI-1640培养基中，该培养基需添加10%热灭活胎牛血清，使用台盼蓝排斥法计数细胞，以确定细胞浓度和活力。
14. 将浓度调整至 1.25 - 1.5 x 10⁶ PMN/ml（根据实验需求），每孔接种1.0 mL至24孔板中。
    注意：通过瑞氏-吉姆萨染色和光学显微镜评估，粒细胞群体中中性粒细胞的纯度始终超过95%。
15. 接种后，将细胞置于 加湿的5% CO₂ 37 °C 培养箱
16. 每3天更换一次培养基，轻轻吸出一半培养基，加入等体积的新鲜RPMI-1640培养基，其中添加10% HI-FCS。使用无LPS的溶液和化合物，并确保HI-FCS中的LPS水平较低（≤0.05 ng/ml）。
    注意：轻柔更换培养基至关重要，因为培养过程中形成的Gϕ并未牢固贴附于培养皿上，剧烈洗涤可能导致正在发育的细胞被冲走。Gϕ的出现通常在PMN培养后3至4天可见，具体时间取决于血液供体。本文所述的大多数分析和检测均在培养第6至7天进行，此时Gϕ体积显著增大。需注意，在RPMI-1640培养基中添加1–10 ng/ml LPS对Gϕ在培养过程中的发育无影响。¹⁴

2. 共聚焦激光扫描显微镜

1. 从新分离的中性粒细胞以及第7天发育的Gϕ培养物（按第1节所述方法制备）制备细胞离心涂片¹⁶。
   注意：为在培养皿中提高Gϕ的浓度以进行各种分析，轻柔地移除一半培养基。在光学显微镜下检查培养基，确保移除的培养基中无Gϕ。然后，剧烈吹打剩余培养基以去除轻微贴壁的Gϕ。将培养基在200 × g下离心10分钟，并将沉淀重悬于100–120 µl培养基中。
   1. 每张载玻片使用含细胞的100–120 µl培养基。为每种处理制备重复或三重复载玻片。在84 × g下离心7分钟。
2. 将离心后的细胞干燥，并在室温下用4%多聚甲醛在通风橱中固定10分钟。用PBS洗涤3次（每次约100 µl，每次数秒）。如需进行细胞内染色，用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下通透细胞10分钟，并用PBS洗涤5次。
   注意：在所有步骤中，使用适量的缓冲液/溶液以覆盖载玻片上细胞的边缘。使用疏水屏障笔标记细胞区域。
   注意：多聚甲醛具有毒性，避免接触皮肤和眼睛。请佩戴适当的个人防护装备。
3. 用含10%正常山羊血清的RPMI-1640培养基封闭细胞，4 ºC过夜或室温孵育40分钟。用PBS洗涤。
4. 加入单一抗体（Ab）或小鼠与兔源一抗的组合（Ab），稀释比例为1:100（约100 µl）。4 °C孵育过夜（18–20小时）。
   注意：此处使用的小鼠单克隆抗体包括：抗CD14、抗CD63、抗CD66b、抗CD1c、抗CD15以及抗细胞色素b-245轻链（p22-phox鉴定）。兔多克隆抗体包括：抗CD68、抗CD36、抗LC3B、抗髓过氧化物酶、抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）以及抗Nox2/gp91-phox抗体。同型对照包括纯化的小鼠IgG1和IgG2，以及兔IgG。根据制造商说明书配制抗体，并使用适量（约100 µl）覆盖细胞边缘区域。
5. 洗涤细胞后，加入1/400稀释的二抗Cy2-CF（488A）标记的山羊抗兔IgG（绿色）和/或Cy5（CF 647）标记的山羊抗小鼠IgG（红色），室温孵育40分钟。
   注意：根据制造商说明书稀释和配制抗体。
6. 洗涤后，每张载玻片滴加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂用于细胞核染色，立即加盖盖玻片。
7. 使用共聚焦激光扫描系统结合荧光显微镜和Plan Apo 40X浸油物镜分析载玻片。在载玻片制备后30分钟至2小时内完成分析，或在4 °C下保存过夜。
   1. 使用成像软件（例如 Image J）计算细胞面积和荧光强度。对于共定位分析，使用Manders重叠系数（MOC）¹⁷进行软件定量。
      注意：仅MOC >0.6的细胞可视为具有显著共定位的细胞。

