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方法文章

经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291

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⸱

DOI：

10.3791/54850

⸱

2016年12月10日

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

本文内容

摘要

本方案概述了使用临床相关且遗传上易于操作的菌株 R20291 建立头孢哌酮诱导的小鼠Clostridium difficile感染（CDI）模型的方法。该方案详细描述了在小鼠模型中对临床疾病监测、C. difficile细菌计数、毒素细胞毒性以及CDI过程中组织病理学变化的评估。

摘要

Clostridium difficile 是一种厌氧、革兰氏阳性、可形成芽孢的肠道病原体，与日益增加的发病率和死亡率相关，因而对公共卫生构成紧迫威胁。在使用抗生素成功治疗后，C. difficile 感染（CDI）的复发率很高，约20–30%的患者会出现复发，因此迫切需要发现针对该病原体的新型治疗方法。目前的CDI动物模型往往导致高死亡率，因而无法模拟人类CDI中常见的慢性、隐匿性疾病的临床表现。为了评估针对 C. difficile 的治疗手段，亟需一种采用临床相关菌株、能够模拟人类疾病特征的小鼠模型。本实验方案详细描述了使用一种具有临床相关性且遗传背景清晰的菌株R20291建立的头孢哌酮诱导的小鼠CDI模型，以及在该模型中进行临床疾病监测、C. difficile 细菌计数、毒素细胞毒性检测和组织病理学变化分析的技术方法。与其他CDI小鼠模型相比，该模型在所用剂量下不会导致全部动物死亡，因而能够观察到与人类疾病进程一致的较长临床病程。因此，这种头孢哌酮诱导的CDI小鼠模型为评估新型治疗手段在缓解临床症状以及恢复对 C. difficile 定植抗性方面的效果提供了一个有价值的实验平台。

引言

Clostridium difficile 是一种厌氧、革兰氏阳性、可形成芽孢的杆菌，可引起危及生命的腹泻1。C. difficile 感染（CDI）与人类发病率和死亡率升高相关，每年导致超过 48 亿美元的医疗支出1-4。2013 年，美国疾病控制与预防中心（CDC）将 C. difficile 列为紧急抗生素耐药威胁，表明其对公共健康构成紧急威胁1。目前，使用万古霉素和甲硝唑进行抗生素治疗被视为 CDI 的标准治疗方案5。然而，抗生素治疗成功后 CDI 的复发率较高，约 20–30% 的患者会出现复发2,5-7。因此，迫切需要发现针对该肠道病原体的新型治疗方法。为了评估针对 C. difficile 的治疗手段，需要建立一种能够模拟临床相关菌株所致人类疾病的动物模型。

最初，1977年利用克林霉素处理的叙利亚仓鼠模型建立了针对C. difficile的科赫法则8。该模型至今仍被用于研究C. difficile毒素在致病过程中的作用9,10。然而，仓鼠模型中的艰难梭菌感染（CDI）会导致极高的死亡率，且无法模拟人类CDI中可能出现的慢性隐匿性病变表现10,11。鉴于小鼠模型在研究中具有良好的可及性和丰富的试剂资源，建立小鼠CDI模型具有重要意义。

2008年，通过在饮水中给予小鼠抗生素混合物（卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素、甲硝唑和万古霉素）处理3天，随后腹腔注射克林霉素12，建立了一种稳定的艰难梭菌感染（CDI）小鼠模型。该方法使小鼠对CDI和严重结肠炎易感。根据接种菌量的不同，利用该模型可观察到一系列临床症状及死亡率。自此以来，已有多种抗生素处理方案被研究，这些方案可改变小鼠肠道微生物群，降低定植抗性，从而使C. difficile得以在胃肠道内定植（详见Best et al. 和 Lawley & Young的综述）13,14。

最近，通过饮水给予小鼠广谱头孢菌素头孢哌酮，连续5天或10天，可稳定地使小鼠对艰难梭菌感染（CDI）易感。15由于三代头孢菌素的使用与人类艰难梭菌感染（CDI）风险增加相关，因此采用头孢哌酮模型能更准确地反映自然发生的疾病情况16. 头孢哌酮处理后对小鼠易感的 C. difficile 已同时接受两种挑战 C. difficile 各种具有不同临床相关性和毒力的菌株的孢子和营养细胞17尽管一些原始研究采用了 C. difficile 以营养细胞作为感染形式， C. difficile 孢子被认为是主要的传播方式18.

