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在线尺寸排阻与离子交换色谱在SAXS光束线上的应用

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DOI：

10.3791/54861

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2017年1月5日

 ,  , 
1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale

本文内容

摘要

通过小角X射线散射（SAXS）测定蛋白质溶液结构需要单一分散的样品。本文介绍了两种可最大限度缩短样品制备与数据采集之间延迟的方法：在线尺寸排阻色谱（SEC）和在线离子交换色谱（IEC）。

摘要

生物小角X射线散射（BioSAXS）是分子与结构生物学中一种强大的技术，用于测定大分子在溶液中的结构、颗粒尺寸与形状以及表面积与体积比。该技术适用于多种溶液条件，涵盖广泛的浓度、pH值、离子强度、温度和添加剂等变量。 等等。但样品需为单分散体系。这一限制促使了在SAXS光束线上集成液相色谱系统。本文介绍了在光束线上游整合尺寸排阻色谱（SEC）和离子交换色谱（IEC）的方法，以及最优背景扣除和数据约简的不同策略。以痘苗病毒关键蛋白D5的一个片段（包含D5N解旋酶结构域）为例，说明如何应用SEC-SAXS和IEC-SAXS技术。我们确定了该蛋白的整体构型和分子量，揭示其呈六聚体结构。

引言

生物小角X射线散射（BioSAXS）是一种用于确定纳米级物体形状的有力工具1-4在含有纳米尺度大分子的溶液中，于极低角度记录X射线的散射信号。该角度范围内的散射信息包含有关大分子整体结构的参数，如回转半径、粒子内部最大距离、粒子形状以及折叠程度、变性状态或无序程度。该技术无需晶体样品，大分子保持在溶液状态，因而可在接近细胞内重要参数（如离子强度、pH值）的条件下进行研究。 等等。 了解这些因素可能有助于确定目标蛋白的生理相关寡聚状态，或验证所提出的复合物模型。在不同缓冲条件下表征蛋白质-蛋白质相互作用、构建缺失结构域的模型、优化同源建模结果，以及确定明确的折叠与去折叠状态，均可快速且简便地完成5.

与任何技术一样，生物小角X射线散射（BioSAXS）具有内在的局限性：聚集或变性的样品、颗粒混合物、非均质样品、辐射损伤以及缓冲液不匹配都可能导致数据无法解释。对于许多分析方法而言，通常默认假设样品是单分散的，而这一要求在实际中往往难以实现。在很多情况下，样品的降解较为轻微，仅凭数据本身难以察觉，任何对数据的解读尝试都可能得出不准确甚至误导性的结果。为克服这些障碍，许多光束线已将尺寸排阻色谱（SEC）与SAXS联用，以确保数据质量，并使该技术能够更广泛地应用于日益复杂的样品6-11。最近，我们开发了在线离子交换色谱（IEC）与SAXS联用的新方法，进一步丰富了技术手段12。这两种技术均使SAXS得以应用于过去无法分析的多种生物颗粒。具体选择哪种方法取决于目标颗粒的生物物理特性。

凝胶过滤层析根据大分子的大小进行分离，通常需要其表观分子质量至少存在10%的差异才能实现分离。此外，层析柱的物理限制以及样品的生理特性（如疏水表面、分子柔性及缺乏稳定性）也会使数据的采集、分析和解释变得复杂。

离子交换色谱法根据分子的电荷及其与离子交换色谱柱的结合亲和力进行分离，可替代或与尺寸排阻色谱法联用。通过调节缓冲液的pH值或盐浓度，可轻易改变分子的总电荷，从而提供一种相对简单的方法，实现分子从离子交换色谱柱的可控洗脱。利用电荷差异，即使分子类型和大小相似（原本难以分离），也可常规地通过离子交换色谱法实现分离。此外，离子交换色谱法具有能够直接处理稀释样品的优势，从而避免了可能导致蛋白质变性的浓缩步骤。然而，由于电荷分布高度依赖于样品本身，离子交换色谱法需针对pH值和盐浓度进行优化13,14。

