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方法文章

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

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DOI：

10.3791/54849

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2017年2月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外 该系统将有助于采用高通量策略筛选抗HBV药物。

摘要

目前，已可构建携带外源基因（如报告基因或标记蛋白）的多种病毒的重组形式，例如人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）。这些重组病毒通常能忠实地模拟原始病毒在感染细胞中的生命周期，并表现出相同的宿主范围依赖性。重组病毒的开发使得高效筛选抑制剂和鉴定特定宿主因子成为可能。然而，迄今为止，由于存在多种实验限制，乙型肝炎病毒（HBV）的重组病毒构建一直较为困难。主要限制在于HBV基因组尺寸紧凑，且必须被包装进病毒颗粒的基因组大小较为严格，通常不超过1.3倍基因组长度。因此，若不对基因组DNA进行删除，则插入的外源基因大小应小于0.4 kb。为克服这一尺寸限制，有必要删除部分HBV DNA序列。本文报道了一种重组HBV的构建方法：通过删除部分HBV聚合酶（pol）编码区，并用报告基因替换部分HBV核心蛋白编码区，从而实现报告基因的表达，用于监测HBV复制周期的早期阶段。通过报告基因活性来检测重组HBV感染，其灵敏度高且成本低于目前可用的传统HBV感染检测方法。该系统将适用于多种应用，包括高通量筛选抗HBV抑制剂、宿主因子以及易感病毒的细胞。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是导致慢性肝病的主要风险因素1。尽管目前的治疗策略主要基于使用抑制HBV聚合酶功能的核苷类似物，和/或使用I型干扰素来激活感染者体内的免疫反应，并通过干扰素刺激基因的功能间接抑制HBV增殖2，但这些治疗方法无法彻底清除HBV DNA3。此外，出现对抗聚合酶药物耐药的HBV毒株也令人担忧4。联合使用直接靶向人类免疫缺陷病毒（HIV）或丙型肝炎病毒（HCV）生命周期不同阶段的抗病毒药物已被证明可成功抑制甚至根除病毒。借鉴这一思路，开发能够直接作用于HBV生命周期各个阶段的抗HBV药物，对于建立未来的HBV治疗方案具有重要意义。

通常，建立目标病毒的简单体外培养系统有助于抗病毒药物的研发。然而，在建立用于筛选抗乙型肝炎病毒（HBV）药物的体外培养系统方面至少存在两个障碍。第一个障碍是缺乏便捷的体外细胞培养系统用于HBV感染与增殖。与其他可在已建立的细胞系中传代的病毒（如HIV和HCV）不同，由于宿主范围狭窄等实验限制，HBV在体外培养较为困难。为克服这些问题，已开发出特定的细胞培养系统，例如可被HBV感染的人肝癌细胞系HepaRG5,6,7。此外，从接种了人原代肝细胞（PHH）的尿激酶型纤溶酶原激活物转基因/重症联合免疫缺陷（uPA-SCID）小鼠中分离得到的PXB细胞也被证实可被HBV感染并支持其复制8。然而，HepaRG细胞中的HBV复制水平依赖于细胞培养后的分化状态，可能导致HBV感染/复制水平的结果不一致且不可重复。PXB细胞虽常用于HBV感染实验，但其可获得性有限。四环素诱导型HBV表达细胞系HepAD38也被广泛用于研究HBV复制，但该系统仅可用于转录后的评估，无法检测HBV感染的进入阶段9。最近，钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）被确认为HBV的功能性受体，从而推动了多种HBV培养系统的建立10。事实上，在原本不易感的肝癌细胞（如Huh7和HepG2）中表达NTCP可使其支持HBV感染10，因此可选用的HBV易感细胞系范围得以扩大，解决了许多实验上的限制。第二个问题是缺乏简单有效的检测系统来评估HBV感染与复制。通常通过检测HBV DNA、RNA和蛋白来评估HBV感染情况。然而，这些病毒标志物的定量检测往往耗时、成本较高且操作复杂。因此，开发一种简单的检测系统（例如使用报告基因）可能有助于克服现有HBV检测系统存在的问题。

然而，由于HBV衣壳可包装的基因组大小有限——小于3.7 kb11，报告基因的长度应尽可能短。此外，病毒基因组中分散分布的多个顺式作用元件对病毒复制至关重要，这限制了报告基因插入基因组的可用位置。已有数项研究尝试将外源基因（包括HIV-1 Tat、绿色荧光蛋白和DsRed）插入HBV基因组11,12,13。然而，这些重组HBV无法用于筛选HBV感染/复制过程，或用于影响HBV感染/复制因素的高通量筛选。这主要是由于重组病毒产量较低，以及病毒产生效率低下导致报告基因表达强度减弱所致。

