目前尚缺乏用于评估靶向乳腺癌转移的辅助治疗的临床前模型。为解决这一问题，我们建立了一种de novo肺部乳腺腺癌转移的小鼠模型，可在辅助治疗环境下（即原发肿瘤手术切除后）评估治疗手段对已播散至肺部的转移灶的作用效果。
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摘要
摘要
乳腺腺癌转基因小鼠模型的一个关键限制因素是，乳腺组织中的原发性肿瘤负荷通常决定了研究的终点。因此，针对晚期从头发生转移机制的研究受到限制，评估辅助治疗背景下靶向转移介质的抗癌疗法有效性的研究也同样受限。已通过将显性癌蛋白特异性表达于乳腺上皮细胞，开发出多种小鼠乳腺癌模型，这些模型在不同程度上模拟了女性中常见的组织病理学和转录组定义的乳腺癌亚型1。尽管利用这些模型已深入了解乳腺癌发生的生物学特性，但它们在鉴定调控晚期转移灶生长的分子方面的应用价值受到限制，因为小鼠通常因显著的原发性肿瘤负荷而在较早时间点被实施安乐死。此外，由于相当一部分被诊断为乳腺癌的女性患者在原发肿瘤手术切除后、在可检测到转移性疾病出现之前接受辅助治疗，因此迫切需要建立从头发生转移的临床前模型，作为评估旨在靶向转移病灶的新疗法的平台。为解决这些不足，我们建立了一种小鼠从头发生乳腺癌转移模型，在该模型中，原发性乳腺肿瘤被手术切除，随后在术后115天内逐步形成转移病灶。这种较长的潜伏期提供了一个可行的模型，可用于鉴定在缺乏原发性肿瘤的小鼠中调控转移进展的关键功能分子，同时也为评估旨在阻断促进转移性肿瘤存活与生长的关键功能分子的治疗药物的临床前疗效提供了模型平台。
引言
北美女性一生中患乳腺癌的风险约为12%2；其中大多数患者将通过手术切除原发肿瘤，并根据癌症亚型，在辅助治疗阶段接受靶向治疗、内分泌治疗、化疗和/或放疗3。例如，激素受体阳性癌症患者接受抗雌激素治疗，HER2阳性肿瘤患者接受针对HER2的靶向治疗联合放疗或化疗，而目前尚无针对三阴性肿瘤的有效靶向疗法3。尽管放疗、化疗、个体化治疗及激素治疗在手术切除后的辅助治疗中已取得进展，但仍有30%-70%的II期或III期乳腺癌患者出现疾病复发4，因为现有疗法在根除远处器官（如肺、骨、脑和/或肝）中的转移性疾病方面效果有限5。这一点尤为重要：当转移性疾病在原发肿瘤未复发的情况下出现时，提示恶性细胞可能在根治性手术时已扩散至其他器官。因此，迫切需要能够根除或延缓转移性肿瘤生长的治疗方法。
尽管 从头合成 乳腺癌发生的小鼠模型在揭示调控肿瘤进展机制方面提供了极为重要的信息1，现有模型也存在若干局限性。其中之一是 从头合成 转基因模型通常会在多个乳腺中形成原发性肿瘤，原发性肿瘤负荷限制了研究的持续时间。尽管在这些模型中，原发性肿瘤细胞的逃逸和转移灶的播散可能在肿瘤发生早期即已出现，但明显的转移性肿瘤的形成较晚，且根据小鼠模型和品系背景的不同，转移往往仅为部分外显。1这进一步限制了其应用价值 从头合成 用于发现调控继发器官转移的分子模型，以及评估辅助治疗条件下治疗药物的临床前疗效。
为了克服这些局限性，我们开发了一种 从头合成 自发性乳腺癌肺转移模型。亲本转基因雌性小鼠（即，FVB/n品系背景的MMTV-PyMT，用于本文所述晚期阶段研究 从头合成 乳腺肿瘤的年龄约为100天6，此时其原发肿瘤通过手术切除，并经酶消化处理解离为单细胞悬液。将悬液（1 × 10⁶）6 细胞）随后被原位移植到6-7周龄的同系雌性受体小鼠体内，在38至60天内形成单一的原发性乳腺肿瘤（图1A）。在确定的肿瘤大小（172 至 450 mm）时3），受体小鼠接受麻醉后，通过手术切除原发肿瘤，以尽量减少手术部位的肿瘤再生，该操作与女性患者的手术方式一致补充图1在FVB/n品系背景下，小鼠在术后约115天时肺部出现组织学可检测的转移灶，外显率为45%。图1B由于转移性肿瘤生长的潜伏期延长，该模型特别适用于辅助治疗的给药，以及阐明和评估原发性肿瘤切除术后影响转移进展的潜在生物学机制。
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方案