近十年来，C. difficile R20291（一种NAP1/BI/027型菌株）出现，并引发了艰难梭菌感染（CDI）的流行19,20。本研究旨在明确当经头孢哌酮处理的小鼠感染临床上相关且遗传操作便利的 C. difficile 菌株R20291时，疾病的临床进程。本方案详细描述了感染 C. difficile R20291 芽孢后小鼠的临床病程，包括体重减轻、细菌定植、毒素细胞毒性以及胃肠道组织的组织病理学变化。总体而言，该小鼠模型是一种可模拟人类疾病的有价值的实验平台。因此，这一已明确特征的小鼠模型可用于评估新型治疗手段在缓解临床症状以及恢复对 C. difficile 的定植抗性方面的作用。

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方案

伦理声明：
北卡罗来纳州立大学兽医学院（NCSU）机构动物护理与使用委员会（IACUC）已批准本研究。NCSU 动物护理与使用政策遵循《1985年动物福利法》和《健康研究扩展法》所规定的标准与指南。NCSU 的实验动物设施遵守以下指南： 实验动物护理和使用指南 动物的健康状况每天进行评估，濒死动物采用二氧化碳安乐死2 窒息后采取二次措施。在本研究期间，由经过培训的动物技术人员或兽医在AAALAC认证的设施中进行动物饲养管理。

1. 在饮水中给予抗生素头孢哌酮以实现对C. difficile定植和疾病的易感性

注意事项：购买6至8周龄的C57BL/6野生型小鼠（雌性和雄性），在开始给予抗生素水之前进行为期1周的隔离。隔离结束后，小鼠饲养于经高压灭菌的饲料、垫料和饮水条件下。实验室工作人员每周在层流罩内更换笼具。

  1. 在预定攻毒日前7天，用无菌蒸馏水配制头孢哌酮（0.5 mg/ml）溶液（图1）。
  2. 将高压灭菌的水瓶装入含头孢哌酮的水溶液（0.5 mg/ml），并放置于每只小鼠笼中。
    注意：在为期5天的处理期间，应每2天配制并更换新鲜的头孢哌酮水溶液，具体时间点如步骤1.1和1.2所示。建议根据所在机构的环境健康与安全指南妥善处理废弃的头孢哌酮水溶液。
  3. 小鼠饮用头孢哌酮水溶液5天后，更换为装有无菌蒸馏水的高压灭菌水瓶。实验期间持续为小鼠提供该种饮用水。

2. C. difficile 芽孢接种物的制备及小鼠口服灌胃

注意：开始之前，确保将以下物品置于厌氧培养箱中至少 24 小时：1× 磷酸盐缓冲液（PBS；见材料）、牛磺胆酸环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（TCCFA）平板（见材料和补充文件）以及无菌 L 形涂布棒。

