内皮细胞的线粒体对于维持血脑屏障的完整性至关重要。我们介绍了一种用于测量脑血管内皮细胞生物能量功能的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
血脑屏障（BBB）的完整性对于防止脑损伤至关重要。脑血管内皮（CVE）细胞是构成血脑屏障的细胞类型之一；这些细胞具有极高的能量需求，需要线粒体功能处于最佳状态。在疾病或损伤情况下，这些细胞的线粒体功能可能发生变化，从而导致疾病或损伤的发生。 血脑屏障的开放。在本文中，我们介绍了一种利用完整活细胞和生物分析仪检测脑血管内皮（CVE）细胞线粒体功能的方法。通过线粒体应激测试，可对经物理或化学方式扰动的细胞进行功能挑战，并评估其生物能量学功能。此外，该方法还可用于筛选对线粒体功能具有直接作用的新型治疗药物。我们已优化了细胞密度，以获得可用于计算多种线粒体参数的氧气消耗率，包括ATP生成、最大呼吸速率和备用呼吸能力。我们还通过实验证明，引入特定干预后该检测方法具有良好的敏感性 microRNA miR-34a 可导致线粒体活性显著且可检测的下降。本文所示数据虽针对 bEnd.3 细胞系进行了优化，但我们也对原代 CVE 细胞的实验方案进行了优化，进一步提示其在临床前及临床模型中的应用价值。
引言
人们普遍认为，由脑血管内皮（CVE）细胞形成的血脑屏障（BBB）具有非常独特且重要的功能，对血管生物学至关重要。这些内皮细胞利用线粒体产生大部分三磷酸腺苷（ATP），作为细胞化学能的来源。除了为CVE细胞提供ATP外，线粒体还调控血管内皮细胞中的多种细胞过程，如细胞信号传导1-4、细胞凋亡5以及细胞周期和细胞生长的调控6。 CVE细胞中线粒体生物能量功能的失调可能影响线粒体生物合成，导致血管内皮功能受损，并加剧脑血管疾病和神经退行性疾病，例如，脑卒中7,8和阿尔茨海默病（AD）9。我们已证明，脂多糖（LPS）暴露后对CVE细胞的损伤会损害其线粒体功能，并加重脑卒中的预后7。叔丁基对苯二酚（tBHQ）通过干扰CVE细胞中的氧化磷酸化过程，增加脑卒中死亡率10。因此，CVE细胞生物能量功能的定量模型不仅为中枢神经系统（CNS）疾病的机制相关研究提供了先导平台，也为靶向血管生物学中线粒体功能的药物筛选带来了突破。
已分离的线粒体可用于测量生物能量功能。我们7及其他研究者11曾报道利用细胞外通量生物分析仪对完整的心血管内皮（CVE）细胞中的细胞生物能量学进行评估。该分析仪具有可评估内源性细胞生物能量状态的优势。这一灵敏且稳定的检测方法可测量CVE细胞的线粒体代谢，可用于评估刺激因素引起的生物能量损伤、研究线粒体信号通路的机制，以及筛选影响CVE细胞线粒体功能的药物或治疗方法。生物分析仪采用药理学分析方法，结合使用四种线粒体干扰剂——寡霉素（oligomycin）、羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）、鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A），记录氧气消耗率（OCR）。在本实验方案中，我们详细描述了一种优化的方法，可在单次检测中实现对CVE细胞线粒体功能参数的测量与计算，包括基础线粒体呼吸、ATP生成、质子泄漏、最大呼吸和备用呼吸能力。
方案
注意：该实验方案的流程如图1所示，包括各操作步骤的时间线。
1. CVE 细胞的培养与传代
- 在完全培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，DMEM）中培养 CVE 细胞（bEnd.3 细胞），培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，置于 T75 cm2 组织培养瓶中。于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
- 移除并弃去细胞培养液。用 0.25% 胰蛋白酶-0.03% EDTA 溶液冲洗细胞层，然后向培养瓶中加入 1–2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C 孵育 3–5 分钟。在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层脱落。加入 10 mL 完全培养基，轻轻吹打吸出细胞。
- 将液体和细胞转移至 15 mL 离心管中，以 700 × g 离心 5 分钟，以去除细胞碎片。
- 弃去离心管中的上清液。加入 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀，再以 700 × g 离心 5 分钟。
- 弃去离心管中的上清液。用完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至 2.0 × 105 个/mL（使用血细胞计数板计数；通过台盼蓝染色排除死细胞）。
