静脉移植模型：一种适用于研究旁路移植物通畅性的模型

摘要

本视频展示了一种用于研究大鼠静脉移植术后肌性内膜增生发展的模型。

摘要

旁路移植术是冠状动脉疾病的一种成熟治疗方法。移植物通畅性仍然是大隐静脉移植物的薄弱环节。建立用于研究旁路移植失败的实验模型，对于深入理解移植物失去通畅过程中所涉及的病理生物学和病理生理学机制至关重要。大型动物模型（如猪或羊）虽在解剖结构上接近人类，但需要特殊的设施和设备。本视频介绍一种用于研究静脉移植物失去通畅性的大鼠静脉移植模型。大鼠价格低廉且易于操作。与小鼠模型相比，大鼠体型较为适中，手术操作更为便利，并能获取足够量的组织用于多种后续分析。简而言之，取供体大鼠的腹下腹壁静脉，用于替代一段股动脉。吻合采用单针缝合，并以纤维蛋白胶密封。移植物通畅性可通过双功能超声进行无创监测。导致移植物失去通畅性的主要原因是内膜增生，其随时间推移逐渐发展，可通过组织学横切面进行定量分析。

引言

冠状动脉疾病及其并发症是全球主要的死亡原因之一。目前的治疗策略主要集中在恢复血流，可通过扩张狭窄的血管或建立旁路来实现。1968年首次描述了使用自体静脉移植进行冠状动脉旁路移植术（CABG），此后多年不断得到改进。除左前降支冠状动脉的血运重建外，大隐静脉移植物是最常用的血管通路¹。然而，移植物通畅性仍是大隐静脉移植物（SVG）的薄弱环节。术后一年，移植物通畅率为85%，十年后下降至61%^2,3。因此，揭示SVG通畅性丧失的病理生理机制和原因是一项重要任务。

本视频展示了一种用于研究静脉移植物丢失的大鼠静脉移植模型。该方法的总体目标是探索疾病进展过程中的潜在病理生物学和病理生理学机制，并建立一种适用于药物或治疗方案测试的合适模型。通过将浅表腹壁静脉移植至动脉系统，该模型高度模拟了冠状动脉旁路移植术的临床情况。手术创伤、缺血和管壁应力是引发病理性血管改变的重要诱因，而本模型能够有效模拟这些因素。

目前有多种模型和物种可用于研究静脉移植物通畅性丧失。大型动物模型，如猪⁴、绵羊⁵、狗⁶和猴⁷，其血管和解剖结构与人类相似，因此可用于测试复杂的治疗策略，例如旁路支架置入或新的外科技术⁸。然而，这些模型需要特殊的饲养条件、设备和专业人员。此外，高昂的成本以及手术过程中需要额外的麻醉师....

方案

动物饲养和实验均遵循由实验动物资源研究所制定、美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》中的原则，给予人道护理。所有动物实验方案均经当地主管部门（"Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (健康与消费者保护局) 汉堡"）批准。

1. 动物护理

1. 从实验动物研究所获取体重为 300–350 g 的 Lewis 大鼠（LEW/Crl）和 ROSA/luciferase-LEW 转基因大鼠。
2. 将大鼠饲养在通风柜中的常规条件下，自由摄取标准大鼠饲料和高压灭菌水。
3. 以 ROSA/luciferase-LEW 转基因大鼠作为供体，同基因型 LEW/Crl 大鼠作为受体，进行移植物移植手术。

2. 供体大鼠的准备

1. 使用诱导室以异氟烷（2.5-3%）麻醉大鼠。
2. 将大鼠仰卧位放置，并通过覆盖口鼻的面罩维持麻醉。通过夹捏后肢足部并确认无反射反应来判断麻醉深度是否足够。在麻醉期间，向眼睛涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。   
3. 展开后肢，并用胶带固定其位置。
4. 使用毛发修剪器剃除腹股沟区域的毛发，随后用聚维酮碘消毒整个区域，再使用80%乙醇进行消毒。重复消毒步骤两次。
   注....

