使用周期性二氧化碳气溶胶射流而无需氮气吹扫，可有效且快速地去除表面的生物膜。
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摘要
摘要
生物膜在许多应用中可能引发严重问题，不仅会造成经济损失，还可能带来公共卫生危害。因此，从表面清除生物膜具有重要意义。许多关于CO2气溶胶清洗的研究采用氮气吹扫，以减少清洗过程中产生的水分冷凝，从而提高生物膜的去除效率。然而，在本研究中，我们使用周期性喷射的CO2气溶胶（不使用氮气吹扫）来去除生长在抛光不锈钢表面的Pseudomonas putida生物膜。CO2气溶胶是固态与气态CO2的混合物，通过高压CO2气体经喷嘴绝热膨胀而生成。这些高速气溶胶被应用于培养24小时的生物膜。随着处理时间从16秒增加到88秒，去除效率在90.36%至98.29%之间，通过测量生物膜荧光强度来评估去除效果。我们还进行了实验，比较了使用与不使用氮气吹扫条件下的去除效率；测得的生物膜去除效率之间无显著差异（t检验，p > 0.55）。因此，该技术可在一分钟内用于清洁多种生物污染表面。
引言
生物膜是一种复杂的细菌群落结构，其中细菌细胞被自身产生的胞外聚合物基质包裹，相互连接，并受到保护以抵御外界环境。生物膜可能带来公共卫生风险并造成经济损失，因为它们可在多种表面形成，包括医用植入材料和器械、食品加工设备以及热交换器。事实上，根据美国疾病控制与预防中心的数据，人类所有细菌性感染疾病中约有65%与生物膜相关1。
通常使用高压灭菌器和含氯消毒剂等方法来灭活生物膜。然而，高压灭菌器的应用受限于无法耐受高温蒸汽或无法放入灭菌腔体的表面。消毒剂则不适用于对化学处理敏感或易于积累有毒氧化产物的表面2。此外，生物膜不仅需要被灭活，还应被彻底清除，以防止新细胞附着于表面并形成新的生物膜3。然而，基于黏性流体剪切力的方法难以有效去除生物膜，因为靠近表面处的流速几乎为零，剪切力通常无法克服微米级和亚微米级物质的黏附力。此外，已知生物膜基质可起到物理和化学屏障的作用1。
已开发出多种物理和机械方法用于去除表面的生物膜，包括超声波振动1、电流传导4、激光照射5和高压水喷射6。每种方法都有其优缺点。超声波振动和电流传导可用于控制生物膜的形成；但前者需要特定的配置，后者则需要导电表面，并且均需额外施加剪切力1, 4。激光照射适用于有限区域和坚硬表面；然而，部分活菌和死菌仍可能残留在表面5。高压水喷射能有效去除生物膜；但其高动量可能对柔软基材造成损伤6。
先前已提出使用CO2气溶胶去除生物膜的方法，该方法显示出良好的效果，在短时间内即可实现高效的去除率7-11。CO2气溶胶通过高压CO2气体经喷嘴绝热膨胀而生成，并被施加到受生物膜污染的表面。这种清洗技术利用固态CO2颗粒的动量传递以及熔融CO2液体的溶剂作用，随后借助CO2气体的空气动力剪切力实现清洁12。与相同滞止压力下的高压N2气体射流相比，CO2气溶胶射流在去除大肠杆菌（E. coli）生物膜方面更为有效7。此外，尽管传递给细菌的固态CO2动量相当高，但整个气溶胶射流作用于固体表面的总动量却显著低于水射流。因此，使用该CO2气溶胶技术可实现无损伤清洗。
在本方案中，采用周期性喷射不含氮气吹扫的CO2气溶胶，以去除抛光不锈钢表面的Pseudomonas putida生物膜。事实上，尽管已有研究通过加热板或红外灯加热以及使用干燥箱等方法来减少清洁过程中产生的水分冷凝，但许多CO2气溶胶研究仍采用氮气吹扫以提高去除效率12。下文描述了表面生物膜的形成过程及优化后的清洁程序。通过测量表面生物膜的荧光强度来评估其去除效率。
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方案
1. 生物膜形成表面的准备
- 使用机械切割器将1毫米厚的304不锈钢板切割成芯片（10 × 10 mm2）。
- 依次在丙酮、甲醇和去离子（DI）水中对芯片进行超声清洗，每种溶剂各清洗10分钟。使用耐溶剂容器（如玻璃材质）以去除有机污染物。
- 用流动的去离子水冲洗芯片3-5秒。
- 用氮气（N2）气流吹干芯片，持续3-5秒。
2. 细菌培养物的制备
- 取一管保存在 -80 °C 超低温冰箱中的 P. putida KT2440 菌种（由韩国蔚山科学技术院 Sung Kuk Lee 教授惠赠）。
- 室温下解冻约 1 分钟，待冻存液表层变为泥状后，将接种环浸入融化的液体层中。
- 用该接种环在含有 1.5% 琼脂的Luria-Bertani（LB）平板上划线接种细菌。
- 将平板置于 30 °C 培养箱中过夜培养，以促进菌落生长。
- 使用新的接种环从平板上挑取单个菌落。
- 将含有单个菌落的接种环接种至装有 10 ml LB 液体培养基的 50 ml 锥形管中。
- 将培养液置于摇床培养箱中，在 30 °C、160 rpm 条件下振荡培养 16 小时。
3. 表面生物膜的形成
- 用镊子夹取每一片准备好的芯片，浸入70%乙醇中5次，每次1-2秒，以对芯片表面进行消毒。浸入过程中需始终用镊子夹持芯片。
- 将每片芯片依次浸入灭菌去离子水和LB肉汤中，各5次，每次1-2秒，以去除残留的乙醇。
- 将这些芯片放入6孔细胞培养板中，每孔放置2片芯片，并加入5 ml LB肉汤。
- 将细菌培养液稀释，直至LB肉汤中的浓度达到8 × 108 个细胞/ml（600 nm波长处的光密度值：约0.8）。
- 向每孔中接种50 µl稀释后的细菌培养液。
- 将培养板在30 °C条件下静置培养24小时，以形成生物膜。
4. CO2 气溶胶清洗
- 将形成生物膜的芯片浸入10 mM醋酸铵缓冲液（易挥发）中5次，以去除松散附着的和浮游的细菌。
- 在生物安全柜中干燥这些芯片，使空气轻柔流动。