注意：新鲜复苏的细胞需传代培养至少 3 代后用于实验。
2. 在细胞培养板上接种并处理细胞
- 将细胞接种于96孔细胞外通量细胞培养板中：每孔80 µL。将细胞培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。注意：每孔16 × 103个细胞在24小时内可达到60 - 80%的融合度。
- 若需对细胞施加化学处理，在细胞贴壁后（接种后8 - 24小时）加入处理试剂。
注意：进行转染实验时，完全生长培养基中不得添加抗生素。
3. 使用Bioanalyzer评估线粒体功能
- 在开始检测之前，向微孔板中加入 150 µL 细胞外通量校准液，将细胞外通量传感器微孔板在 37 °C 无 CO2 条件下孵育过夜，以完成水合。
- 使用洗板机将细胞培养基更换为 pH 7.0 的细胞外通量检测培养基。将细胞在 37 °C 无 CO2 条件下孵育 30 - 60 分钟。
- 在 DMEM 培养基中配制以下工作液：8 µM 寡霉素、4.5 µM FCCP、10 µM 鱼藤酮和 10 µM 抗霉素 A。将 25 µL 储备液分别加入传感器微孔板的加样孔中：A 孔加入寡霉素，B 孔加入 FCCP，C 孔加入鱼藤酮和抗霉素 A，并用细胞外通量检测培养基稀释。按照 表 1 中描述的方案执行检测程序。
- 将已完成水合的传感器微孔板装入生物分析仪中，点击 "开始" 按钮进行校准。校准完成后，取下微孔板底板，点击 "卸载微孔板" 提示，装入细胞微孔板。继续运行检测，直至所有测量结束。
- 打开数据文件，从生物分析仪中获取速率值，并将数据导出至电子表格文件。
4. 数据分析
注意：数据处理的计算方法在下文中列出。这些数值由生物分析仪仪器获得，即 图2 中所示的 OCR。
- 计算基础呼吸时，用基础值（测量值3）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。
注：基础呼吸 = 基础值 - 非线粒体呼吸 = 速率③ - 速率⑩~⑫。 - 计算ATP生成时，用基础值（测量值3）减去ATP偶联呼吸（测量值4 - 6）。
注：ATP生成 = 基础值 - ATP偶联呼吸 = 速率③ - 速率④~⑥。 - 计算最大呼吸时，用最大呼吸值（测量值7 - 9）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。
注：最大呼吸 = 最大呼吸值 - 非线粒体呼吸 = 速率⑦~⑨ - 速率⑩~⑫。 - 计算备用容量时，用最大呼吸值（测量值7 - 9）减去基础值（测量值3）。
注：备用容量 = 最大呼吸值 - 基础值 = 速率⑦~⑨ - 速率③。 - 计算质子漏时，用ATP偶联呼吸（测量值4）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。
注：质子漏 = ATP偶联呼吸 - 非线粒体呼吸 = 速率④ - 速率⑩~⑫。
结果
为了评估氧化应激条件下脑血管内皮（CVE）细胞的生物能量功能，我们选择了具有与原代脑微血管内皮细胞相似屏障特性的鼠脑微血管内皮细胞系 bEnd.312。鉴于不同细胞类型在反应动力学和相对强度上存在差异，我们首先设计了一系列实验，以确定用于代谢谱分析实验中最适宜的 bEnd.3 细胞数量，从而获得可测量的耗氧率（OCR）水平，结果如图2所示。评估后，数据被量化并展示于图3中。基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力均随细胞密度呈比例性变化。然而，当每孔接种细胞数达到 64 × 103 时，ATP 生成量下降，提示过度融合的细胞培养状态不适用于本实验。根据对线粒体干扰剂的反应，最适细胞密度范围为每孔 8 - 32 × 103 个细胞。
在后续实验中，采用每孔16 × 103个细胞的接种密度，以实现对OCR变化的最佳检测。使用每孔16 × 103个细胞的条件，我们观察到了OCR的预期反应，并证明了microRNA miR-34a可降低CVE细胞的线粒体功能（图4）。我们此前已报道，miR-34a在这些细胞中可降低氧化磷酸化水平13。重复实验还显示，在转染后24小时，miR-34a的过表达显著降低了CVE细胞的最大呼吸速率和备用呼吸能力，尽管基础呼吸、ATP生成和质子泄漏未发生显著变化（图4）。这些数据表明，该生物分析仪能够灵敏地检测CVE细胞中线粒体功能的变化。