注意：接种 C. difficile 芽孢的小鼠应饲养在生物安全二级动物实验设施中。

  1. 获取一个 C. difficile 先前制备并储存在无菌水中、于4 °C保存的所需菌株（此处为R20291）的孢子储备液21,22使用前需确定该孢子储备液的计数。
  2. 根据已知浓度（孢子/毫升）的孢子储备液，计算所需稀释倍数以获得 105 每25 µl含孢子数。确保接种物体积充足，足以完成实验中所有小鼠的接种（每只小鼠25 µl）、接种物浓度计数（约30 µl）以及弥补移液误差。
  3. 涡旋原始样本 C. difficile 孢子储备液。然后，重悬步骤 2.2 计算出的原始储备液体积 C. difficile 无菌水中孢子储备液置于带螺帽的微量离心管中。在层流罩内有氧条件下进行操作。将此稀释混合物标识为 "孢子接种物。"
  4. 将孢子接种物放入65 °C水浴中加热20分钟。
    注意：此步骤将确保仅有活化的 C. difficile 热处理后仍有孢子残留。
  5. 在层流罩内，取50 µl加热后的孢子接种物，置于无菌微量离心管中，并将其转入厌氧舱23. 将此样品用于孢子计数。
  6. 在层流罩内，将剩余的加热孢子接种物加入连接无菌球头胃灌注针的1 ml注射器中。使用手动注射器推进器，以确保小鼠间准确且快速地重复给药。使用前需确保灌注针内充满加热的孢子接种物。
    注意：无需为每只小鼠使用新的无菌灌胃针。但是，如果给予不同剂量的 C. difficile 每次给药时应使用新的灌胃针。
    注意： C. difficile 孢子对传统消毒剂具有高度抗性。因此，必须使用杀孢子消毒剂，例如 #62 Perisept 杀孢子消毒剂。制造商建议作用时间为 2 分钟以彻底灭活 C. difficile 孢子
  7. 用25 µl孢子接种物对每只小鼠进行灌胃。轻轻抓住小鼠颈背部的松弛皮肤以固定动物，使其头部保持不动。用食指进一步固定动物头部并拉长食管。在固定过程中，确保动物不发出叫声或表现出其他痛苦迹象。
    注意：经灌胃给予小鼠的总体积不应超过 10 ml/kg 体重（0.1 ml/10 g）。
  8. 将小鼠保持直立、垂直的姿势，轻轻将灌胃针从口腔侧边插入。沿小鼠口腔顶部引导灌胃针，并缓慢推进至食管。
    注意：如果遇到任何阻力，饲管针可能已进入气管，此时不应继续推进，而应立即拔出并重新放置。
  9. 当灌胃针插入食管约一半深度时，注入25 µl加热后的孢子接种物，然后轻柔地将灌胃针从食管中抽出。
    注意：用力推进灌胃针可能导致食管或胃部破裂。因此，若在推进灌胃针时遇到阻力，应立即撤出并重新调整灌胃针位置。
  10. 将动物放回笼中，并观察其是否有咳嗽或呼吸困难的迹象，因为这可能表明意外将加热的孢子接种物注入气管或发生吸入。
    注意：小鼠极易受到 C. difficile 抗生素处理后需采取预防措施，防止笼具间的交叉污染，这一点至关重要。在管理经抗生素处理但未进行挑战的对照小鼠时，尤其需要注意。
  11. 接种完所有小鼠后，将剩余的加热芽孢接种液转移至无菌微量离心管中，并放入厌氧舱内进行芽孢计数。
  12. 为计数加热后的孢子接种物（来自步骤 2.4）以及剩余的灌胃用加热孢子接种物，将每种接种物用 1×PBS 进行 1:10 系列稀释。建议制备并涂布 4–5 个稀释度即， 10-1 通过 10-5).
  13. 使用无菌技术，将每种连续稀释液各100 µl转移至单独的TCCFA平板上。
  14. 使用无菌的L形涂布棒，将接种到培养基上的稀释液在平板上均匀涂布。稀释接种物的均匀分布对于孢子的准确计数至关重要。
  15. 在37 °C下将平板厌氧培养24小时。24小时后， C. difficile 菌落形成单位（CFUs）可进行计数，以确定在25 µl（0.025 ml）体积中给予小鼠的感染剂量（参见补充文件） "示例计算"). C. difficile 菌落呈扁平状、淡黄色，边缘不规则，具有毛玻璃样外观24.
    注意：细菌计数的检测下限为 102 菌落形成单位

3. 监测小鼠在 C. difficile 感染期间的体重减轻及疾病临床症状

  1. 在为期5天的头孢哌酮抗生素治疗前、治疗后，以及停用抗生素后的2天恢复期结束时（第0天），随后在整个实验期间，定期称量动物体重。
    注意：每天应在相同时间点获取体重数据。挑战当天（第0天）测得的体重应作为后续C. difficile感染过程中比较的初始基线体重。
  2. 将电子天平放入生物安全柜中。将一个无菌塑料烧杯置于天平上，并去皮归零。然后，轻轻抓住小鼠尾根部，将其放入塑料烧杯中。
    1. 将烧杯重新放回天平上。用手悬于烧杯上方，防止小鼠跳出。可能需要2–3秒才能获得稳定的读数。随后，轻柔地将小鼠放回其笼中。记录该体重，并对同笼中每只小鼠重复此过程。
      注意：称重过程中必须采取预防措施，防止不同笼具之间发生交叉污染。每笼小鼠应使用专用的塑料烧杯进行称重。每次使用后，塑料烧杯须用杀孢子剂消毒，并用无菌铝箔覆盖。
  3. 每天至少两次监测经挑战动物是否出现临床严重的C. difficile感染症状，包括嗜睡、食欲减退、腹泻和蜷缩姿势。
  4. 对于体重下降达到初始基线体重20%和/或出现严重C. difficile感染临床症状（见步骤3.3所列）的动物，应实施人道安乐死。
    注意：实验过程中，若小鼠出现C. difficile感染的临床症状，应根据需要随时称重，以确认其体重是否已下降20%。在实验早期阶段，可能需要每天测量两次。