以下方案中使用的动物由俄勒冈健康与科学大学 & 科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC），该委员会的设立旨在符合《动物福利法》规定及公共卫生服务（PHS）政策要求。
维持无菌条件：应使用灭菌器械，且在不同小鼠之间操作时，需用无菌纱布擦拭干净，用 PBS 冲洗，再用 70% 乙醇消毒剂灭菌至少 15 分钟。进行存活手术时，应佩戴外科帽、口罩、手术服和手套。存活手术前对动物的术前准备包含在以下方案中。有关试剂和设备的列表，请参见表 1。
1. 原发性乳腺肿瘤中单细胞悬液的分离与制备
- 将100日龄的转基因MMTV-PyMT（FVB/n）雌性供体小鼠麻醉，并通过麻醉面罩持续给予2%异氟烷以维持麻醉状态。通过检测足部夹捏反射消失来确认小鼠已充分麻醉。
- 在无菌条件下，使用无菌剪刀将100日龄转基因雌性MMTV-PyMT（FVB/n）小鼠的原发性乳腺肿瘤从覆盖的皮肤及周围脂肪组织和/或淋巴结中分离并切除。通过颈椎脱位法处死已麻醉的小鼠。
- 使用无菌剪刀或手术刀将原发性肿瘤手动剪切成小块（约1.0 mm3）。将肿瘤组织块置于含有3.0 mg/mL胶原酶A和4.0 U/mL DNase I的DMEM溶液中。每直径1.0 cm的肿瘤使用约10 mL上述消化液。
- 在无菌的25 mL瓶中加入无菌搅拌子，在约125 rpm、37 °C条件下孵育40分钟进行消化。
- 加入胎牛血清（FBS）至终浓度10%以终止消化反应，并将整个混合物置于湿冰上保存。
- 将消化后的肿瘤悬液通过0.7 µm尼龙滤网过滤至50 mL锥形管中，弃去滤网上残留的未消化组织。在4 °C条件下以300 x g离心收集上清液。
- 每1.0 cm肿瘤组织用10 mL DMEM重悬沉淀，并再次通过0.7 µm尼龙滤网过滤。计数细胞浓度后，在4 °C条件下以300 x g离心。
- 将细胞沉淀以含10%二甲基亚砜和90% FBS的溶液重悬，调整浓度为2 x 107个活细胞/mL。将原发性肿瘤的单细胞悬液于-80 °C保存。
2. 乳腺肿瘤的原位注射
- 将冷冻的原发肿瘤悬液在 37 °C 下部分解冻，直至冻存沉淀物可从冻存管中释放至 20 mL DMEM 中，然后计数细胞。在 4 °C 下以 300 × g 离心，将细胞重悬于 DMEM 与生长因子减少型可溶性基底膜提取物（来源于 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤）的 1:1 混合液中，细胞浓度为 1 × 107 个细胞/mL（参见材料表）。
- 将麻醉后的同系雌性受体小鼠仰卧固定，并通过麻醉面罩持续给予 2% 异氟烷以维持麻醉状态。
- 使用喷雾型 70% 乙醇对右侧第4对乳腺注射部位进行消毒，并用无菌棉签涂抹聚乙烯吡咯烷酮-碘（Poly(vinylpyrrolidone)-Iodine）。
- 使用 29 G 0.3 mL 胰岛素注射器，将 100 µL（含 1 × 106 个来自冷冻原发肿瘤悬液的活细胞）自针尖斜面朝上注入 6 至 10 周龄 FVB/n 雌性小鼠未剥离的右侧第4对乳腺中。
3. 原位乳腺肿瘤的手术切除
- 在肿瘤细胞注射后38至60天，对未表现出原位肿瘤体积在172至450 mm³范围内的小鼠实施安乐死。3 体积 [长 ×（宽2)/2]（约75%的注射小鼠）。
- 将麻醉后肿瘤大小合适的小鼠置于仰卧位，在麻醉面罩下持续给予2%异氟烷以维持麻醉状态，并通过脚趾夹捏反射消失确认小鼠已充分麻醉。麻醉期间在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，以防角膜干燥。
- 用70%乙醇喷洒以消毒原发肿瘤周围的手术区域，然后用无菌棉签涂抹聚乙烯吡咯烷酮-碘。
注意：约5%的小鼠在手术部位脱毛后出现皮肤擦伤和/或感染，因此该步骤已取消（数据未显示）。 - 如图所示 图1C在肿瘤的内侧偏尾部，使用钝头剪刀做初始皮肤切口。
- 接下来，进行皮肤的上方切除（图1C在肿瘤内侧进行操作。在延长切口前，注意电凝位于皮肤上为肿瘤供血的任何血管。
- 沿肿瘤外侧继续做皮肤切口（位于肿瘤后方），然后在肿瘤外侧做上方皮肤切缘，在肿瘤上方做内侧切缘图1C).