结果

大鼠静脉移植模型适用于研究血管内膜增生及静脉移植物功能障碍的发生。动物术后恢复良好，且表现出优异的生理状态。图1展示了关键的手术步骤。沿腹股沟线切开皮肤后，辨认腹壁浅静脉和股动脉（图1A）。获取移植物时应谨慎操作，避免损伤移植物（图1B），因为任何损伤均可能导致早期移植物失效和通畅性丧失。将移植物置于受体动物体内后（图1C），按图1D所示顺序进行吻合缝合。完成的静脉移植段外观呈苍白（图1E），在再灌注后应变为红色并出现搏动（图1F）。

通过双功能多普勒超声可无创确认静脉成功整合至股动脉以及移植后移植物的通畅性（图2A）。将Luc阳性大鼠的静脉移植至同系Luc阴性大鼠体内，可通过生物发光成像随时间监测移植物的存在情况（图2B）。

讨论

本视频展示了一种大鼠静脉移植模型，用于研究静脉移植物丢失，并可用于探索其潜在的病理过程以及测试新药物或治疗方案。

麻醉是外科手术中的关键环节。建议采用持续吸入式麻醉系统，因为这是一种安全且简便的方法，尤其适用于长时间的手术。在培训阶段，当手术时间超过1小时时，这一点尤为重要。

在手术过程中，关键是要避免在获取和植入过程中损伤静脉移植物¹⁷。抓持血管的外膜可防止静脉移植物受损，避免继发性血栓形成和移植物失效。静脉移植物通畅性可在静脉移植物成形后立即通过观察移植物或远端动脉的血流及搏动情况，以及通过双功能超声检查来确定。

该操作的另一个关键方面是防止静脉移植物过度扩张。静脉移植物突然暴露于动脉压力系统会导致管壁张力增加，继而发生过度扩张以及血流模式改变。这些因素可导致血栓形成、吻合口功能不全和移植物早期失效。使用纤维蛋白胶支撑静脉移植物可防止不受控的膨胀，保护内膜和中膜免受机械性损伤。可吸收的胶原保护套是纤维蛋白胶的替代方案，可用作静脉周围覆盖物

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠 LEW/Crl	查尔斯河实验室	货号 004
大鼠 LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	日本京都大学实验动物研究所	NBPR 大鼠编号 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
毛发修剪器	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	艾伯维	PZN 10182054 产品编号：B506	异氟烷
显微外科夹钳	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
夹钳施加器	Fine Science Tools	18056-14
脱毛膏	Rufin cosmetic	27618
聚维酮碘	Betadine 普渡制药	NDC:67618-152
10-0 Ethilon 缝线	Ethicon	2814G
5-0 prolene 缝线	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	辉瑞	400684.00.00	卡洛芬
诺瓦明磺酸	Ratiopharm	PZN 03530402	安乃近
肝素	Rotexmedica	PZN: 3862340	25,000 I.E./ml
1% 利多卡因	阿斯利康	PZN: 1137907	利多卡因
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 产品编号：EVK01DE	纤维蛋白胶
0.9% NaCl	B.Braun	PZN 06063042 产品编号：3570160
Vevo 770 高分辨率 体内 微成像系统	VisualSonics		双功能超声成像
Ecogel 100 超声耦合剂	Eco-med	30GB
D-荧光素钾盐（来自萤火虫）	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	珀金埃尔默		生物发光成像
Weigert 铁苏木素染色试剂盒	默克	1.15973.0002	三色染色
间苯二酚-品红 Weigert	Waldeck	2.00E-30	三色染色
酸性品红	西格玛-奥德里奇	F8129-25G	三色染色
丽春红 S 溶液	Serva Electrophoresis	33427	三色染色
偶氮品红	Waldeck	1B-103	三色染色
钼磷酸水合物	默克	1.00532.0100	三色染色
橙黄 G	Waldeck	1B-221	三色染色
亮绿 SF	Waldeck	1B-211	三色染色
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
冰醋酸	西格玛-奥德里奇	537020
37% 盐酸	西格玛-奥德里奇	H1758
二甲苯	Th. Geyer	3410
石蜡	Leica biosystems	货号 39602004
无水乙醇	Th. Geyer	2246
96% 乙醇	Th. Geyer	2295
70% 乙醇	Th. Geyer	2270
载玻片架	Ted Pella	21057
染色缸	Ted Pella	21075
Bepanthen 眼鼻软膏	拜耳	1578675	眼用软膏