4. 小鼠粪便和盲肠内容物中 C. difficile 的细菌计数

注意：开始之前，确保将以下物品放入厌氧培养箱中至少 24 小时：1× PBS（见材料）、TCCFA 平板（见材料）、无菌 L 形涂布棒、以及用于梯度稀释的无菌微量离心管和/或 PCR 板。

  1. 获取用于艰难梭菌（C. difficile）计数的样品
    注意：在收集粪便或盲肠内容物之前，使用分析天平称量无菌微量离心管。将管重记录在管壁上，保留四位小数（例如，0.9864 g）。将此重量记为"管重"。每个采集的样品都应放入一个无菌且已称重的微量离心管中。
    1. 小鼠粪便的无菌采集
      1. 通过抓住小鼠颈部和背部的松弛皮肤来轻轻固定小鼠，以固定其头部。用小指轻轻固定动物的尾巴，从而暴露肛门。确保在固定过程中动物不发出叫声或表现出其他痛苦迹象。
      2. 将一个无菌、已称重的微量离心管直接置于动物肛门下方。必须确保该管不与小鼠直接接触。
        1. 当动物排便时，将粪便颗粒收集到管中。在所有粪便样品收集完成前，将管保持在室温下。小鼠排便可能需要数分钟，因此可能需要多次尝试以成功收集粪便。
      3. 使用分析天平称量含有粪便的管子。记录管重，保留四位小数（例如，1.0021 g）。将测得的重量记为"最终管重"。
      4. 在粪便采集后，立即将粪便样品送入厌氧室进行细菌计数。
    2. 尸检时小鼠盲肠内容物的无菌采集
      1. 通过CO2窒息实施人道安乐死后，再采取二次措施，随后进行尸检以取出盲肠25。盲肠是胃肠道中较大、呈逗点状的部分。
      2. 将盲肠放置于无菌塑料培养皿上。使用一次性无菌10号手术刀片从盲囊的盲端切开盲肠，以暴露其内容物。
        1. 用刀片轻轻施加压力，并将内容物扫向切开部位，以温和地提取盲肠内容物。
          注意：应小心操作，避免破坏盲肠组织，因为该组织将用于组织病理学检查。
      3. 采集后立即把盲肠内容物放入一个无菌、已称重的微量离心管中。进行细菌计数仅需约10 mg的盲肠内容物。
      4. 使用分析天平称量含有盲肠内容物的管子。记录管重，保留四位小数（例如，1.0021 g）。将测得的重量记为"最终管重"。
      5. 将盲肠内容物样品立即送入厌氧室进行细菌计数。
  2. 艰难梭菌（C. difficile）的细菌计数
    1. 计算将用于艰难梭菌（C. difficile）计数的内容物（粪便或盲肠）的最终重量。通过从"最终管重"中减去"管重"来完成此计算。
    2. 将内容物用1×PBS按1:10比例稀释，并相应重悬。对于粪便颗粒，使用移液器尖端轻轻搅动颗粒使其溶解于溶液中（参见补充文件"示例计算"）。
    3. 将重悬后的样品在室温下厌氧孵育30分钟，使内容物沉淀。
    4. 在1×PBS中对每个样品进行系列稀释，以计算每克内容物（粪便或盲肠）中的菌落形成单位（CFU）。此步骤需在厌氧条件下进行。
    5. 采用无菌操作技术，将每种系列稀释液各100 µl转移至TCCFA平板。使用无菌L型涂布棒，将加在培养基上的稀释液均匀涂布于整个平板表面。均匀涂布对准确计数菌落至关重要。
    6. 将平板在37 °C下厌氧孵育24小时。此时对艰难梭菌（C. difficile）菌落进行计数，以获得每克内容物（粪便或盲肠）中的CFU数。艰难梭菌（C. difficile）菌落呈扁平、淡黄色，边缘不规则，具有磨砂玻璃样外观24。
      注意：本方案也可用于计数其他小鼠胃肠道内容物中的艰难梭菌（C. difficile），包括回肠和结肠内容物。可使用PCR板进行系列稀释。

