一个 体外 研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的模型

摘要

卡波西肉瘤（KS）是一种由致癌病毒人类疱疹病毒8型/卡波西肉瘤相关疱疹病毒（HHV-8/KSHV）感染引起的肿瘤。此处描述的内皮细胞培养模型特别适用于研究KSHV转化宿主细胞的机制。

摘要

卡波西肉瘤（KS）是一种罕见的肿瘤，由增殖的梭形细胞构成，由KSHV感染内皮细胞（EC）引发，最常在免疫抑制状态下发生。尽管已有数十年的研究，KS的最佳治疗方案仍不明确，且在资源有限的环境中临床预后尤其不良。KS病灶的发生由病理性血管生成、慢性炎症及肿瘤发生共同驱动，且涉及多种因素 体外 已开发出细胞培养模型以研究这些过程。卡波西肉瘤（KS）起源于感染KSHV的内皮来源细胞，因此内皮细胞系（EC-lineage cells）提供了最合适的模型 体外 纺锤形细胞前体的替代物。然而，由于EC具有有限的 体外 寿命，由于KSHV所采用的致癌机制相较于其他致瘤病毒效率较低，因此在原代或端粒酶永生化的内皮细胞（EC）中评估转化过程一直存在困难。因此，研究人员开发了一种新型的基于EC的培养模型，该模型可有效支持KSHV感染后的细胞转化。通过异位表达人乳头瘤病毒16型（HPV-16）的E6和E7基因，能够实现年龄和传代次数相匹配的模拟感染与KSHV感染EC的长期培养，并支持感染细胞培养物中真正转化表型（即致瘤性表型）的形成。这一易于操作且高度可重复的卡波西肉瘤（KS）模型，已促进多个关键信号通路的发现，具有较高的临床转化潜力。

引言

卡波西肉瘤（KS）是一种多灶性血管增殖性肿瘤，常累及皮肤、黏膜及内脏部位，多发生于严重免疫抑制的情况下¹。目前已描述四种流行病学类型：经典型，一种惰性类型，通常影响地中海和中东血统的老年人；医源性型，由器官移植后使用免疫抑制药物引起；流行性型，即定义艾滋病的癌症类型；以及地方性型，为非洲流行地区儿童中常见的、与HIV无关的类型。随着高效联合抗逆转录病毒药物治疗方案的出现，流行性KS在发展中国家的诊断率已显著降低。然而，临床表现具有侵袭性的地方性型和流行性型仍然是许多非洲国家最常见的癌症之一^2,3,4。因此，识别针对KS发病机制的有效药物已成为一项重要的研究优先方向。

从组织学上看，卡波西肉瘤（KS）病灶的特征是广泛但异常的新生血管形成，即来源于内皮细胞（EC）的梭形细胞形成不连续的血管网络⁵。这些异常血管（"血管裂隙"）可导致红细胞外渗，从而使病灶呈现其特有的颜色。此外，病灶中含有大量表征慢性炎症的白细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞）。已有研究报道，在免疫重建后KS病灶可发生消退，提示KS兼具过度增生性病灶和真正肿瘤的特征^6,7,8,9。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），即卡波西肉瘤的致病因子，于1994年被发现¹⁰此后，许多 体外 已开发出细胞培养模型以支持发病机制研究，包括从肿瘤活检组织中分离的细胞，以及被KSHV感染的原代或表达端粒酶的EC细胞 体外^{11,12,13,14,15,16,17,18}目前尚无任何可用的模型能够完全重现卡波西肉瘤的肿瘤微环境，但所有这些模型均已为我们理解KSHV感染的病理生物学提供了宝贵的知识。与另一种已知的致瘤性人疱疹病毒——EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）不同，KSHV在体外培养中难以直接转化细胞。 从头合成 感染^19,20,21,22然而，这一局限性已通过在感染KSHV之前，将人乳头瘤病毒16型的E6和E7基因转导至混合微血管或淋巴管来源的原代人内皮细胞中而得以克服。^23,24这些外源性癌基因的表达显著增强了KSHV的转化潜能 体外 部分通过进一步抑制视网膜母细胞瘤蛋白和p53实现^23,24该内皮细胞转导方法已使多个实验室能够鉴定出由KSHV感染诱导的宿主细胞基因表达的关键改变，这些改变似乎有助于卡波西肉瘤细胞的存活与增殖。^{25,26,27,28,29,30,31,32}本文所述方案简明且高度可重复，可获得与传代次数相匹配的KSHV感染内皮细胞及模拟感染对照细胞。这些细胞的培养寿命远长于原代细胞，可用于研究KSHV所采用的致癌机制。尽管本方案包含从原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1中产生野生型KSHV的方法，但E6/E7永生化的内皮细胞对重组BACmid来源的KSHV-BAC16也具有高度感染敏感性。³⁰BAC16的制备方案在其他文献中有详细描述^33,34.