- 在肿瘤周围环形切除皮肤后（图1C用镊子提起附着在肿瘤上的皮肤，同时用钝性分离法将肿瘤从腹壁肌肉组织上分离，注意保持乳腺组织完整。
- 通过钝性解剖识别并电凝穿过第4区的较大血管th 和 5th 乳腺
- 切除约一半的 4th 和 5th 在烧灼部位分离乳腺组织，以游离肿瘤、覆盖的皮肤及乳腺组织的节段（图1C).
- 若发生出血，应识别活动性出血的血管并立即进行灼烧止血。若失血量超过250 µL，应将小鼠排除出实验并实施安乐死。
- 使用伤口缝合器以伤口夹闭合切口部位图1C).
注意：术后10天使用伤口夹去除器拆除伤口夹。 - 皮下注射温热的无菌生理盐水（剂量为动物体重的4%），并使用加热灯保持动物体温。在动物从麻醉中恢复期间，每5-10分钟检查一次。
注意：术后给予布比卡因或利多卡因均会增加死亡率（数据未显示）。术后1小时出现疼痛症状（弓背、不愿移动、无法理毛）的小鼠被实施安乐死。- 小鼠完全恢复后，将其放回与其他小鼠同居的笼中。
4. 用于流式细胞术和组织学的血液与肺组织的分离和处理
- 在实验终点时，可根据需要对小鼠进行多种组织病理学评估。在安乐死前90分钟，向每只小鼠腹腔注射溴脱氧尿苷（BrdU，50 µg/g 小鼠体重），浓度为6.25 µg/µL，溶于1x PBS中。
注意：溴脱氧尿苷溶解后制成的冻存液需在制备后1个月内使用。 - 安乐死前10分钟，在小鼠麻醉状态下采集眶后血（>使用肝素化毛细管采集500 µL血液，随后转移至预置冰上的含二钾乙二胺四乙酸（dipotassium EDTA）涂层试管中。
- 为去除肺脏和残留的乳腺组织，使用剪刀从下腹部至口腔沿中线做一剪口，以暴露胸腔和腹膜腔（图2A），并向外侧剥离皮肤，以暴露右侧剩余的4个th 和 5th 乳腺
- 切除剩余的乳腺组织，并通过连续切片的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织进行苏木精-伊红（H&E）染色检查，以排除原发肿瘤复发。&E) 染色（补充材料 图1).
- 用剪刀从腹壁切开至膈肌以取出肺脏，然后通过剪断腹主动脉放血处死动物，再进行肺脏灌注图2B-2C).
- 从腹部入路沿肋骨切开膈肌，注意避免损伤肺和心脏。随后，通过切开肋骨 cage 的侧面暴露胸腔。图2D).
- 使用23号针头连接20 mL注射器，经右心室以约10 mL/min的速度向肺部灌注约5.0 mL DPBS，直至肺组织完全变白（图2E-2F立即从主血管处切断心脏，以防止血液重新灌注到肺部。
- 将约1.0 mL 4 °C的10%福尔马林通过23号针头注入暴露的气管，切面朝上，朝向肺组织，以进行组织固定和后续组织病理学评估图2G-2H）。一旦肺部完全扩张并充满固定液，即停止注射（图 2I).