3. 中性粒细胞跨内皮细胞迁移：IL-8对巨大吞噬细胞（Gϕ）形成的影响

注意：细胞跨膜迁移实验应使用24孔细胞培养小室。

1. 在插入物的上室中加入150 µl浓度为50 µg/ml的纤维连接蛋白，室温孵育30分钟。
2. 在上室中加入5 × 10⁴个EA.hy926内皮细胞/孔，重悬于150 µl配制好的杜尔贝科改良伊格尔培养基（完全生长培养基）中。
   注意：使用前应确保内皮细胞单层已完全融合。
3. 向下室中加入700 µL完全生长培养基。
4. 将可渗透的细胞培养插入物放入多孔培养板中，在37 °C、5% CO₂条件下培养EA.hy926内皮细胞2天。
   注意：同时，在第2天平行准备新鲜的中性粒细胞（PMN）（见第1节描述）。
5. 培养2天后，更换插入物上室和下室中的培养基。
   1. 向下室中加入含10%灭活人胎牛血清（IH-FCS）和白细胞介素（IL）-8的RPMI-1640培养基，IL-8终浓度为50 nM/ml。对照组下室中不添加IL-8。
   2. 向上室中每孔加入10⁶个新鲜PMN，重悬于100 µl含10% IH-FCS的RPMI-1640培养基中。
6. 将多孔培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育90分钟。
7. 孵育90分钟后，分别收集上室和下室中的细胞，并对各亚群进行计数。以所加总细胞数为基准，计算各室中细胞所占百分比。
   注意：用移液器轻柔吸出上室细胞，避免刮下内皮细胞，并转移至无菌离心管中。通过移液并用500 µl培养基冲洗下室的方式收集下室细胞，转移至第二个无菌离心管中。
8. 合并多个孔中迁移通过（下室）和未迁移（上室）的PMN组分，每组取10⁶个细胞，按照第1节中步骤14–16所述条件，在无生长因子存在下继续培养7天。
9. 将细胞离心涂片至载玻片上¹⁶，并按照第2节所述方法，通过共聚焦显微镜分析各培养条件下所形成的细胞。

结果

中性粒细胞自噬作用及在培养中的发育

中性粒细胞自噬及其在培养7天内发育为Gϕ的过程如图3和图4所示。培养第4至第7天时，细胞体积显著增大，¹⁵ 自噬现象在中性粒细胞与荧光膜染料（PKH-26，红色；PKH-67，绿色）共培养后90分钟内即已明显可见¹⁴。作为该中性粒细胞亚群的对照，部分中性粒细胞培养物还接受了GM-CSF/IL-4处理。如先前报道^18,19，经细胞因子处理的细胞在培养7至14天内体积增大，但其体积仍小于Gϕ，且具有类似树突状细胞（DC样）的胞质突起（图5），这与Oehler et al.¹⁹此前报道一致。此外，经GM-CSF/IL-4处理的细胞CD66b表达为阴性或低表达¹⁵，进一步明确显示出其在形态学上以及潜在功能上的差异。

图3： 体外培养中巨型吞噬细胞（Gϕ）发育过程中的自噬作用。 新鲜分离的纯化中性粒细胞在零时用PKH-67（绿色）或PKH-26（红色）膜荧光染料标记，随后共培养并持续观察达七天。细胞被离心至玻片上，细胞核用DAPI染色，样本通过共聚焦显微镜进行分析。共培养90分钟后即可明显观察到自噬现象。在发育中的Gϕ中，红色与绿色信号合并形成黄色和橙色的现象清晰可见。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4： 体外培养中巨大吞噬细胞（Gϕ）的发育过程。 对 freshly isolated purified neutrophils 进行长达 7 天的体外培养观察。在指定时间点将细胞离心至玻片上，采用 May Grunewald-Giemsa 染色，并通过明场显微镜进行分析。图中同时展示一名嗜酸性粒细胞较少的个体作为对照。请注意，嗜酸性粒细胞在培养过程中大小保持不变。放大倍数为 100X 油镜。 请点击此处查看该图的高清版本。

