方法文章

头孢哌酮治疗小鼠模型的临床相关的艰难梭菌应变R20291

DOI：

10.3791/54850

⸱

2016年12月10日

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

本文内容

摘要

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该协议概述了使用临床相关和转听话应变，R20291 艰难梭菌感染（CDI）的头孢哌酮小鼠模型。临床疾病的监测， 艰难梭菌细菌枚举，毒素的细胞毒作用，并在小鼠模型中在整个CDI病理学改变强调在协议中详述。

摘要

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艰难梭菌是一种厌氧、革兰氏阳性、孢子形成的肠道病原体，与发病率和死亡率的增加有关，因此对公共卫生构成紧急威胁。艰难梭菌感染 （CDI） 在抗生素成功治疗后复发率很高，发生在 20-30% 的患者中，因此需要发现针对这种病原体的新疗法。目前的 CDI 动物模型导致高死亡率，因此与 CDI 患者身上看到的慢性、隐匿的疾病表现不相似。为了评估针对艰难梭菌的治疗，需要一个利用临床相关菌株近似人类疾病的小鼠模型。该协议概述了使用临床相关且遗传可处理的菌株 R20291 的 CDI 头孢哌酮小鼠模型。方案中详细介绍了小鼠模型中整个 CDI 中临床疾病监测、艰难梭菌细菌计数、毒素细胞毒性和组织病理学变化的技术。 与其他 CDI 小鼠模型相比，该模型在给药剂量下并不均匀致死，因此可以观察到与人类疾病一致的长期感染临床过程。因此，这种 CDI 的头孢哌酮小鼠模型被证明是一个有价值的实验平台，用于评估新疗法对改善临床疾病和恢复对艰难梭菌的定植抗性的影响。

引言

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艰难梭菌是一种厌氧，革兰氏阳性，形成孢子的杆菌引起危及生命的腹泻1。 艰难梭菌感染（CDI）与日益增多的人类发病率和死亡率，并导致每年1-4医疗费用相关的超过480十亿$。在2013年，美国疾病控制和预防归类难辨作为一项紧迫抗生素耐药性的风险，这表明它对公众健康的1紧迫的威胁。目前，万古霉素抗生素治疗和甲硝唑被认为是照顾的CDI 5标准。不幸的是，CDI复发成功治疗后用抗生素为高，在20发生-的患者2,5-7 30％。因此，新的治疗剂的发现对这种肠道病原体是必要的。为了评估对难辨梭状芽孢杆菌 ，动物模型近似交流人类疾病治疗需要linically相关的应变。

最初，柯赫氏法则是在1977年用克林霉素治疗的叙利亚仓鼠模型建立8 艰难梭菌 。这种模式是今天仍然利用探讨发病9,10的难辨梭状芽孢杆菌毒素的作用。然而，CDI在仓鼠模型导致高死亡率和不近似慢性阴险疾病表现可与CDI 10,11人看到。根据在研究鼠平台的辅助和试剂可用性，CDI的小鼠模型是相关的。

在2008年，CDI的健壮小鼠模型，通过用在饮用水3天之后克林霉素12

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方案

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伦理声明:
机构的动物护理和使用委员会（IACUC）的兽医北卡罗莱纳州立大学（NCSU）批准了这项研究。北卡罗莱纳州立大学的动物护理和使用政策适用于在北卡罗莱纳州立大学的1985年实验动物设施动物福利法与健康研究扩展法案规定的标准和准则，坚持以指南为照顾和实验动物使用中规定的准则。动物的健康状态，每天进行评估和垂死的动物被人道地用CO 2窒息，再进行二次措施实施安乐死。训练有素的动物技术人员或兽医在本研究中进行畜牧业在AAALAC认证的设施。

1.饮用水管理的抗生素头孢哌酮，实现敏感性艰难梭菌定植与疾病

注意:5至8周龄的C57BL / 6野生型小鼠（雌性和雄性）在开始抗生素水施用前被购买和隔离1周。检疫之后，小鼠被安置与蒸压食品，床上用品和水。笼变化在层流罩中进行由实验室工作人员每周。

  1. 在无菌蒸馏水中挑战的目标天（ 图1）之前，至7天制备头孢哌酮（0.5毫克/毫升）。
  2. 装满水头孢哌酮蒸压水瓶（0.5毫克/毫升），并放置在每个鼠笼。
    注:新鲜制备的头孢哌酮水应在5天的时间进行，并变出每2天，如在步骤1.1和1.2表示。建议适当处置以下的机构环境，健康和安全准则头孢哌酮水。
  3. 后头孢哌酮水5天，用高压灭菌水瓶充满无菌蒸馏水更换瓶。给予小鼠本饮用水在实验的持续时间。
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结果

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期间的代表性研究中，5周龄的C57BL / 6野生型小鼠用头孢哌酮在其饮用水中（0.5毫克/毫升）预处理5天，并允许一个2天的洗出与普通的饮用水。小鼠用经由在第0天（ 图1A）口服强饲法10 5孢子梭状 R20291的挑战。小鼠14天的CDI体重减轻和临床症状（嗜睡，食欲不振，腹泻，和驼背姿势）进行了监测。 C57BL / 6 WT小鼠艰难梭菌 R20291孢子的挑战导致腹泻24小时，并于48小时后的挑战（ 图1B）显著体重减轻内。虽然在本实验中没有观察到，与较高剂量梭状 R20291的攻击的小鼠可以成为严重患病或有由48大于20％的重量损失- 72小时后的挑战，因此需要人道的安乐死。因此，将小鼠要求最低每日两次的与艰难梭菌芽孢的挑战后的监测。

在该代表性研究中，体重损失和疾病的小鼠的临床症状.......