- 干燥后立即把芯片放置在喷射轴线上距CO2喷嘴20 mm的加载位置，并将喷射轴线倾斜至40°角。
- 使用气体压力调节器，将CO2和N2气体的驻点压力分别设定为5.3 MPa和0.7 MPa。
- 将气溶胶喷射流对准芯片中心区域，应可见包含固态CO2的白色气溶胶。使用手动控制开关，周期性地打开"开启"CO2电磁阀5秒，然后"关闭"3秒（周期：8秒）。如需使用氮气吹扫，则打开电磁阀以持续供应N2。
- 对芯片分别进行16、40和88秒的CO2气溶胶处理，处理过程中设置有或无氮气吹扫的条件；未接受处理的芯片作为阴性对照保留。
5. 去除效率分析
- 用去离子水配制 1 µM 的绿色荧光核酸染料（激发/发射波长：480/500 nm），用于对对照芯片和气溶胶处理芯片上的细菌细胞进行染色。
- 将芯片放入染色液中。
- 在 37 °C 避光条件下孵育 30 分钟。
- 孵育结束后，用流动的去离子水轻轻冲洗芯片，以去除多余的荧光染料。
- 用 N2 气流吹干芯片。
- 使用落射荧光显微镜、40 倍物镜和 CCD 相机，对每块芯片随机选取 5 个视野（321 × 240 µm2）拍摄荧光显微图像。
- 使用 ImageJ 等图像处理软件获取每张图像的荧光强度。在 ImageJ 中，进入 "Process" 菜单，使用 "Subtract Background" 功能；在 "Analyze" 菜单中的 "Set Measurements" 窗口中选择 "Integrated density"，然后在 "Analyze" 菜单中执行 "Measure" 以获得荧光强度。
- 根据以下公式计算生物膜去除效率：100% × (I 对照芯片 - I 处理芯片) / (I 对照芯片)，其中 I 为计算得到的荧光强度。
- 计算平均去除效率及其标准偏差。每组实验至少使用 4 块芯片。
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结果
使用 CO2 气溶胶从 SUS304 表面去除 P. putida 生物膜（图 1）。经过 24 小时培养后，大部分表面被生物膜覆盖。使用 CO2 气溶胶后，大部分生物膜被清除（图 2）。如预期所示，图 3 显示随着 CO2 气溶胶处理时间的增加，生物膜清除效率提高。在处理时间为 88 秒时，有氮气吹扫和无氮气吹扫条件下的清除效率分别高达 97.74% 和 98.29%。清洁实验进行时的空气温度为 23–24 °C，相对湿度为 26–50%。
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讨论
此前，我们针对CO的优化进行了研究2 气体压力、射流角度以及与固体表面的距离在CO中2 气溶胶清洁7与我们之前的研究不同，本研究在气溶胶中未包含氮气吹扫步骤。图1。此外，本实验方案采用304不锈钢，因为它是应用最广泛的不锈钢之一，广泛用于食品工业。抛光表面有利于荧光分析，因其具有均匀的焦距并可减少光散射。细菌种类 P. putida 在生物膜研究领域也常使用该方法。采用荧光强度对附着在表面的生物膜量进行定量。利用二维荧光图像对表面生物膜量进行量化。该方法可能适用于培养24小时的薄生物膜；然而，对于较厚的生物膜，应使用共聚焦三维图像。该方法操作简便，可实现细菌细胞的生物学识别。由于染料可穿透细菌膜并对核酸进行染色，不受细胞活性影响，因此绿色荧光显示所有活菌和死菌群体。此外，当细菌细胞发生重叠时，荧光强度更高（图2），如果方法仅基于细胞的覆盖面积，则这些因素将无法被考虑在内 5, 7, 8, 10.
需要注意的是...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的基础科学研究中心项目资助，该项目由未来规划与科学部、信息通信技术部资助（# 2015R1A2A2A01006446）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 304 不锈钢 | Steelni （韩国） | 抛光并切割好的样品 | |
| 超声波清洗机 | Branson （美国） | 5510E-DTH | |
| LB 培养基（Luria-Bertani） | Becton, Dickinson and Company （美国） | 244620 | 500 g |
| 琼脂 | Becton, Dickinson and Company （美国） | 214010 | 500 g |
| 6 孔培养板 | SPL Life Sciences （韩国） | 32006 | |
| 乙酸铵缓冲液 | Sigma-Aldrich （美国） | 667404 | 10 mM |
| 双气体装置 | Applied Surface Technologies （美国） | K6-10DG | 一个喷嘴用于 CO2 气体 & 八个喷嘴用于 N2 气体 |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific （美国） | Invitrogen | 激发波长：480 nm 发射波长：500 nm |
| 落射荧光显微镜 | Nikon （日本） | Eclipse 80i | |
| 40倍物镜 | Nikon （日本） | Plan Fluor | 数值孔径：0.75 |
| CCD 相机 | Photometrics （美国） | Cool SNAP HQ2 | 单色 |
参考文献
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重印与许可