对于许多难以表达或纯化或两者兼有的蛋白质，可用于研究的样品量通常很少。因此，提高效率并尽量减少纯化步骤以降低样品损失至关重要。基于这一原因，最后一步纯化在SAXS数据采集前直接在线进行，以提高获得高质量数据集的可能性。

本文介绍并比较了在线尺寸排阻色谱-小角X射线散射（SEC-SAXS）和离子交换色谱-小角X射线散射（IEC-SAXS）两种技术。这两种技术均在法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射设施（ESRF）BioSAXS光束线BM29上实现15。作为测试案例，我们采用了痘苗病毒蛋白D5的D5N结构域及其解旋酶结构域，该蛋白此前使用其他方法进行结构分析较为困难。痘苗病毒属于痘病毒科（Poxviridae），其基因组与引起天花的天花病毒有98%的同源性。通过痘苗病毒系统，我们研究其复制机制，重点关注其中关键的解旋酶-引物酶D5。

D5 是一种分子量为 95-kDa 的蛋白质，其N端包含一个古细菌-真核生物引物酶（AEP）结构域16，随后是一个半胱氨酸富集区（残基 240-345）16。从N端向C端方向继续延伸，接下来是D5N结构域（残基 340-460），该结构域始终与D5型解旋酶相关，最后是超家族3（SF3）解旋酶结构域（残基 460-785）17（图1A）。D5的解旋酶结构域可形成六聚体环状结构，这对于与DNA的紧密结合至关重要。得益于近期的SAXS和电镜研究，引物酶结构域和解旋酶结构域的低分辨率结构目前已得到解析18。

本文展示了如何在 ESRF 的 BioSAXS 光束线 BM29 上使用已实现的在线色谱技术，以研究 D5 蛋白 C 末端片段（残基 323-785）的结构特征。