图5： 体外培养中巨噬细胞样吞噬细胞（Gϕ）与经GM-CSF/IL-4处理的中性粒细胞发育的比较。 （A）经May-Grunwald-Giemsa染色的中性粒细胞，在无细胞因子（Gϕ）或含GM-CSF/IL-4的培养基中培养7天。样本通过明场显微镜进行分析。放大倍数为40倍。在添加了GM-CSF/IL-4的培养基中发育的细胞表现出广泛的胞质突起，但体积小于Gϕ细胞。（B）新鲜分离的中性粒细胞用PKH-26（红色）染料标记后，在无细胞因子的培养基中培养7天；或用PKH-67（绿色）染料标记后，在添加GM-CSF/IL-4的培养基中培养7天。随后，将两种条件下发育的细胞按1:1比例混合，并共培养2小时。细胞经固定后通过共聚焦显微镜分析。本图经参考文献修改。¹⁵ 请点击此处查看该图的放大版本。

为了进一步研究Gϕ的发育过程，还通过延时显微镜观察了其形态学变化。视频1（第3天至第4天）和视频2（第4天至第5天）展示了在纯化的中性粒细胞培养物中Gϕ的发育过程。这些Gϕ为非贴壁或轻微贴壁细胞，运动能力有限，能够主动吞噬周围的中性粒细胞残余物和碎片。在视频3中，在混合的单核细胞/中性粒细胞培养物中比较了单核细胞来源的Mϕ与Gϕ的运动情况。Mϕ表现出活跃的爬行运动（左侧，未标记细胞）；而Gϕ（右侧）则是明亮的PKH-26标记细胞。

视频-1：通过延时显微镜显示纯化中性粒细胞培养物在第3至第4天巨噬细胞的形成过程。通过延时显微镜对中性粒细胞在培养第3天至第4天的过程进行了连续观察。延时显微镜系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机以及载物台式培养箱组成。延时图像采集间隔为每10分钟一次。原始发表于参考文献¹⁴ 请点击此处查看该视频。

视频-2：通过延时显微镜显示在第4至第5天纯化的PMN培养物中巨噬细胞的发育过程。 通过延时显微镜对中性粒细胞在培养第4天至第5天的过程进行了追踪观察。延时显微镜系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机以及载物台培养箱组成。延时图像每10分钟采集一次。请点击此处观看该视频。

视频-3：共培养中形成的巨大吞噬细胞与巨噬细胞。 通过延时显微镜对单核细胞/中性粒细胞共培养体系从第4天至第5天进行连续观察。左侧为单核细胞来源的巨噬细胞；右侧为明亮（PKH-26染色）的中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞。该延时显微视频系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机以及载物台培养箱组成。延时图像采集间隔为每10分钟一次。原始发表于参考文献¹⁴ 请点击此处查看该视频。

巨大吞噬细胞中标志物的表达

通过检测以下中性粒细胞标志物 CD66b/CD63/MPO/NE/CD15 的阳性表达，证实了 Gϕ 的中性粒细胞来源（图6）。Gϕ 还表达 NADPH 氧化酶、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）清道夫受体 CD68 和 CD36，并含有 LC3B 包被的空泡和聚集体（通过 Western 印迹鉴定为 LC3BII¹⁵），表明存在自噬标志物。然而，Gϕ 对单核细胞系标志物（CD14、CD16 和 CD163）以及树突状细胞标志物（CD1c 和 CD141）呈阴性，提示 Gϕ 并非来源于污染的单核细胞。

