在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外 该系统将有助于采用高通量策略筛选抗HBV药物。
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本文内容
摘要
摘要
目前，已可构建携带外源基因（如报告基因或标记蛋白）的多种病毒的重组形式，例如人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）。这些重组病毒通常能忠实地模拟原始病毒在感染细胞中的生命周期，并表现出相同的宿主范围依赖性。重组病毒的开发使得高效筛选抑制剂和鉴定特定宿主因子成为可能。然而，迄今为止，由于存在多种实验限制，乙型肝炎病毒（HBV）的重组病毒构建一直较为困难。主要限制在于HBV基因组尺寸紧凑，且必须被包装进病毒颗粒的基因组大小较为严格，通常不超过1.3倍基因组长度。因此，若不对基因组DNA进行删除，则插入的外源基因大小应小于0.4 kb。为克服这一尺寸限制，有必要删除部分HBV DNA序列。本文报道了一种重组HBV的构建方法：通过删除部分HBV聚合酶（pol）编码区，并用报告基因替换部分HBV核心蛋白编码区，从而实现报告基因的表达，用于监测HBV复制周期的早期阶段。通过报告基因活性来检测重组HBV感染，其灵敏度高且成本低于目前可用的传统HBV感染检测方法。该系统将适用于多种应用，包括高通量筛选抗HBV抑制剂、宿主因子以及易感病毒的细胞。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是导致慢性肝病的主要风险因素1。尽管目前的治疗策略主要基于使用抑制HBV聚合酶功能的核苷类似物，和/或使用I型干扰素来激活感染者体内的免疫反应，并通过干扰素刺激基因的功能间接抑制HBV增殖2，但这些治疗方法无法彻底清除HBV DNA3。此外，出现对抗聚合酶药物耐药的HBV毒株也令人担忧4。联合使用直接靶向人类免疫缺陷病毒（HIV）或丙型肝炎病毒（HCV）生命周期不同阶段的抗病毒药物已被证明可成功抑制甚至根除病毒。借鉴这一思路，开发能够直接作用于HBV生命周期各个阶段的抗HBV药物，对于建立未来的HBV治疗方案具有重要意义。
通常，建立目标病毒的简单体外培养系统有助于抗病毒药物的研发。然而，在建立用于筛选抗乙型肝炎病毒（HBV）药物的体外培养系统方面至少存在两个障碍。第一个障碍是缺乏便捷的体外细胞培养系统用于HBV感染与增殖。与其他可在已建立的细胞系中传代的病毒（如HIV和HCV）不同，由于宿主范围狭窄等实验限制，HBV在体外培养较为困难。为克服这些问题，已开发出特定的细胞培养系统，例如可被HBV感染的人肝癌细胞系HepaRG5,....
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方案
1. 编码报告蛋白的重组乙型肝炎病毒的制备
- HepG2 细胞的准备
- 准备细胞培养基（DMEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸）。
- 转染前一天，将 4 × 106 个 HepG2 细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。
注意：当在 10 cm 胶原包被培养皿中接种约 4 × 106 个 HepG2 细胞并加入 10 ml 培养基时，次日细胞融合度可达 70–90%。
- 转染
- 使用转染试剂，按照制造商说明书，将 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 转染至 HepG2 细胞中。
- 次日，移除培养基，并加入 10 ml 新鲜培养基。
- 转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3.1。向转染细胞的培养皿中加入 1....
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结果
图1展示了乙型肝炎病毒（HBV）基因组、转录的RNA、病毒蛋白及其在基因组上的编码区域的示意图。报告基因及其在基因组中的位置也已标出。图2展示了含有报告基因的HBV报告质粒和辅助质粒。pUC1.2HBV/NL报告质粒是通过从pUC1.2HBV16的preCore mRNA转录起始位点删除第223至811位核苷酸，然后插入报告基因构建而成。pUC1.2HBVdelta质粒是通过定点诱变PCR在衣壳化信号序列中引入点突变而获得。报告质粒（pUC1.2HBV/NL）和辅助质粒（pUC1.2HBVdelta）用HindIII和EcoRI进行酶切，随后进行凝胶电泳。预期条带大小分别为：pUC质粒3.0 kb，1.2HBV/NL或1.2HBVdelta为3.5 kb，结果如图2B所示。图3展示了表达NTCP的HepG2细胞被重组HBV感染的情况。为建立稳定表达NTCP.......
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讨论
乙型肝炎病毒（HBV）基因组包含四个主要的开放阅读框（ORF），分别为核心（core）、聚合酶（pol）、表面（surface）和X基因的开放阅读框（图1）。这四个HBV ORF的转录受到四个启动子的严格调控：包含增强子II的前核心/核心启动子、S1启动子、S2启动子以及包含增强子I的X启动子18。3.5 kb和3.4 kb的mRNA分别翻译生成前核心（PreCore）和核心（Core）蛋白。大包膜蛋白（L）由最长的亚基因组mRNA（2.5 kb）编码，中等（M）和小表面蛋白（S）则由较短的转录本（2.1 kb）翻译而来。0.8 kb的转录本是X蛋白翻译的模板19,20。前基因组RNA的5ʹ端和3ʹ端含有多个功能性的顺式作用元件，包括直接重复序列1（DR1）、DR2以及包装信号21,22。这些功能元件限制了报告基因或标记基因.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分由日本医疗研究开发机构（AMED）的肝炎研究计划以及日本文部科学省（MEXT）的科学研究费补助金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纳米荧光素酶检测试剂 | Promega | N1110 | |
| 青霉素-链霉素混合溶液 | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/胶原蛋白包被培养皿 | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| 聚乙二醇 (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| 聚乙二醇 (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai Tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/L EDTA 溶液 | Nacalai Tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai Tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP，0.45 μm，聚醚砜滤膜 | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 胶原蛋白包被 96 孔板 | Corning | NO3585 | |
| 5 倍被动裂解缓冲液 | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 微孔板发光检测仪 | Promega | E6501 | |
| 蔗糖 | Nacalai Tesque | 30403-55 | |
| 发光检测仪用微孔板 | Greiner Bio-One | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | 参考文献 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | 参考文献 15 |
| pUC1.2HBV/NL | - | - | 参考文献 15 |
| 50 ml 离心管 | Violamo | 1-3500-02 | |
| 抗 Myc 抗体 | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | 日本血液制品机构 | - | |
| IFN-β | Mochida 制药 | 14987224005413 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3393 |
参考文献
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure....
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