图1. 实验的策略规划。 图中显示了细胞、培养板和试剂盒准备的时间安排。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 不同细胞密度下 CVE 细胞生物能量功能的代表性原始数据。 在不同细胞密度的 CVE 细胞中测定了耗氧率。数据表示为均值 ± 标准差（n = 5）；OCR：耗氧率；FCCP：羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Rot/Anti-A：鱼藤酮和抗霉素 A。①、② 和 ③ 表示基础呼吸；④、⑤ 和 ⑥ 表示与 ATP 合成相关的呼吸；⑦、⑧ 和 ⑨ 表示最大呼吸；⑩、⑪ 和 ⑫ 表示非线粒体呼吸。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 不同细胞密度下CVE细胞生物能量功能的代表性结果。 基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和备用能力是根据图2中生物能量功能实验产生的原始数据，利用第4节中所示公式计算得出。数据表示为均值±标准差（n = 5）；OCR：氧气消耗速率。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：miR-34a 导致生物能量功能下降的代表性结果。（A）转染后 24 小时过表达 miR-34a 后线粒体功能的原始数据。（B）基础呼吸、ATP 生成、最大呼吸和备用能力由 图 4A 中生物能量功能实验产生的原始数据计算得出；各参数按第 4 节中所示公式进行计算。miR-34a 的过表达在转染后 24 小时显著降低 CVE 细胞中的线粒体功能。数据表示为均值 ± 标准差（n = 5）；OCR：氧消耗率。****，P < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。
表1. 仪器运行程序。
讨论
本方案介绍了一种用于评估脑血管内皮细胞生物能量表型的方法。该方法可作为内皮细胞线粒体功能评价的基础实验，特别适用于旨在研究可能影响脑血管内皮细胞线粒体信号通路的刺激因素之作用机制的实验。同时，该方法也为与血脑屏障破坏相关疾病的潜在治疗手段提供了检测途径。
实验方案中的关键步骤
胞外通量生物分析仪能够实时测量耗氧率（OCR）。在本实验中，确定合适的细胞密度至关重要。若每孔细胞密度低于 8 × 103 个细胞，基础耗氧率过低，无法进行分析（图 2 和 图 3）；若每孔细胞密度高于 32 × 103 个细胞，细胞对寡霉素或FCCP处理无响应（图 2 和 图 3）。在本实验模型中，该细胞系的最佳细胞密度为每孔 16 × 103 个细胞，此条件下结果可重复，且对刺激7和处理10,14具有敏感性。若使用24孔生物分析仪，则需重新进行细胞密度的梯度优化。
已有文献记载，与其他内皮细胞或组织类型相比，脑血管内皮细胞（CVEs）含有大量的线粒体15,16，这表明其对能量生成的需求更高，因而可用于生物能量代谢检测的细胞数量更少。我们已测试了多种脑内皮细胞，包括原代和永生化的小鼠脑血管内皮细胞7，以及永生化的人脑血管内皮细胞（未发表数据）。在进行生物能量代谢检测时，这些细胞需要相似的细胞密度才能达到可接受的耗氧率（OCR）（96孔板的基底呼吸OCR为40–160 pmol/min，24孔板为50–400 pmol/min）。Kaczara 等报道了在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中检测生物能量代谢，其使用的细胞密度更高17。
本研究团队未评估来自其他组织或器官的血管细胞。理论上，该生物分析仪可能适用于任何细胞类型，但需要针对细胞密度、细胞培养基和培养条件优化实验方案（某些特定细胞可能需要包被培养板才能良好生长）。必须完成实验以确保氧消耗率（OCR）处于可接受范围内。如果来自其他器官的内皮细胞的OCR低于脑源性血管内皮细胞（CVEs），则提高细胞密度有助于使OCR达到可接受范围。此外，若细胞不以氧化磷酸化为主要能量来源，则该生物分析仪将不是最优的检测方法。
生物分析仪可根据试剂添加顺序，依次破坏电子传递链。首先加入寡霉素，抑制线粒体复合物V（ATP合酶）；其次加入电子解偶联剂FCCP，破坏质子梯度；最后加入鱼藤酮和抗霉素A，分别抑制线粒体复合物I和复合物III，从而完全阻断电子传递。药物暴露顺序至关重要，因为这些药物可特异性阻断电子传递链中的反应步骤，通过测量依次发生的变化，可反映线粒体功能。
修改与故障排除
为评估CVE细胞中线粒体对刺激的反应，建议在细胞贴壁于培养板底部后施加刺激（参见图1所示时间线；通常至少需要6小时）。为获得可重复的处理结果，保持细胞密度一致极为重要。若实验设计中包含接种前的预处理步骤，则应仔细测定每种预处理条件下的细胞密度，并在接种时排除死细胞。若实验涉及转染操作，请参照试剂生产商提供的转染方案。如图4所示数据中所展示，使用脂质体转染试剂盒将miR-34a转染至CVE细胞，该过程需使用不含抗生素的细胞培养基，并通过线粒体应激测试评估miR-34a过表达后代谢功能的变化。质粒用量也可根据既往文献进行优化13。此外，还可对本方案进行其他调整，例如改变试剂的浓度。可完成寡霉素、FCCP和/或鱼藤酮与抗霉素A的浓度梯度曲线实验。