图6： 培养7天后巨噬细胞（Gϕ）中中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞多种标志物的表达。 巨噬细胞呈阳性表达中性粒细胞特异性颗粒标志物CD66b、嗜天青颗粒标志物CD63和MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶以及CD15；对树突状细胞标志物CD1c和CD141，以及单核细胞系标志物CD14、CD16和CD163呈阴性表达。此外，巨噬细胞还表达自噬标志物LC3B、清道夫受体CD68和CD36，以及NADPH氧化酶亚基gp91-phox/p22-phox。细胞核经DAPI染色，样本通过共聚焦显微镜进行分析。本图已根据参考文献修改。^14,15 请点击此处查看此图的放大版本。

Gϕ 的功能——NADPH 氧化酶激活、活性氧产生和吞噬作用：

Gϕ细胞对乳胶微球和调理过的酵母聚糖表现出明显的吞噬作用。Gϕ细胞还产生基础水平的活性氧（ROS）（图7A），并在酵母聚糖和PMA刺激下发生氧化爆发反应（图7B-D）。然而，与单核细胞或中性粒细胞不同，Gϕ在oxLDL刺激下也能产生ROS，并可被油红O染色（图7B, F）。值得注意的是，使用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理新鲜中性粒细胞不仅抑制了ROS的产生，还阻止了Gϕ在培养过程中的形成，提示ROS信号通路对Gϕ的形成至关重要。^14,15

图7： 巨型吞噬细胞（Gϕ）的氧化爆发、吞噬作用及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）摄取。 （A）Gϕ溶酶体中可见基础活性氧（ROS）的产生。（B）Gϕ在氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）、佛波酯（PMA）和酵母聚糖（zymosan）刺激下的ROS生成（酵母聚糖颗粒清晰可见）。（C）Gϕ的氮蓝四唑（NBT）试验，显示在无PMA和有PMA刺激下的呼吸爆发活性（切片未染色，但插图为May-Grünwald-Giemsa染色）。（D）经PMA及PMA/DPI（DPI抑制NADPH氧化酶从而抑制ROS）处理的Gϕ进行NBT试验并用May-Grünwald-Giemsa染色。（E）PKH-26（红色）标记的细胞对乳胶颗粒及IgG包被的酵母聚糖的吞噬作用。（F）未经处理与经oxLDL处理的Gϕ的油红O染色。本图已根据参考文献修改。^14,15 请点击此处查看此图的放大版本。

中性粒细胞跨内皮细胞迁移

为了鉴定可能分化为Gϕ的中性粒细胞亚群，检测了中性粒细胞穿过内皮细胞单层的迁移能力（图8A）。90分钟后，有62.3 ± 12.2%的中性粒细胞迁移穿过内皮细胞，向下方隔室中的IL-8移动。值得注意的是，表达CD66b/CD15/LC3B的Gϕ仅来源于已迁移的中性粒细胞群体，而由未迁移的中性粒细胞群体发育而来的细胞体积较小，且不表达中性粒细胞标志物CD66b/CD15（图8B、8C）。

图8： IL-8依赖性中性粒细胞（PMN）穿过内皮细胞对巨噬细胞（Gϕ）形成的影响。 （A）示意图展示中性粒细胞穿过内皮细胞单层（ECs）向IL-8迁移的跨膜迁移实验。该实验可作为中性粒细胞募集至急性炎症部位的模型。（B–C）在细胞迁移实验中（见方案3），将已迁移（B）和未迁移（C）的中性粒细胞组分在无生长因子条件下培养七天（同方案1）。随后，细胞被离心涂片至载玻片，并通过共聚焦显微镜进行分析。固定后的细胞使用CD66b（红色）、LC3B（绿色）和CD15（红色）染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

巨大吞噬细胞（Gϕ）是一类新定义的来源于中性粒细胞的细胞亚群，表达CD66b/CD15/CD63/MPO/NE等基本且特异的中性粒细胞标志物。这类来源于中性粒细胞的吞噬细胞此前在文献中尚未被描述。与寿命较短并发生凋亡的中性粒细胞不同，Gϕ呈Annexin-V阴性，并具有较长的生命周期。然而，与中性粒细胞相似的是，Gϕ也能内吞颗粒物质，并在颗粒刺激或PMA刺激下产生活性氧（ROS），该过程依赖于NADPH氧化酶。但Gϕ内吞氧化型低密度脂蛋白（OxLDL）并随之产生ROS的能力，是其独有的特征¹⁴。