方案

1. D5缺失蛋白的离线制备与样品生成描述

注意：D5323-785 构建体（图1A）的克隆、表达和纯化步骤如文献18所述。

  1. 将构建体克隆至 pProEx HTb 载体中
    1. 以 D5R 为模板，使用引物 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3' 和 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'，在聚合酶及 PCR 反应混合液中进行聚合酶链式反应（PCR），操作步骤遵循制造商建议。
    2. 使用离心柱纯化 PCR 片段，操作步骤遵循制造商建议。
    3. 使用 NcoI 和 HindIII 限制性内切酶对 PCR 片段和质粒进行酶切，缓冲液组成和孵育时间遵循制造商推荐条件。
    4. 在 0.5x TAE 缓冲液（20 mM Tris，10 mM 乙酸，0.5 mM EDTA）中，将片段在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并用 DNA 染料染色。
    5. 将凝胶暴露于紫外光下。
      注意：请佩戴个人防护装备！切下酶切后的 PCR 片段和酶切质粒的条带，使用凝胶纯化离心柱试剂盒纯化 DNA，操作步骤遵循制造商建议。
    6. 使用快速连接试剂盒将纯化的 PCR 片段连接至质粒中，操作步骤遵循制造商建议。
    7. 通过热激法将连接反应产物转化至适用于质粒扩增的感受态细菌中。
      1. 将一半连接产物加入细菌管中。
      2. 将反应管置于冰上孵育 20 分钟。
      3. 在 42 °C 下孵育 30 秒。
      4. 将管重新置于冰上 2 分钟。
      5. 加入 1 mL 无抗生素的 Luria Bertani（LB）肉汤（Miller），于 37 °C 恢复培养 1 小时。
      6. 在台式微量离心机中以 16,100 x g 离心 3 秒，沉淀细胞并弃去大部分培养基。
      7. 将细胞涂布于含氨苄青霉素（终浓度 50 µg/mL）的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养至菌落形成。
    8. 挑取单个菌落接种至 3 mL 含氨苄青霉素（终浓度 50 µg/mL）的 LB 培养基中，于 37 °C、160 rpm 振荡过夜培养。
    9. 按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒 DNA。
    10. 送样进行测序，分析序列以确认无突变且插入正确。
    11. 将 pProEx HTb D5323-785 构建体转化至适用于蛋白表达的工程菌中（使用 1 µL 质粒，操作步骤参照步骤 1.1.7）。将菌液涂布于含氨苄青霉素（终浓度 50 µg/mL）的 LB 琼脂平板上。
    12. 为制备起始培养物，挑取单个菌落接种至 300 mL 含氨苄青霉素（终浓度 50 µg/mL）的 LB 培养基中，于 37 °C、160 rpm 振荡过夜培养。
  2. 将 12 份各 1 L 的 LB 培养基（含终浓度 50 µg/mL 氨苄青霉素）分别接种 20 mL pProEx HTb D5323-785 菌种培养物，于 37 °C 培养至 OD600 = 0.3。随后将温度降至 18 °C，当 OD600 达到 0.5 时，加入 1 mM IPTG 诱导表达。继续在 18 °C、160 rpm 条件下振荡培养过夜。
  3. 在 4 °C 条件下以 50,000 x g 离心 30 分钟收集菌体。将菌体沉淀重悬于约 150 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，5 mM MgCl2，10 mM β-巯基乙醇，10% 甘油）中，加入 1x 蛋白酶抑制剂和 25 单位（U）/10 mL DNase。在冰上进行超声破碎（1 英寸探头，50% 功率，0.5 秒脉冲，0.5 秒间隔，重复 3 次，每次 5 分钟）。
  4. 将上清液上样至镍亲和层析柱（Ni-柱，1.5 mL 柱床体积），依次用 10 柱体积（CV）结合缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，10 mM β-巯基乙醇，10% 甘油）、10 CV 洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7]，1 M NaCl，10 mM β-巯基乙醇，10% 甘油）和 10 CV 咪唑洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，10 mM β-巯基乙醇，10% 甘油，30 mM 咪唑）洗涤。最后用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，10 mM β-巯基乙醇，10% 甘油，200 mM 咪唑）洗脱 D5323-785 蛋白。
  5. 通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测各纯化步骤。
    1. 取各纯化步骤的流穿液 2–20 µL，与 1x 上样染料（2x：4% SDS，20% 甘油，120 mM Tris-HCl [pH 6.8]，0.02% w/v 溴酚蓝）混合后，上样至 10% SDS 凝胶，在 1x Laemmli 电泳缓冲液（25 mM Tris，0.192 M 甘氨酸，0.1% SDS）中以 200 V 电泳。
    2. 使用即用型考马斯亮蓝溶液染色凝胶。
  6. 使用脱盐柱，按照制造商说明书将洗脱蛋白的缓冲液置换为结合缓冲液。
  7. 向蛋白溶液中加入Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase（TEV 蛋白酶，每 100 mg 蛋白加入 1 mg）以切除 His 标签。室温孵育过夜。
  8. 通过 SDS-PAGE 检测酶切效果（参见步骤 1.5）。
  9. 用结合缓冲液平衡 Ni-柱。将蛋白溶液过柱，并用 2 CV 咪唑洗涤缓冲液洗涤树脂，同时收集流穿液。
  10. 使用离心浓缩装置将蛋白浓缩至终体积 0.5 mL。
  11. 将浓缩后的蛋白样品上样至预先用凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，10% 甘油，1 mM 二硫苏糖醇 [DTT]）平衡的凝胶过滤层析柱。
  12. 以 0.5 mL 为单位收集流穿液组分。
  13. 通过 SDS-PAGE 检测主峰组分中蛋白的存在及纯度（参见步骤 1.5）。
  14. 合并 D5323-785 洗脱峰的组分。在保持 Tris 和 DTT 浓度不变的前提下，将样品稀释至 25 mM NaCl 和 5% 甘油（例如：对于 5 mL 含 20 mM Tris-HCl [pH 7]、150 mM NaCl、10% 甘油和 1 mM DTT 的蛋白溶液，先加入 5 mL 20 mM Tris-HCl [pH 7] 和 1 mM DTT，再加入 20 mL 20 mM Tris-HCl [pH 7]、5% 甘油和 1 mM DTT）。
  15. 将样品上样至离子交换层析柱。使用缓冲液 A（20 mM Tris [pH 7]，25 mM NaCl，5% 甘油，1 mM DTT）和缓冲液 B（20 mM Tris [pH 7]，1 M NaCl，5% 甘油，1 mM DTT）建立从 25 mM 至 1 M 的盐梯度进行洗脱。
  16. 以 1.5 mL 为单位收集洗脱组分。
  17. 通过 SDS-PAGE 检测主峰组分中蛋白的存在及纯度（参见步骤 1.5 和 图 1B）。
  18. 使用离心浓缩装置将蛋白溶液再次浓缩至终体积 0.5 mL。
  19. 将浓缩后的蛋白再次上样至凝胶过滤层析柱，使用凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7]，150 mM NaCl，5% 甘油，1 mM DTT；参见步骤 1.11）进行二次纯化。

