De Novo 乳腺癌转移的临床前小鼠模型的外科手术操作与方法学

摘要

目前尚缺乏用于评估靶向乳腺癌转移的辅助治疗的临床前模型。为解决这一问题，我们建立了一种de novo肺部乳腺腺癌转移的小鼠模型，可在辅助治疗环境下（即原发肿瘤手术切除后）评估治疗手段对已播散至肺部的转移灶的作用效果。

摘要

乳腺腺癌转基因小鼠模型的一个关键限制因素是，乳腺组织中的原发性肿瘤负荷通常决定了研究的终点。因此，针对晚期从头发生转移机制的研究受到限制，评估辅助治疗背景下靶向转移介质的抗癌疗法有效性的研究也同样受限。已通过将显性癌蛋白特异性表达于乳腺上皮细胞，开发出多种小鼠乳腺癌模型，这些模型在不同程度上模拟了女性中常见的组织病理学和转录组定义的乳腺癌亚型¹。尽管利用这些模型已深入了解乳腺癌发生的生物学特性，但它们在鉴定调控晚期转移灶生长的分子方面的应用价值受到限制，因为小鼠通常因显著的原发性肿瘤负荷而在较早时间点被实施安乐死。此外，由于相当一部分被诊断为乳腺癌的女性患者在原发肿瘤手术切除后、在可检测到转移性疾病出现之前接受辅助治疗，因此迫切需要建立从头发生转移的临床前模型，作为评估旨在靶向转移病灶的新疗法的平台。为解决这些不足，我们建立了一种小鼠从头发生乳腺癌转移模型，在该模型中，原发性乳腺肿瘤被手术切除，随后在术后115天内逐步形成转移病灶。这种较长的潜伏期提供了一个可行的模型，可用于鉴定在缺乏原发性肿瘤的小鼠中调控转移进展的关键功能分子，同时也为评估旨在阻断促进转移性肿瘤存活与生长的关键功能分子的治疗药物的临床前疗效提供了模型平台。

引言

北美女性一生中患乳腺癌的风险约为12%²；其中大多数患者将通过手术切除原发肿瘤，并根据癌症亚型，在辅助治疗阶段接受靶向治疗、内分泌治疗、化疗和/或放疗³。例如，激素受体阳性癌症患者接受抗雌激素治疗，HER2阳性肿瘤患者接受针对HER2的靶向治疗联合放疗或化疗，而目前尚无针对三阴性肿瘤的有效靶向疗法³。尽管放疗、化疗、个体化治疗及激素治疗在手术切除后的辅助治疗中已取得进展，但仍有30%-70%的II期或III期乳腺癌患者出现疾病复发⁴，因为现有疗法在根除远处器官（如肺、骨、脑和/或肝）中的转移性疾病方面效果有限⁵。这一点尤为重要：当转移性疾病在原发肿瘤未复发的情况下出现时，提示恶性细胞可能在根治性手术时已扩散至其他器官。因此，迫切需要能够根除或延缓转移性肿瘤生长的治疗方法。

尽管 从头合成 乳腺癌发生的小鼠模型在揭示调控肿瘤进展机制方面提供了极为重要的信息¹，现有模型也存在若干局限性。其中之一是 从头合成 转基因模型通常会在多个乳腺中形成原发性肿瘤，原发性肿瘤负荷限制了研究的持续时间。尽管在这些模型中，原发性肿瘤细胞的逃逸和转移灶的播散可能在肿瘤发生早期即已出....

方案

以下方案中使用的动物由俄勒冈健康与科学大学 & 科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC），该委员会的设立旨在符合《动物福利法》规定及公共卫生服务（PHS）政策要求。

维持无菌条件：应使用灭菌器械，且在不同小鼠之间操作时，需用无菌纱布擦拭干净，用 PBS 冲洗，再用 70% 乙醇消毒剂灭菌至少 15 分钟。进行存活手术时，应佩戴外科帽、口罩、手术服和手套。存活手术前对动物的术前准备包含在以下方案中。有关试剂和设备的列表，请参见表 1。