已发现多种因素会影响它们在培养过程中的发育。培养基中缺乏外源性细胞因子或生长因子至关重要（特别是GM-CSF/IL-4）。然而，中性粒细胞向IL-8的迁移能力被证明是区分能否发育为Gϕ细胞的关键因素。此外，吞噬凋亡中性粒细胞来源的碎片、自噬相关蛋白（LC3B）的表达以及功能性NADPH氧化酶的存在，均被证实对其发育至关重要，因为抑制这些过程会阻止Gϕ细胞的形成。图1）。显然，这些由中性粒细胞形成的巨细胞的发育过程不同于单核细胞/巨噬细胞系巨细胞形成的特征。后者与多种慢性炎症性疾病相关的多核巨细胞形成。,^20,21 而本文所述的嗜中性Gϕ通过自噬作用发育，吞噬细胞残余物，并在整个发育过程中主要保持单核状态。¹⁴ （然而极少数情况下，有时可观察到第二个细胞核）。此外，多项对照实验验证了其嗜中性粒细胞来源：（1）表达特异性嗜中性粒细胞标志物，且不表达树突状细胞和单核细胞谱系标志物；（2）在单核细胞/中性粒细胞共培养体系中其发育受到抑制；（3）在培养中其运动模式与巨噬细胞不同（通过活细胞成像和延时显微镜观察证实）。¹⁴ (4) 它们对塑料培养皿的轻度贴壁性，以及 (5) 它们起源于纯CD15⁺/CD14^- 通过流式细胞术获取中性粒细胞。

一些已鉴定的功能 体外 可能为我们揭示其潜在功能提供线索 体内例如，Gϕ 消耗大量中性粒细胞颗粒和碎片的能力、大空泡的存在，以及 LC3B 的表达——一种自噬相关蛋白，可通过与天然免疫信号通路的调节性相互作用来减轻炎症反应，²² - 均支持其具有清除能力。因此，这些发现还表明，Gϕ 可能在单核吞噬细胞/树突状细胞（Mϕ/DC）系统功能不足或不堪重负的炎症部位发挥作用，从而促进炎症的消退。这一观点可能得到以下事实的支持：在单核细胞与中性粒细胞的混合培养体系中，Gϕ 的发育受到抑制。¹⁴ 此外，由于Gϕ表达oxLDL清道夫受体（CD36、CD68），可内化oxLDL并对其产生ROS，这可能表明其参与动脉粥样硬化过程以缓解炎症。由于Gϕ仅由向IL-8迁移的中性粒细胞发育而来，而中性粒细胞向IL-8方向穿越内皮单层的跨膜迁移代表了中性粒细胞向急性炎症部位的募集，该发现也可能支持Gϕ具有抗炎功能。相反，Gϕ在某些炎症条件下的表现可能使其释放颗粒成分和ROS，从而促进持续性炎症和组织损伤。²⁰ 然而，总体而言，它们的自噬能力表明，Gϕ可能参与减弱炎症反应，而非持续促进炎症反应。

有趣的是，我们最近在人类动脉粥样硬化斑块中鉴定出了Gϕ的存在（正在准备中）。然而，仍有大量问题有待阐明。例如，Gϕ是促炎性还是抗炎性的？决定其形成与功能的因素有哪些？ 体外 或 体内? 哪一类特定的中性粒细胞亚群是促进其发育为Gϕ的前体细胞？它们是否与某些病理状态相关，具体是哪些？这些问题共同引发了关于其来源及潜在功能的深入思考。