方案

注意：本方案中描述的所有操作均应在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。

1. KSHV 毒株制备

1. 配制 TNE 缓冲液：将 292.24 mg EDTA 溶于 ddH₂O 中，定容至 225 mL，并调节 pH 至 8。将 605.7 mg Tris 溶于 ddH₂O 中，定容至 225 mL，并调节 pH 至 8。将 EDTA 溶液与 Tris 溶液混合，加入 4.38 g NaCl，最终定容至 500 mL，过滤除菌后于 4 °C 保存^。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中，使用添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和抗菌剂的 RPMI 培养基，将 KSHV 阳性、EBV 阴性的原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 培养至浓度约为 1 至 1.2 × 10⁶ 个细胞/mL。
3. 为诱导 KSHV 产生，将细胞培养物以 1:2 比例传代至新鲜培养基中，并加入佛波醇 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA），使其终浓度为 20 ng/mL，继续培养 5 天。作为替代方案，也可用丁酸钠（NaB；0.1 mM）处理细胞 3 天，以诱导病毒裂解性复制。
4. 收集病毒颗粒时，首先将培养上清在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞，然后将上清转移至新离心管中。
5. 为进一步澄清上清，避免细胞碎片的转移，在 4 °C 下以 2,500 × g 离心 10 分钟。
   注意：作为高速离心澄清培养上清的替代方法，可通过无菌 0.45 µm 滤膜进行过滤。我们观察到使用过滤法会导致滴度显著下降；因此，常规采用第二次离心步骤。
6. 接下来，在 6 支超速离心管中，将约 30 mL 经澄清的培养上清液小心铺加在 5 mL 25% 蔗糖溶液（溶于 TNE 缓冲液）之上。
7. 将已平衡的离心管在 4 °C 下真空条件下以 75,000 × g 离心 2 小时。
8. 弃去上清液，用吸水纸轻轻擦拭管口边缘，尽可能去除残留的上清液和蔗糖溶液，然后将可能不可见的病毒沉淀重悬于 150 µL TNE 缓冲液中。
9. 合并所有重悬的病毒液，充分混匀后，分装为每份 25 µL，于 -80 °C 冻存^。