2. 数据采集

注意：请尽早申请机时。对于欧洲同步辐射装置（ESRF），有关可用的访问类型以及如何提交申请的指南，请访问：
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying。在提案获得批准并收到实验邀请后，所有参与者均须完成安全培训。培训通过后，需通过 ESRF 用户门户填写“A 表格”，申报参与实验的科研人员及样品所需的安全信息。请与本地联系人联系以讨论实验细节。

  1. SEC-SAXS 数据采集
    注意：对于在线纯化，请使用安装在 BM29 上的高效液相色谱（HPLC）系统。该系统包括在线脱气装置、二元泵、用于缓冲液选择和梯度的阀门、自动进样器、紫外-可见光阵列光谱仪和电导率计。它直接连接到 SAXS 暴露单元的流通毛细管19。
    1. 预留 1 mL 凝胶过滤缓冲液。将缓冲液瓶连接至 SEC 系统（默认为 A 口）。
    2. 根据所用色谱柱选择流速。注意：本实验所用尺寸排阻色谱柱的流速为 0.1 mL/min。设定色谱柱的最大压力，记录背压，并将采集时间设为至少 1.2 CV。
    3. 通过 "自动冲洗" 功能冲洗泵和上游管路。
    4. 等待系统充满缓冲液后连接色谱柱。用至少 1.5 CV 的缓冲液平衡色谱柱。
    5. 锁定实验舱，使用样品更换器测量步骤 2.1.1 中预留的缓冲液，以检测因辐射损伤引起的信号变化。仅当缓冲液无辐射损伤时方可继续。
    6. 将光束线控制系统切换至 HPLC 模式。进行缓冲液的测试运行，采集 200 帧数据，每帧 1 秒。记录探测器在总强度图中给出的计数数量。
      注意：信号应与先前测量的缓冲液一致，且随时间变化的总强度应保持恒定。若信号不一致或不稳定，则需更长时间平衡系统。
    7. 将样品在台式微量离心机中以 13,000 × g 离心至少 10 分钟。
    8. 将样品装入提供的 HPLC 兼容玻璃小瓶中，并放入自动进样器。记录孔位位置。
    9. 按照用户安全培训中说明的标准程序，锁定实验舱。
    10. 登录光束线控制软件，并创建用于数据存储的文件夹。
    11. 使用 "快速批处理" 功能编程 HPLC 系统。将紫外数据的存储位置设为步骤 2.1.10 中创建的文件夹。确保激活紫外数据的自动 ASCII 转换，并将 ASCII 文件保存在同一文件夹中。
      1. 选择进样体积和孔位。通过点击 "开始" 按钮将测量任务加入队列。软件将提示保存批处理任务。请做好保存准备，但不要点击 "保存" 按钮，因为这会自动启动测量。
    12. 在光束线控制软件中设置数据采集参数。选择帧数，使总数据采集时间略长于步骤 2.1.2 中定义的采集时间。
    13. 打开安全快门，使用光束线控制软件开始 SAXS 数据采集。确认数据正确采集。将新采集的数据与步骤 2.1.6 中采集的数据进行比较，检查总强度中的计数在至少 100 帧内保持恒定，并与步骤 2.1.6 的数值一致。
      1. 通过点击步骤 2.1.11 中准备好的 "保存" 按钮启动 SEC 运行，并在进样完成且紫外数据采集开始时，记录 camserver 软件中显示的帧号。
    14. 数据采集完成后，打开 ISPyB 数据库20，进入 "数据采集" 选项卡，点击 "前往" 按钮，访问数据集及自动分析结果21。