然而，应牢记方案中的关键步骤和潜在陷阱。方案中的一个关键步骤是 Gϕ的发育是将纯化的中性粒细胞培养在不含细胞因子、生长因子或抗生素的培养基中。另一个关键步骤是排除Gϕ由污染的单核细胞发育而来，并确认Gϕ的中性粒细胞来源。因此，在通过不连续密度梯度法分离血液后，中性粒细胞进一步通过流式细胞术进行额外的纯化步骤，利用粒细胞门控及CD15进行分选。⁺/CD14^- 标记物。通过流式细胞术分离进一步纯化中性粒细胞后获得的发育中Gϕ与未经此纯化步骤的样本相比并无差异。因此，由于流式细胞术步骤会导致额外的细胞损失，大多数实验均未进行该纯化步骤。值得注意的是，在极少数情况下，培养物中可见少量嗜酸性粒细胞，其大小在培养期间保持不变。还应指出，尽管存在多种从人血液中分离中性粒细胞的方法，但本研究仅采用了此处描述的方法，因此无法比较其他中性粒细胞分离方法对Gϕ发育的影响。

研究Gϕ时的一个主要障碍在于无法获得足够数量且纯度适合多种生物化学检测的Gϕ细胞群体。在我们实验所采用的条件下，这基本上是不可能实现的。首先，Gϕ的产量很低。从接种的1.0 × 10⁶个PMN细胞出发，经过七天培养后，仅能生成约100至200个Gϕ，具体数量取决于供血者。其次，目前尚难以将培养皿中已形成的Gϕ与残留的中性粒细胞碎片有效分离。这些限制使得通过生物化学或分子生物学方法对细胞进行分析在实际操作中几乎不可行。因此，本实验方案的重点是通过光学显微镜和共聚焦显微镜来描述Gϕ的鉴定及其功能。此外，还通过活细胞成像和延时显微技术观察了中性粒细胞在培养过程中形态学上向Gϕ转化的过程¹⁴。显然，若要应用生物化学或分子生物学方法，并克服产量低以及从培养皿中将存活Gϕ与中性粒细胞碎片分离的问题，可能需要更大体积的血液样本。