5. 使用 Vero 细胞毒性试验定量分析 C. difficile 毒素的细胞毒性

注意：建议在完成小鼠模型实验后，使用剖检时采集并储存在 -80 °C 的样品进行本检测。本检测过程中必须采用无菌细胞培养技术，以防止Vero细胞被污染。本方案需2天完成。本检测所使用的所有粪便和肠道内容物必须储存于已称重的无菌微量离心管中（以标记的 "管重，" 参见上文）。使用分析天平称量最终试管重量（包括内容物），精确至小数点后四位（参见上文）。建议使用多通道移液器进行本检测。

注意：开始前，请确保备齐以下物品：Vero 细胞、含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Eagle 改良培养基（DMEM 1x，以下简称“"DMEM 1x 培养基"，参见材料与补充文件）、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、1× PBS、0.4% 台盼蓝、96 孔平底细胞培养板、96 孔滤膜板、Clostridium difficile 毒素 A（以 3 µl 分装，浓度为 1 µg/µl，溶于超纯水中，-80 °C 保存）、Clostridium difficile 抗毒素、实验记录表（用于计算和板图设计；参见补充文件）。

注意：进行本实验时，应谨慎防止人员接触艰难梭菌（C. difficile）及其毒素。

  1. Vero 细胞传代（第 1 天）
    1. 将DMEM 1x培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA和1x PBS置于37 °C水浴中预热。
    2. 从细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中取出一瓶Vero细胞2）并将其放入无菌细胞培养超净台中。使用前，用70%乙醇擦拭超净台和设备。用刻度移液管吸取组织培养瓶中的培养基，以去除Vero细胞上的培养基，并将其弃入废液容器中。
    3. 用5 ml预热的1×PBS冲洗细胞培养瓶中的Vero细胞。吸去PBS并弃入废液容器中。
    4. 向组织培养瓶中加入5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA。作用时间为2–3分钟。在此期间，观察细胞开始从瓶壁脱落。轻轻左右摇动组织培养瓶，以松动Vero细胞。
    5. 加入胰蛋白酶-EDTA孵育后，立即向组织培养瓶中加入5 ml DMEM 1x培养基，以中和胰蛋白酶-EDTA。用此溶液轻轻冲洗瓶背面，使未贴壁的Vero细胞脱落。随后，使用刻度移液管将该混合液转移至15 ml锥形离心管中。
    6. 将锥形管中的Vero细胞在180 × g、25 °C条件下离心5分钟。确保离心机已正确平衡。离心后，观察锥形管底部出现明显的Vero细胞沉淀，注意勿扰动此沉淀。用移液器吸除上清液并弃去。
    7. 用3 ml的DMEM 1×培养基重悬Vero细胞。
  2. 计数Vero细胞
    1. 将100 µl Vero细胞悬液（步骤5.1.7制备）加入100 µl 0.4%台盼蓝溶液中，用移液器轻轻吹打混合。
    2. 向血细胞计数板的每个计数室中加入10 µl该混合液。
    3. 统计血细胞计数板四个象限内的活细胞数量。死亡的Vero细胞会摄入台盼蓝，因而被染成蓝色（此类细胞不应计入）。将这些数值记录在 "Vero 细胞实验记录表" 提供。
    4. 将四个象限中所有可存活的Vero细胞总数相加并计算平均值。乘以稀释倍数（由于100 µl细胞悬液加入至总体积为200 µl的液体中，稀释倍数为2）。
    5. 乘以校正因子以得到 "细胞数/毫升" 使用血细胞计数板时，校正系数始终为104乘以总体积，得到 "细胞总数"
  3. 确定每个实验所需的孔数
    注意：单个样本（粪便或肠道内容物）需进行24个独立孔，每孔设两个复孔。浓度为105 每孔需要 Vero 细胞（总体积为 90 µl）。
    注意：如果需要将Vero细胞96孔板在37 °C下孵育过夜，则细胞接种浓度应为103 建议每孔接种Vero细胞数量时考虑延长的孵育时间。Vero细胞工作表中的计算需根据此变化进行相应调整。
    1. 根据可用的Vero细胞数量（来自步骤5.2；使用提供的Vero细胞工作表）确定可利用的孔数。
    2. 根据待测样本数量，确定所需填充的Vero细胞悬液体积（基于所需孔数）。需额外增加一定体积以弥补移液误差（可参考提供的Vero细胞工作表）。
    3. 将Vero细胞悬液（步骤5.1.7中获得）用DMEM 1x培养基稀释，以获得实验所需的体积。
  4. 将Vero细胞接种至96孔细胞培养板
    1. 使用5.3.2步骤中的Vero细胞重悬液，用多通道移液器将90 µl Vero细胞悬液加入96孔细胞培养平底板的每孔中。
    2. 将含有Vero细胞的培养板置于细胞培养箱中，在37 °C和5% CO₂条件下孵育2 至少孵育4小时，然后再向孔中加入毒素（样品）。该孵育时间可使Vero细胞贴附至每个孔的底部。
  5. 从样品（粪便或肠道内容物）制备储备溶液
    注意：所有样品均应具有 "管重" 和 "最终管重" 通过分析天平测量。使用 Vero 细胞工作表进行计算。