2. 使用 E6 和 E7 乳头瘤病毒基因转导内皮细胞

注意：我们常规使用标准组织培养瓶来培养原代内皮细胞。然而，如果内皮细胞生长状况不理想，则应考虑使用商用培养瓶。

1. 在含有内皮细胞生长培养基（EGM；包含补充了EGM-2 BulletKit [含胎牛血清、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子-B、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、抗坏血酸、人表皮生长因子、抗生素和肝素] 的内皮细胞基础培养基[EBM]）的T75细胞培养瓶中，将原代人皮肤微血管或淋巴管内皮细胞（EC）置于37^°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养至约50%汇合度。
2. 用于转导时，将PA317 LXSN 16E6E7细胞^24,35在添加了10%胎牛血清（FBS）和抗菌剂的DMEM培养基中，于T150细胞培养瓶中置于37^°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养至约90%汇合度。随后在16 mL培养基中过夜孵育。
3. 通过在室温下以300 x g离心5分钟澄清PA317培养基。
4. 移除内皮细胞培养中的EGM，加入12 mL澄清后的PA317培养基覆盖细胞，并孵育4小时。
   注意：将16 mL条件培养基在300 x g下离心5分钟可形成紧密沉淀，便于小心移除12 mL澄清上清液而不扰动沉淀。然而，若担心PA317 LXSN 16E6E7细胞被转移至原代内皮细胞培养物中（包装细胞系会迅速超过内皮细胞生长），可在转移前通过0.45 µm滤膜过滤条件上清液。
5. 将6 mL PA317培养基更换为新鲜EGM，并过夜孵育。
6. 用12 mL新鲜EGM重新换液，并继续孵育48小时。
7. 传代内皮细胞时，移除培养基，用12 mL无阳离子的PBS洗涤一次，然后加入3 mL商品化的酶解解离溶液（例如，TrypLE），于37 °C孵育3分钟。
8. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在室温下以300 x g离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于新鲜EGM中，并均等地分种至3个T75培养瓶中，每瓶最终体积为12 mL EGM。
9. 为筛选成功转导E6和E7的内皮细胞，加入G418至终浓度为200 µg/mL，持续两个传代周期。此后，转导后的内皮细胞可用于感染实验或在液氮中冻存。

3. KSHV 感染经转导的 EC 细胞

1. 感染前一天，使用上述商品化酶解离溶液通过酶消化法收获内皮细胞。将细胞沉淀重悬于1 mL EGM培养基中。取5 µL细胞悬液，用台盼蓝稀释至1/10。使用血细胞计数板计数活细胞，并接种2.5 × 10⁵个细胞⁵ 6 孔板中每孔加入 2 mL EGM 培养基培养活细胞。
2. 感染当天，移除EGM，每孔加入3 mL含钙镁的PBS洗涤细胞，然后每孔加入2 mL EBM。
   注意：感染过程中必须使用EBM而非EGM，因为EGM中的肝素会抑制病毒颗粒与靶向内皮细胞的结合及其后续感染。
3. 用KSHV感染细胞时，向每孔加入5至20 µL病毒储备液，轻轻摇动培养板以混匀。对于模拟感染的细胞，向每孔加入等体积的TNE缓冲液。
4. 将板在室温下以 400 x g 离心 30 分钟，然后在 37 °C 下孵育 90 分钟。
5. 如果研究目的是探讨需要同步病毒感染的早期事件， 例如，细胞活动的早期事件 从头合成 感染后，此时移除病毒接种液，用 2 mL 新鲜 EGM 洗涤并重新换液。否则，加入 2 mL EGM，继续培养过夜。
6. 感染后次日用 2 mL EGM 为细胞换液，之后每隔一天换液一次。
7. 当细胞融合度达到约90%时，使用上述商品化酶解离溶液通过酶消化法收集细胞，然后将三个孔中的细胞合并至T75培养瓶中，记录总传代次数及感染后传代次数。
8. 以1:3比例传代培养模拟感染和KSHV感染的EC，至少再传代两次，此后细胞可用于实验或在液氮中冻存。
   注意：与转导了 E6 和 E7 的内皮细胞（EC）的传代类似，模拟感染和 KSHV 感染细胞的维持培养物应在达到汇合前进行传代（约 85% 至 90%）。

4. 通过免疫荧光确认 KSHV 感染

注意：检测卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏相关核抗原（LANA-1/ORF73）可提供可靠的感染定量指标。抗-LANA 抗体可商业获得。