1. 原发性乳腺肿瘤中单细胞悬液的分离与制备

1. 将100日龄的转基因MMTV-PyMT（FVB/n）雌性供体小鼠麻醉，并通过麻醉面罩持续给予2%异氟烷以维持麻醉状态。通过检测足部夹捏反射消失来确认小鼠已充分麻醉。
2. 在无菌条件下，使用无菌剪刀将100日龄转基因雌性MMTV-PyMT（FVB/n）小鼠的原发性乳腺肿瘤从覆盖的皮肤及周围脂肪组织和/或淋巴结中分离并切除。通过颈椎脱位法处死已麻醉的小鼠。
3. 使用无菌剪刀或手术刀将原发性肿瘤手动剪切成小块（约1.0 mm³）。将肿瘤组织块置于含有3.0 mg/mL胶原酶A和4.0 U/mL DNase I的DMEM溶液中。每直径1.0 cm的肿瘤使用约10 mL上述消化液。
   1. 在无菌的25 mL瓶中加入....

结果

在接受来自 MMTV-PyMT 小鼠原发性乳腺肿瘤的 1 × 10⁶ 个细胞后，超过 75% 的受体小鼠在 38 至 60 天内发展出单个乳腺腺癌，肿瘤大小范围为 172 至 450 mm³（数据未显示）。符合随机分组条件的小鼠在手术切除原发性肿瘤后被纳入研究分组，如（图 1C）所示。在手术切除原发性肿瘤的小鼠中，原发性肿瘤再生长的发生率低于 2%（补充 图 1）。通过本方案评估的受体小鼠中，有 45% 在肿瘤切除后第 115 天时经组织学检查可检测到转移灶（图 1B）。为确认苏木精-伊红（H&E）染色鉴定出的转移细胞区域的组织学特征，采用相邻组织切片进行 PyMT PCR 检测（数据未显示）。

讨论

修改与故障排除：

在钝性分离腹壁肿瘤时，肿瘤可能仍与腹壁粘连。在接受肿瘤注射的小鼠中，这种情况的发生率低于<5%（数据未显示）。对于肿瘤与腹壁粘连的小鼠，应实施安乐死，因为在此情况下难以进行完整切除，且易导致原发肿瘤再生。

模型/技术的局限性：

尽管其他研究者曾报道，在将来源于MMTV-PyMT小鼠的乳腺终末导管芽移植回体内后，除肺脏外，肝脏、肾脏、脾脏和脑中亦可检测到荧光标记的单个转移性细胞⁷，但除肺脏外，我们仅观察到若干小鼠肝脏中存在转移灶，其外显率尚待确定。其他可能的转移部位，如淋巴结、脾脏、骨骼和脑，未进行评估。该技术的局限性还包括手术部位剃毛后出现术后皮肤擦伤和感染。因此，手术部位的无菌处理仅限于使用70%乙醇消毒，随后应用聚乙烯吡咯烷酮-碘（Poly(vinylpyrrolidone)-Iodine）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Piramal Healthcare	N/A	处方订购
胶原酶A	Roche	11088793001
脱氧核糖核酸酶I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex 瓶	Sigma-Aldrich	CLS139525
胎牛血清	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm 尼龙滤网	Corning	352350
50 mL 锥形管	VWR	89039-658
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
生长因子减少型Matrigel	BD	354230	从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的生长因子减少型可溶性基底膜制剂
聚（乙烯吡咯烷酮）–碘复合物	Sigma-Aldrich	PVP1
29号针头 0.3 mL 胰岛素注射器	BD	324702
小血管电凝器套装	FST	18000-00
伤口夹	Texas Scientific	205016
AutoClip 伤口夹施加器	BD	427630
AutoClip 伤口夹移除器	BD	427637
溴脱氧尿苷	Roche	10280879
肝素化毛细管	Fisher	22362566
含二钾EDTA的Microtainer管	BD	365974
20 mL 注射器	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT冷冻介质	VWR	25608930
10%磷酸盐缓冲福尔马林	Fisher	SF100-4
23g 针头	Fisher	14-826-6B
FVB/n 小鼠	Jackson Laboratories	001800