    1. 计算内容物的重量。将克（g）转换为毫克（mg），再将毫克（mg）转换为微升（µl）。计算用1×PBS制备1:10稀释液所需的溶液总体积（µl）。计算需加入样本中的1×PBS总量。
    2. 加入上述计算的1×PBS总体积至样品中。此操作需在有氧条件下进行，并使用无菌技术。对于粪便颗粒，用移液器枪头轻轻将颗粒在溶液中分散开。
    3. 将样品涡旋混匀，然后在室温下以3,522 × g离心5分钟。确保离心机已正确平衡。操作时注意不要扰动沉淀，将样品重新悬浮于溶液中。
      注意：在步骤 5.5.3 中，如果仅处理少量样本，可通过单个 0.22-µm 滤器过滤样本以实现灭菌，而不必使用 96 孔滤板。某些样本可能需要使用多个滤器，才能通过此方法将全部体积的样本内容完全灭菌。
    4. 将150 µl上清液转移至96孔滤板的不同孔中，对样品/PBS混合物进行灭菌。将滤板牢固地置于96孔细胞培养平底板上方，使滤液流入该板中。
    5. 将滤板/细胞培养板叠放在室温下以431 × g离心5分钟。确保离心机已正确平衡，且滤板/细胞培养板叠放紧密对齐，在离心过程中不会发生移位。
      注意：这些筛选后的内容为10-1 将用于稀释平板的菌种。
    6. 将装有滤过样品的培养皿置于冰上。
  6. 制备稀释平板 #1
    注意：稀释平板#1（DP#1）每个样本需6个孔，包括阳性（C. difficile 毒素A）和阴性（1×PBS）对照（参见Vero细胞工作表上的DP#1布局）。
    1. 准备阳性对照（C. difficile 对于本实验，从-80 °C取出3 µl等份的毒素A（1 µg/µl），加入297 µl超纯水，终浓度为0.01 µg/µl。置于冰上。
    2. 用稀释度标记各孔（10-1 至 10-6每个样本的检测结果，并标明阳性对照和阴性对照（参见DP#1布局）。
    3. 向每个孔中加入适量的1×PBS。在10-1 孔，加入 一氧化氮 PBS。对于10-2 至 10-6 孔中加入90 µl 1x PBS。
    4. 向每个孔中加入适量的样品。在10-1 孔中加入 100 µl 的 10-1 每个样品的储备液（参见滤板部分的步骤5.5.7）。对于10-2 至 10-6 孔中进行连续稀释；首先从10 µl的10-1 良好地加入到10中-2 继续进行系列稀释至10⁻⁶-6 稀释
    5. 用透明塑料粘性封膜覆盖DP#1平板，并置于冰上。
  7. 制备稀释平板 #2
    注意：稀释平板（DP#2）每个样本需使用2排共6个孔，包括阳性和阴性对照（参见Vero细胞工作表上的DP#2布局）。
    1. 用稀释度标记各孔（10-1 至 10-6) 为每个样本标注，并标明阳性对照和阴性对照（参见DP#2布局）。用样本名称标记各孔（记作 "样品孔"）或含抗毒素的样本名称（记为 "抗毒素孔").
    2. 计算本实验所需的抗毒素用量。注意：抗毒素为25倍浓缩液，需用1×PBS按1:25比例稀释。将配制好的1×抗毒素溶液置于冰上。
    3. 对于 "样品孔，" 向每个稀释度的各孔中加入 20 µl 的 1x PBS（10-1 至 10-6) 的该样品。对于 "抗毒素孔" 向所有稀释度的每个孔中加入 20 µl 1x 抗毒素（10-1 至 106该样品的）
    4. 将稀释后的样品各20 µl从DP#1转移至DP#2中第1–6行和第7–12行的指定孔内（参见Vero细胞工作表上的DP#2布局）。用移液器轻轻吹打混合溶液。
    5. 用透明塑料粘性封膜覆盖DP#2，室温孵育40分钟。此孵育步骤旨在使抗毒素与目标物结合，从而使其失活并中和 C. difficile 毒素
    6. 孵育结束后，从DP#2中取10 µl混合液加入相应的Vero细胞孔中（参见Vero细胞工作表上的Vero细胞培养板布局）。用移液器轻轻吹打混匀，注意避免破坏贴壁于孔底的Vero细胞。
    7. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中，将Vero细胞板孵育过夜2.
  8. 使用光学显微镜评估Vero细胞的变圆情况（第2天）
    注意：当将样品混合物加入Vero细胞板时，稀释因子会变化10倍例如， 10-3 现在是10-4）。含有抗毒素的孔中应几乎不出现或完全不出现Vero细胞变圆现象。在含有毒素的样本中将观察到Vero细胞变圆（细胞毒性）现象。 C. difficile 毒素。如果在含有样本和抗毒素的稀释液中细胞毒性活性被中和，则表明存在该毒素 C. difficile 毒素导致Vero细胞毒性的结果得到证实。
    1. 使用光学显微镜在200倍放大下观察Vero细胞是否出现变圆现象。对于样本孔（包括阳性对照），记录出现细胞变圆的孔的稀释度 最后 观察到80%的Vero细胞变圆。
    2. 计算细胞毒性滴度，其定义为每克样品中引起80% Vero细胞变圆的最高稀释倍数的倒数。例如，若最高稀释倍数为10-5，则稀释倍数为10-6 对于此样品，log[最终稀释倍数]/g 样品即为 log[106]，得到的倒数滴度为6。
      注意：Vero 细胞在用于本实验前，应经过至少 3 - 4 次传代，且传代次数不得超过 30 次。26.