1. 染色前一天，将模拟感染或KSHV感染的EC细胞分别接种于24孔板中，每组两孔，每孔加入1 mL EGM培养基，细胞密度为1 × 10⁵ 个/孔，过夜培养。
2. 用500 µL含钙和镁的PBS洗涤细胞两次，每次在摇床上轻摇洗涤30秒。
3. 在带有外部排风的通风橱中，加入500 µL 4%多聚甲醛，室温固定细胞15分钟。
4. 用500 µL洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100和0.02%羊血清的含阳离子PBS）洗涤细胞三次。
5. 加入500 µL含2%羊血清的洗涤缓冲液，室温封闭细胞30分钟。
6. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。
7. 将模拟感染或KSHV感染的一孔细胞加入200 µL用洗涤缓冲液按1:100稀释的一抗，室温摇床上孵育30分钟；其余两孔仅加入200 µL洗涤缓冲液，作为对照。
8. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。
9. 向所有四个孔中各加入200 µL用洗涤缓冲液按1:100稀释的二抗，室温摇床上孵育30分钟。
10. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。
11. 每孔加入20 µL含DAPI的封片剂，并加盖盖玻片，使用倒置荧光显微镜观察染色结果。
12. 通过计数至少200个细胞中LANA阳性细胞核的数量，计算KSHV感染率。使用重组KSHV-Bac16感染时，也可通过观察GFP表达情况来监测感染效果。

结果

原代EC的形态学特征通常被描述为“铺路石样”，而乳头瘤病毒E6和E7基因的表达并不会改变这种形态（图1A）。仅表达E6和E7基因本身不会诱导转化表型；因此，细胞仍对接触抑制敏感，在培养中达到汇合时会停止增殖。然而，当细胞经胰蛋白酶消化并以较低密度重新接种后，仍可继续增殖并再次生长至汇合，从而可维持与实验组年龄和传代次数相匹配的对照培养体系，用于模拟感染对照。

用KSHV感染经E6/E7转导的内皮细胞（EC）可导致细胞在培养中发生显著的形态学改变，类似于卡波西肉瘤（KS）病灶中观察到的“梭形细胞”表型（图1B）。KSHV感染还可诱导产生转化表型，部分表现为细胞在达到汇合后失去接触抑制（图1C），并在软琼脂中表现出锚定非依赖性生长（图2）。在肿瘤发生过程中，失去接触抑制以及对细胞外基质相互作用（锚定）的依赖性，是细胞转化的两个典型特征

讨论

肿瘤发生是一个多步骤过程，可规避机体内的关键保护机制³⁶由于卡波西肉瘤（KS）病变存在于从慢性炎症到真正肉瘤的连续谱系中，阐明由KSHV介导的某些病理生理过程需要在支持转化的细胞培养模型中开展部分研究。⁹需要注意的是，接触抑制丧失和锚定依赖性生长能力的缺失（表明细胞转化的表型）在感染原代内皮细胞或通过外源性表达端粒酶而永生化的内皮细胞后，并不会轻易出现。因此，尽管 体外 此处描述的卡波西肉瘤（KS）模型虽不能完全重现KS肿瘤微环境的全部特征或离体KS细胞的行为，但特别适用于研究KSHV感染所诱导的宿主细胞基因表达变化，这些变化参与了KS的肿瘤发生过程。

首个采用本文所述培养系统进行的基因表达谱研究发现，受体酪氨酸激酶c-Kit参与了KSHV感染细胞转化表型的形成²⁵。通过siRNA敲低c-Kit表达，或使用显性负性构建体或酪氨酸激酶抑制剂STI 571（伊马替尼）抑制c-Kit信号通路，均可干扰KSHV的转化能力，表现为感...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCBL-1 细胞	NIH 艾滋病试剂项目	3233
PA317 细胞	ATCC	CRL-2203
新生儿真皮微血管内皮细胞	Lonza	CC-2505
EBM-2 基础培养基	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
抗 KSHV LANA/ORF 73 抗体	Advanced Biotechnologies	13-210-100
TrypLETMExpress，无酚红	ThermoFisher	12604013
RPMI
DMEM
含钙和镁的 PBS