为解决这些问题，我们构建了一种病毒产量高的报告型乙型肝炎病毒（HBV）。该病毒对监测HBV复制周期的早期阶段（从病毒进入至转录）具有高度敏感性。为此，我们选用NanoLuc（NL）作为标记基因，因其是一种经过工程改造的小型发光报告基因（171个氨基酸）14。此外，NL的发光强度约为萤火虫或海肾荧光素酶的150倍，且其发光反应不依赖ATP，表明在高通量筛选中假阳性率将较低。重组HBV的产生效率约为亲本HBV的1/5，与既往报道的重组HBV病毒水平相似；然而，NL的高亮度弥补了病毒产量的不足，因此可用于抗HBV药物的大规模筛选。

使用原代肝细胞、HepaRG、HepAD38 和 NTCP 转导的肝细胞筛选抗 HBV 药物可能适用于通过常规方法进行抗 HBV 药物的筛选。然而，本文所述系统具有多种优势，例如操作简便、灵敏度高以及筛选成本低。这些优势使其适用于高通量筛选，以开发和鉴定具有治疗用途的新型 HBV 药物。

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方案

1. 编码报告蛋白的重组乙型肝炎病毒的制备

  1. HepG2 细胞的准备
    1. 准备细胞培养基（DMEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸）。
    2. 转染前一天，将 4 × 106 个 HepG2 细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。
      注意：当在 10 cm 胶原包被培养皿中接种约 4 × 106 个 HepG2 细胞并加入 10 ml 培养基时，次日细胞融合度可达 70–90%。
  2. 转染
    1. 使用转染试剂，按照制造商说明书，将 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 转染至 HepG2 细胞中。
    2. 次日，移除培养基，并加入 10 ml 新鲜培养基。
    3. 转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3.1。向转染细胞的培养皿中加入 10 ml 新鲜培养基。
      注意：重组 HBV 的产生可持续 4 周。含有重组 HBV 的培养基可在 4 °C 下保存 1 个月。
  3. 重组 HBV 的纯化
    1. 通过离心（2,300 × g，4 °C，5 分钟）去除含重组 HBV 的培养基中的细胞碎片。
    2. 将上清液通过 0.45 µm 膜滤器过滤。
    3. 向含重组 HBV 的培养基中加入等体积的 26% PEG/1.5 M NaCl 溶液（聚乙二醇 6000：130 g，NaCl：49 g，0.5 M EDTA pH 8.0 1 ml，1 M HEPES pH 7.6 5 ml，加水至 500 ml），轻轻混匀。4 °C 过夜孵育。
    4. 在 4 °C 下以 2,300 × g 离心 20 分钟。
    5. 弃去上清液，将沉淀溶解于 0.5 ml TNE 缓冲液（10 mM Tris，50 mM NaCl，1 mM EDTA）中。
    6. 以 2,300 × g 离心 5 分钟，去除残留碎片。
    7. 将含重组 HBV 的 0.5 ml TNE 溶液加至 0.8 ml 20% 蔗糖（溶于 TNE）上层。
    8. 在 15 °C 下以 100,000 × g 离心 3 小时。
    9. 尽可能弃去上清液，保留沉淀。每 40 ml 初始培养基所得样品，用 1 ml 无血清 DMEM 重悬沉淀。
    10. 4 °C 过夜孵育。
    11. 通过 0.45 µm 滤器过滤。分装为 0.5 ml 每份，于 -80 °C 保存。
      注意：若原始病毒样品中存在报告蛋白污染，可通过在 TNE 中进行 5–30% 蔗糖密度梯度超速离心（100,000 × g，2 小时）或 CsCl 密度平衡离心（密度 1.1–1.6 g/ml，150,000 × g，50 小时）进一步纯化病毒。