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结果

在一项代表性研究中，5周龄的C57BL/6野生型小鼠通过饮水中添加头孢哌酮（0.5 mg/ml）预处理5天，随后给予普通饮水清洗2天。在第0天，通过口服灌胃给予小鼠105个C. difficile R20291芽孢进行攻毒（图1A）。随后对小鼠进行为期14天的体重变化和临床症状（包括嗜睡、食欲减退、腹泻和蜷缩姿势）监测，以评估艰难梭菌感染（CDI）情况。C57BL/6野生型小鼠经C. difficile R20291芽孢攻毒后，24小时内出现腹泻，48小时内出现显著的体重下降（图1B）。尽管本实验中未观察到严重病例，但若使用更高剂量的C. difficile R20291攻毒，小鼠可能在攻毒后48–72小时内病情严重或体重下降超过20%，此时需实施人道终点安乐死。因此，在给予C. difficile芽孢攻毒后，小鼠至少需每天进行两次以上的密切监测。

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讨论

本方案描述了经抗生素处理后接种 C. difficile R20291 芽孢的小鼠在感染过程中的临床病程，包括体重减轻、细菌定植、毒素细胞毒性以及胃肠道组织病理学变化。在该方案中，有多个关键步骤需要特别注意细节。准确计算 C. difficile 芽孢接种量至关重要，该计算基于原始 C. difficile 芽孢储备液的计数结果，且在启动本方案前应确保多次芽孢计数结果具有一致性。若接种量计算错误，将导致小鼠接种剂量不准确。同样，依据该计算结果进行的 C. difficile 芽孢制备与稀释操作也必须谨慎执行，任何稀释误差均会导致起始芽孢接种量不准确。最后，应采取预防措施避免抗生素处理的对照组小鼠（未接种 C. difficile 芽孢）受到污染。经头孢哌酮处理的小鼠极易被 C. difficile 定植，因此不得与 C. difficile 感染小鼠直接接触28-30。若能充分注意上述关键步骤，则可预期成功建立艰难梭菌感染（CDI）小鼠模型。