- 从气管处切除肺叶，并将肺组织浸入中性缓冲福尔马林中进行固定，随后根据标准组织病理学操作流程进行石蜡包埋或OCT冷冻介质包埋。
- 通过连续切片法对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织进行切片，定量评估肺部转移负荷，并对微切片（100 µm，共十三个切片）进行H染色评估&E 染色（图1B).
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结果
在接受来自 MMTV-PyMT 小鼠原发性乳腺肿瘤的 1 × 106 个细胞后，超过 75% 的受体小鼠在 38 至 60 天内发展出单个乳腺腺癌，肿瘤大小范围为 172 至 450 mm3（数据未显示）。符合随机分组条件的小鼠在手术切除原发性肿瘤后被纳入研究分组，如（图 1C）所示。在手术切除原发性肿瘤的小鼠中，原发性肿瘤再生长的发生率低于 2%（补充 图 1）。通过本方案评估的受体小鼠中，有 45% 在肿瘤切除后第 115 天时经组织学检查可检测到转移灶（图 1B）。为确认苏木精-伊红（H&E）染色鉴定出的转移细胞区域的组织学特征，采用相邻组织切片进行 PyMT PCR 检测（数据未显示）。
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讨论
修改与故障排除：
在钝性分离腹壁肿瘤时，肿瘤可能仍与腹壁粘连。在接受肿瘤注射的小鼠中，这种情况的发生率低于<5%（数据未显示）。对于肿瘤与腹壁粘连的小鼠，应实施安乐死，因为在此情况下难以进行完整切除，且易导致原发肿瘤再生。
模型/技术的局限性：
尽管其他研究者曾报道，在将来源于MMTV-PyMT小鼠的乳腺终末导管芽移植回体内后，除肺脏外，肝脏、肾脏、脾脏和脑中亦可检测到荧光标记的单个转移性细胞7，但除肺脏外，我们仅观察到若干小鼠肝脏中存在转移灶，其外显率尚待确定。其他可能的转移部位，如淋巴结、脾脏、骨骼和脑，未进行评估。该技术的局限性还包括手术部位剃毛后出现术后皮肤擦伤和感染。因此，手术部位的无菌处理仅限于使用70%乙醇消毒，随后应用聚乙烯吡咯烷酮-碘（Poly(vinylpyrrolidone)-Iodine）。
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披露
作者声明无任何与本文所述数据相关的利益冲突。
致谢
作者感谢 Jo Hill 在组织病理学方面的协助，John Gleysteen 博士在手术技术方面的指导，Tessa Diebel 在视频拍摄方面的协助，Wong 和 Coussens 实验室所有成员提供的宝贵见解和讨论，以及俄勒冈健康与科学大学奈特癌症研究所提供的经费支持。本研究获得了以下资助：CEG 获得 T32GM071388-10 和 T32CA106195-11 项目的支持，以及美国国家癌症研究所（NCI/NIH）、美国国防部乳腺癌研究项目、Susan G Komen 基金会、乳腺癌研究基金会的资助；LMC 获得“Stand Up To Cancer - Lustgarten 基金会胰腺癌融合梦想团队转化研究基金”（SU2C-AACR-DT14-14）的支持；MHW 获得女性健康捐赠圈基金会奖项的支持；MHW 和 LMC 获得 Brenden-Colson 胰腺健康中心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | N/A | 处方订购 |
| 胶原酶A | Roche | 11088793001 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex 瓶 | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm 尼龙滤网 | Corning | 352350 | |
| 50 mL 锥形管 | VWR | 89039-658 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 生长因子减少型Matrigel | BD | 354230 | 从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的生长因子减少型可溶性基底膜制剂 |
| 聚（乙烯吡咯烷酮）–碘复合物 | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29号针头 0.3 mL 胰岛素注射器 | BD | 324702 | |
| 小血管电凝器套装 | FST | 18000-00 | |
| 伤口夹 | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip 伤口夹施加器 | BD | 427630 | |
| AutoClip 伤口夹移除器 | BD | 427637 | |
| 溴脱氧尿苷 | Roche | 10280879 | |
| 肝素化毛细管 | Fisher | 22362566 | |
| 含二钾EDTA的Microtainer管 | BD | 365974 | |
| 20 mL 注射器 | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT冷冻介质 | VWR | 25608930 | |
| 10%磷酸盐缓冲福尔马林 | Fisher | SF100-4 | |
| 23g 针头 | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n 小鼠 | Jackson Laboratories | 001800 |
参考文献
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- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
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