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讨论

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该协议表征了艰 难梭菌 R20291孢子攻击的抗生素治疗小鼠的临床病程，包括体重减轻，细菌定植，毒素细胞毒性和胃肠道组织病理学变化。协议中有几个关键步骤，其中对细节的关注至关重要。艰 难梭 菌孢子接种物的准确计算至关重要。该计算基于原始艰 难梭菌 孢子储备计数，在启动此协议之前，该计数应在多个孢子计数中保持一致。如果接种量计算错误，将导致小鼠的接种剂量不准确。同样，根据这些计算制备和稀释艰 难梭 菌孢子应小心准备。任何稀释错误都会导致起始孢子接种物不准确。最后，应采取预防措施避免污染经过抗生素处理的对照小鼠（未接种艰 难梭 菌孢子）。头孢哌酮处理的小鼠极易受到 艰难梭菌 定植的影响，因此不应与艰 难梭菌感染的小鼠直接接触28-30。如果识别出上述关键步骤，则有望成功执行 CDI 鼠标模型。

改变给予小鼠的艰 难梭菌 孢子的剂量或菌株可能会改变该模型的结果。增加给予小鼠的孢子接种物可能会增加观察到的发病率和.......

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披露

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作者目前没有什么可透露的。

致谢

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作者要感谢 Wellcome Trust Sanger 研究所的 Trevor Lawley 提供艰难梭菌 R20291 孢子，感谢北卡罗来纳州立大学兽医学院的 James S. Guy 提供 Vero 细胞，两者均用于本手稿。在 Traci Raley 和 Amanda Brown 的特别协助下，在北卡罗来纳大学教堂山分校的 LCCC 动物组织病理学核心设施进行了动物组织病理学检查。LCCC 动物组织病理学核心部分由 NCI 中心核心支持赠款 （2P30CA016086-40） 支持给 UNC Lineberger 综合癌症中心。我们还要感谢 Vincent Young、Anna Seekatz、Jhansi Leslie 和 Cassie Schumacher 对 Vero 细胞毒性测定方案的有益讨论。JAW 由 NIH T32OD011130的 Ruth L. Kirschstein 国家研究服务奖研究培训补助金资助。CMT 由 NIH 的 NIGMS K01GM109236代谢组学职业发展奖资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#62 Perisept 孢子消毒清洁剂 SSS Navigator48027该产品将需要按照制造商的建议稀释
0.22 &μ;m 过滤器Fisherbrand09-720-3滤板，用于在 Vero 细胞测定中测试的单个样品
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056需要在 37 °C 的水浴中加热;C 使用前
0.4% 台盼蓝Gibco15250-061
1% 青霉素/链霉素Gibco15070-063
10% 热灭活 FBSGibco16140-071需要在 37 °C 的水浴中加热;C 使用前
1 ml 塑料注射器 BD医疗用品309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml微量离心机螺旋盖康宁430917
96孔细胞培养平底板Costar CorningCL3595
96孔过滤板MilliporeMSGVS2210
胶粘剂密封ThermoScientificAB-0558
Bacto 琼脂Becton Dickinson214010TCCFA 板的一部分（见下文）
Bacto Proteose 蛋白胨Becton Dickinson211684TCCFA 板的一部分（见下文）
头孢哌宗MP Bioworks199695
头孢西丁SigmaC47856TCCFA 板的一部分（见下文）
艰难梭菌抗毒素试剂盒Tech LabsT5000用作 Vero 细胞测定的对照
艰难梭菌毒素 A清单 生物实验室152CVero 细胞测定的阳性对照
D-环丝氨酸SigmaC6880TCCFA 板的一部分（见下文）
蒸馏水Gibco15230
DMEM 1x 培养基Gibco11965-092需要在 37 °C 的水浴中加热;C 使用前
果糖FisherL95500TCCFA 板的一部分（见下文）
血细胞计数器Bright-Line，SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500TCCFA 板的一部分（见下文）
MgSO4（无水）SigmaM2643TCCFA 板的一部分（见下文）
Millex-GS 0.22 &μ;m 过滤器Millex-GSSLGS033SSTCCFA 板过滤器 
Na2HPO4SigmaS-0876TCCFA 板的一部分（见下文）
NaClFisherS640-3TCCFA 板的一部分（见下文）
10 号一次性手术刀刀片Miltex， Inc4-410
PCR 板Fisherbrand14230244
塑料培养皿Kord-Valmark Brand2900
无菌塑料 L 形细胞铺展器Fisherbrand14-665-230
注射器步进器Dymax CorporationT15469
牛磺胆酸盐SigmaT4009TCCFA 板的一部分（见下文）
超纯蒸馏水Invitrogen10977-015
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室664小鼠应为 5 - 8 周龄
奥林巴斯 BX43F 光学显微镜奥林巴斯生命科学
DP27 相机奥林巴斯生命科学
cellSens Dimension 软件 奥林巴斯生命科学
替代

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F.....

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