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披露

作者们目前无任何披露事项。

致谢

作者谨此感谢威康信托桑格研究所的 Trevor Lawley 提供本论文中使用的 C. difficile R20291 孢子，以及北卡罗来纳州立大学兽医学院的 James S. Guy 提供的 Vero 细胞。动物组织病理学分析在北卡罗来纳大学教堂山分校的 LCCC 动物组织病理学核心设施完成，Traci Raley 和 Amanda Brown 提供了特别协助。LCCC 动物组织病理学核心设施的部分支持来自美国国家癌症研究所中心核心支持拨款（2P30CA016086-40），该拨款授予北卡罗来纳大学 Lineberger 综合癌症中心。我们还要感谢 Vincent Young、Anna Seekatz、Jhansi Leslie 和 Cassie Schumacher 就 Vero 细胞细胞毒性检测方案提供的有益讨论。JAW 由美国国立卫生研究院（NIH）资助的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖研究培训拨款 T32OD011130 支持。CMT 由美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）的代谢组学职业发展奖拨款 K01GM109236 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#62 Perisept 杀孢子消毒清洁剂 SSS Navigator48027该产品需按照制造商推荐进行稀释
0.22 μm 滤膜Fisherbrand09-720-3可用于 Vero 细胞检测中单个样品的滤板替代方案
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056使用前需在 37 °C 水浴中预热
0.4% 台盼蓝Gibco15250-061
1% 青霉素/链霉素Gibco15070-063
10% 热灭活胎牛血清Gibco16140-071使用前需在 37 °C 水浴中预热
1 ml 塑料注射器 BD Medical Supplies309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml 微量离心管带螺帽Corning430917
96 孔平底细胞培养板Costar CorningCL3595
96 孔滤膜板MilliporeMSGVS2210
粘性封口膜ThermoScientificAB-0558
Bacto 琼脂Becton Dickinson214010TCCFA 平板的组分之一（见下文）
Bacto 蛋白胨Becton Dickinson211684TCCFA 平板的组分之一（见下文）
头孢哌酮MP Bioworks199695
头孢西丁SigmaC47856TCCFA 平板的组分之一（见下文）
艰难梭菌抗毒素试剂盒Tech LabsT5000用作 Vero 细胞检测的对照
艰难梭菌毒素 AList Biological Labs152CVero 细胞检测的阳性对照
D-环丝氨酸SigmaC6880TCCFA 平板的组分之一（见下文）
蒸馏水Gibco15230
DMEM 1x 培养基Gibco11965-092使用前需在 37 °C 水浴中预热
果糖FisherL95500TCCFA 平板的组分之一（见下文）
血细胞计数板Bright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500TCCFA 平板的组分之一（见下文）
MgSO4（无水）SigmaM2643TCCFA 平板的组分之一（见下文）
Millex-GS 0.22 μm 滤器Millex-GSSLGS033SSTCCFA 平板用滤器 
Na2HPO4SigmaS-0876TCCFA 平板的组分之一（见下文）
NaClFisherS640-3TCCFA 平板的组分之一（见下文）
10 号一次性手术刀片Miltex, Inc4-410
PCR 板Fisherbrand14230244
塑料培养皿Kord-Valmark Brand2900
无菌塑料 L 形涂布棒Fisherbrand14-665-230
注射器推进器Dymax CorporationT15469
牛磺胆酸盐SigmaT4009TCCFA 平板的组分之一（见下文）
超纯蒸馏水Invitrogen10977-015
C57BL/6J 小鼠The Jackson Laboratory664小鼠年龄应为 5–8 周
Olympus BX43F 光学显微镜Olympus Life Science
DP27 相机Olympus Life Science
cellSens Dimension 软件 Olympus Life Science

参考文献

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头孢哌酮小鼠模型艰难梭菌感染细菌计数毒素细胞毒性组织病理学变化粪便样本采集芽孢接种物制备厌氧箱使用临床疾病监测菌落形成单位
经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291
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