总之，我们最近首次描述了在培养条件下Gϕ的发育过程，Gϕ是一类源自中性粒细胞的长寿命吞噬细胞亚群。因此，目前唯一可用于在体外培养获得Gϕ的方法即为此法，尽管上述两个主要局限性仍有待克服（培养所得Gϕ产量较低，以及无法将发育成熟的Gϕ与培养皿中的中性粒细胞碎片分离）。尽管如此，本实验方案中所展示的Gϕ制备与鉴定方法，对于关注炎症反应以及中性粒细胞生物学特性与可塑性的科研人员而言至关重要，有助于进一步探究Gϕ的潜在意义及其功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌头皮静脉输液器（21G×3/4）	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	用于静脉穿刺的无菌针头
VACUETTE HOLDEX 一次性持针器 PP	Greiner Bio-One	# 450263	用于固定静脉穿刺时的部位
VACUETTE 管 K3E K3EDTA（16 x 100/9 mL）	Greiner Bio-One	# 455036	用于血液采集的无菌管
Nunclon 多孔培养皿（24 孔 × 1 ml）	赛默飞世尔科技	# 142475
聚丙烯锥形离心管（50 ml）	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 孔（跨膜迁移实验）	康宁	# CA-3415	聚碳酸酯膜，6.5 mm 直径，3 μ微米级孔隙
RPMI-1640 培养基	生物产业	# 01-100-1A	不要添加抗生素
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	生物产业	# CRL-2922
ATCC 配制的杜尔贝科培养基’s  改良型伊格尔培养基’s 培养基	生物产业	# 302002	完全培养基
聚蔗糖-淋巴细胞分离液1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	组织培养级
聚蔗糖-淋巴细胞分离液1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	组织培养级
磷酸盐缓冲盐水（PBS）— 无离子	生物产业	# 02-023-1A	细胞生物学和分子生物学级别
热灭活胎牛血清（HI-FCS）	生物产业	# 04-121-1B	细胞生物学级或组织培养级，低内毒素
NaCl	Sigma	# S3014	分子生物学级别，适用于细胞培养
多聚甲醛，16%	电子显微镜科学公司	# 15710	细胞生物学级或组织培养级（仅含16% PFA）
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	分子生物学级
正常山羊血清	生物产业	# 04-009-1	细胞生物学和分子生物学级别
台盼蓝	生物产业	# 031021B	组织培养级
梅-格雷夫斯病ünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	细胞生物学级别-（操作编号 GS-10）
吉姆萨染色试剂盒	Sigma	# 48900	细胞生物学级别－（程序编号 GS-10）
纤连蛋白	生物产业	# 03090105
人白细胞介素-8（CXCL8）	PeproTech	# 200-08-5
抗CD14（克隆5A3B11B5）	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	小鼠IgG2b；由  单核细胞
抗CD63（克隆号 MX-49.129.5）	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	小鼠 IgG1；由中性粒细胞表达
抗CD66b（克隆80H3）	AbD Serotec	# MCA216	小鼠IgG1；由中性粒细胞表达
抗CD1c（BDCA-1）（克隆AD5-8E7）	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	小鼠IgG2a；由  树突状细胞
抗CD15（克隆MY-1）	Abcam	# ab754	小鼠IgM；由中性粒细胞表达
抗细胞色素 b-245 轻链（p22-phox）（克隆 44.1）	BioLegend	# 650001	小鼠 IgG2a；用于识别中性粒细胞 NADPH 氧化酶复合物
抗CD68	蛋白质技术	# 16192-1-AP	兔IgG；用于识别氧化型低密度脂蛋白清道夫受体
抗LC3B	Sigma	# L7543	兔IgG
抗髓过氧化物酶	Abcam	# ab45977	兔IgG
抗中性粒细胞弹性蛋白酶	Calbiochem	# 481001	兔IgG
抗NOX2（gp91-phox）	Abcam	# ab131083	兔IgG
抗CD36（SR-B3）	Novus Biologicals	# NB400-144	兔IgG
纯化的鼠IgG1 κ 同型对照（克隆 MG1-45）	BioLegend	# 401401	用作同型对照的抗体
纯化的鼠IgG2a κ 同型对照（克隆 MOPC-173）	BioLegend	# 400263	用作同型对照的抗体
正常兔 IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	用作同型对照的抗体
CF488A 山羊抗兔 IgG（H+L）	Biotium	# 20012	带有绿色荧光染料 CF488A 的抗兔 IgG
CF647 山羊抗兔 IgG（H+L）	Biotium	# 20043	带有红色荧光染料 CF647 的抗兔 IgG
CF488A 山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Biotium	# 20010	抗小鼠 IgG（绿色荧光染料 CF488A 标记）
CF647 山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Biotium	# 20040	带有红色荧光染料 CF647 的抗小鼠 IgG
含DAPI的荧光封片剂	Vectashield H-1000；Vector Lab Inc.	# E19-18	细胞核染色
共聚焦激光扫描显微镜（LSM 700）	卡尔·蔡司	序号 3523000380	Plan Apo 40X 浸油物镜
蔡司共聚焦激光扫描显微镜软件（ZEN 2010）	卡尔蔡司显微成像有限公司	6.0 版本	用于共定位分析
ImageJ 软件	Wayne Rasband，美国国立卫生研究院（NIH）	版本 1.49k	用于细胞的测定  区域和荧光强度
倒置显微镜（Axiovert 25）	卡尔·蔡司	序号 201060153	培养细胞的观察
离心机（Megafuge 1.0 R）	Heraeus Instruments	# D-37520	从血液中分离细胞；细胞涂片制备
倒置荧光显微镜（Zeiss Axio Observer Z.1）	卡尔·蔡司	序号 3834001470	巨噬细胞发育的演示
温度控制培养系统（Cube&&盒)	生命成像服务		显微镜温控系统
高 高分辨率数字CCD相机（AxioCam HRm）	卡尔·蔡司	编号 117090279	用于捕捉高对比度  被检细胞对象的图像数据
疏水屏障笔（Elite PAP Pen）	诊断生物系统	# K039	用于免疫荧光染色中细胞边界的界定