2. 重组HBV的感染

  1. 在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、250 µg/ml G-418和100 U/ml非必需氨基酸的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养可被乙型肝炎病毒（HBV）感染的稳定表达NTCP的HepG2细胞（HepG2/NTCP）15。
  2. 感染前一天，将约5 × 104个HepG2/NTCP细胞14接种至96孔胶原包被板中，每孔加入0.1 ml培养基。
  3. 将重组HBV置于37 °C水浴中解冻，直至管内仅剩少量冰晶。
  4. 按以下组分配制每孔感染用培养基：10 µl 40% PEG8000溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，2 µl二甲基亚砜（DMSO），10 µl重组HBV，以及78 µl新鲜培养基。
  5. 向96孔板的某一孔中加入100 µl重组HBV溶液。
  6. 感染后一天，用每孔300 µl PBS洗涤感染细胞3次，以去除病毒组分中污染的报告蛋白。
  7. 将感染后的细胞在含有2% DMSO的200 µl培养基中孵育一周或更短时间。

3. 分析

  1. 感染后一周，用 PBS 清洗感染的细胞 3 次。
  2. 向感染的细胞中加入 50 µl 裂解缓冲液。
  3. 将培养板轻轻摇动 5 分钟，然后在 2,000 × g 下离心 5 分钟。
  4. 向发光检测仪板中加入 50 µl 报告分子底物。
  5. 将 20 µl 细胞裂解液加入含有报告分子底物的发光检测仪板中，短暂涡旋混匀。
  6. 将板放入发光检测仪中并开始读数15。

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结果

图1展示了乙型肝炎病毒（HBV）基因组、转录的RNA、病毒蛋白及其在基因组上的编码区域的示意图。报告基因及其在基因组中的位置也已标出。图2展示了含有报告基因的HBV报告质粒和辅助质粒。pUC1.2HBV/NL报告质粒是通过从pUC1.2HBV16的preCore mRNA转录起始位点删除第223至811位核苷酸，然后插入报告基因构建而成。pUC1.2HBVdelta质粒是通过定点诱变PCR在衣壳化信号序列中引入点突变而获得。报告质粒（pUC1.2HBV/NL）和辅助质粒（pUC1.2HBVdelta）用HindIII和EcoRI进行酶切，随后进行凝胶电泳。预期条带大小分别为：pUC质粒3.0 kb，1.2HBV/NL或1.2HBVdelta为3.5 kb，结果如图2B所示。图3展示了表达NTCP的HepG2细胞被重组HBV感染的情况。为建立稳定表达NTCP...

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讨论

乙型肝炎病毒（HBV）基因组包含四个主要的开放阅读框（ORF），分别为核心（core）、聚合酶（pol）、表面（surface）和X基因的开放阅读框（图1）。这四个HBV ORF的转录受到四个启动子的严格调控：包含增强子II的前核心/核心启动子、S1启动子、S2启动子以及包含增强子I的X启动子18。3.5 kb和3.4 kb的mRNA分别翻译生成前核心（PreCore）和核心（Core）蛋白。大包膜蛋白（L）由最长的亚基因组mRNA（2.5 kb）编码，中等（M）和小表面蛋白（S）则由较短的转录本（2.1 kb）翻译而来。0.8 kb的转录本是X蛋白翻译的模板19,20。前基因组RNA的5ʹ端和3ʹ端含有多个功能性的顺式作用元件，包括直接重复序列1（DR1）、DR2以及包装信号21,22。这些功能元件限制了报告基因或标记基因...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作部分由日本医疗研究开发机构（AMED）的肝炎研究计划以及日本文部科学省（MEXT）的科学研究费补助金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纳米荧光素酶检测试剂PromegaN1110
青霉素-链霉素混合溶液Nacalai Tesque09367-34 
MEM 非必需氨基酸溶液Thermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985070
100 mm/胶原蛋白包被培养皿Iwaki4020-010
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000001 
聚乙二醇 (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
聚乙二醇 (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai Tesque31319-45 
0.5 mol/L EDTA 溶液Nacalai Tesque06894-14
Tris-HClNacalai Tesque35434-21
Millex-HP，0.45 μm，聚醚砜滤膜Merck MilliporeSLHP033RS
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-AldrichD2650
胶原蛋白包被 96 孔板CorningNO3585
5 倍被动裂解缓冲液PromegaE1941
GloMax 96 微孔板发光检测仪PromegaE6501
蔗糖Nacalai Tesque30403-55
发光检测仪用微孔板Greiner Bio-One655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--参考文献 15
pUC1.2HBV delta epsilon--参考文献 15
pUC1.2HBV/NL--参考文献 15
50 ml 离心管Violamo1-3500-02
抗 Myc 抗体Sigma-AldrichC3956
HBIG日本血液制品机构-
IFN-βMochida 制药14987224005413
肝素Sigma-AldrichH3393

参考文献

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

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