此外，如果本实验用于多种药物的高通量分析，建议同时进行细胞活力和细胞增殖的平行实验，相关方法已在我们之前的出版物中描述7,13。OCR 值受细胞数量影响显著（图 2 和 图 3），而细胞增殖和活力实验有助于数据的标准化。然而，这些实验是否开展由各实验室自行决定。
该技术的局限性
该方案的主要局限性在于我们仅使用了一种 体外 研究中使用的细胞培养模型。目前尚无可用的 离体 可用于研究内皮细胞线粒体功能的模型或动物模型。预计将会开发出新的模型以评估生物能量功能 体内 和 离体 在今后的研究中
另一个局限性在于完成生物能量学检测后难以继续进行屏障功能评估。此类实验无法实施的原因有两点：首先，在完成生物能量学检测后，电子传递链被完全破坏，导致细胞活力显著下降；其次，检测生物能量学参数需要使用特定的细胞培养板和插件，而这些装置与用于屏障功能评估的插件不兼容。因此，在生物能量学检测之后可进行的功能性检测十分有限。然而，未来有望开发出特殊设备，以便在进行生物能量学检测之前完成功能性检测。
该技术相对于现有/替代方法的重要性
以往评估线粒体功能的技术需要将线粒体从细胞中分离出来18。这种利用生物分析仪的新技术能够在完整细胞中测量线粒体活性，相较于评估分离的线粒体，更能保持细胞原有的微环境。
掌握该技术后的未来应用或发展方向
本方案专为 bEnd.3 细胞系设计和开发，但也适用于原代脑血管内皮（pCVE）细胞7或其他内皮细胞，我们已在先前使用 pCVE 细胞的研究中证实了这一点7。当使用其他类型的内皮细胞时，可能需要对培养板进行包被并添加生长因子。然而，滴定实验同样推荐用于其他细胞类型。本方案提供了一种通用方法，可用于评估 CVE 细胞的生物能量学特性，并可进一步应用于相关机制研究或治疗反应的分析。
披露
作者声明，对于本文章的研究、撰写和/或发表不存在任何潜在的利益冲突。本文的开放获取费用由安捷伦科技公司提供。
致谢
本研究由以下基金资助：美国心脏协会（AHA）16SDG31170008（资助X.R.）以及美国国立卫生研究院（NIH）P20 GM109098、P01 AG027956和U54 GM104942（资助J.W.S.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| bEnd.3 细胞系 | ATCC | CRL-2299 | 25 - 30 代 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | ATCC | 30-2002 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S12450 | 终浓度 10% |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | 1×100 储存液 |
| 0.25% 胰蛋白酶，0.03% EDTA 溶液 | Corning | 25-053-CI | |
| 丙酮酸钠 | Corning | 25-000-CI | 终浓度 1.0 µM |
| 葡萄糖 | Sigma | CAS 50-99-7 | 终浓度 25 mM |
| 寡霉素 | Sigma | O4876 | 终浓度 1.0 µM |
| 羰基氰-4-三氟甲氧基苯腙（FCCP） | Sigma | C2920 | 终浓度 0.5 µM |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | 终浓度 1.0 µM |
| 抗霉素 A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 终浓度 1.0 µM |
| 板洗站 | Seahorse Bioscience | ||
| 细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| 细胞外通量细胞培养板 | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| 细胞外通量传感器微孔板 | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| 细胞外通量校准液 | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| 细胞外通量检测培养基 | Seahorse Bioscience | 102365-100 | 检测前调节 pH |
参考文献
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