  2. IEC-SAXS 数据采集
    注意：在离子交换色谱（IEC）实验中，不采用常见的连续线性梯度，而应使用逐步梯度，即缓冲液 B 的比例按预设的离散步骤递增。
    1. 为无样品的缓冲液运行创建 HPLC 程序。设定一个逐步梯度，从 0% 缓冲液 B 开始，每 2 CV 增加 5 个百分点，直至达到 100% 缓冲液 B。
    2. 预留部分每种缓冲液。将低盐缓冲液 A 瓶连接至 A 口，高盐缓冲液 B 瓶连接至 B 口。
    3. 选择流速，并确保低于色谱柱的压力上限（本例中为 1 mL/min）。
    4. 与步骤 2.1.3 相同，使用 "自动冲洗" 功能冲洗泵和上游管路。
    5. 用低盐缓冲液 A（见步骤 1.15）平衡系统，并连接离子交换色谱柱。等待色谱柱完全平衡（至少 1.5 CV）。
    6. 使用步骤 2.2.2 中预留的缓冲液，通过样品更换器检查缓冲液 A 和 B 是否存在辐射损伤，方法同步骤 2.1.5。
    7. 检查从色谱柱流出的缓冲液，方法同步骤 2.1.6。将信号与步骤 2.2.6 中记录的缓冲液 A 信号进行比较。再次记录总强度图中的计数数量。
    8. 为缓冲液运行创建用于数据存储的文件夹。
    9. 在 HPLC 系统模式下设置数据采集。选择帧数，使总数据采集时间超过 IEC 运行的总时间（见步骤 2.2.1）。
    10. 打开安全快门并开始 SAXS 数据采集。确认采集正常进行，并再次检查总强度是否在至少 100 帧内保持与步骤 2.2.7 记录的数值一致。
    11. 使用 HPLC 软件的 "单次运行" 功能，启动步骤 2.2.1 中设定的逐步梯度。进样时将小瓶编号设为 -1，以确保此步骤不注入样品。记录程序启动时采集的帧数。
    12. 为样品运行创建 HPLC 程序。设定一个从 0% 缓冲液 B 开始的逐步梯度。根据步骤 1.1.5 中离线测量的结果，估算每个峰对应的缓冲液 B 百分比（图 1B）。在每个目标峰前后分别设置至少 3 个步骤，分别比峰低 1 个百分点和高 1.5 个百分点，每个步骤持续 2.5 CV（图 1C）。最后增加一个 100% 缓冲液 B 的步骤，持续 2.5 CV。
    13. 将样品在台式微量离心机中以 13,000 × g 离心至少 10 分钟。
    14. 将 D5323-785 用 20 mM Tris-HCl [pH 7]、10% 甘油和 1 mM DTT 稀释至缓冲液 A 的盐浓度（25 mM）。
    15. 手动将样品上样至色谱柱。暂停泵运行后，将缓冲液 A 的进液管插入稀释后的样品中，以避免产生气泡。断开色谱柱与检测器的连接，直接收集色谱柱的流出液。
      1. 当样品容器即将排空时，将进液管重新插入缓冲液 A（移动管路时再次暂停泵），然后重新启动泵，用缓冲液 A 将管路中的样品转移至色谱柱。待全部样品上样完成后，用 2 CV 的缓冲液 A 洗脱，然后重新连接色谱柱与检测器。
    16. 为样品运行创建用于数据存储的文件夹。
    17. 打开安全快门并开始 SAXS 数据采集。确认采集正常进行，并再次检查总强度是否在至少 100 帧内保持与步骤 2.2.7 记录的数值一致。
    18. 使用 HPLC 软件的 "单次运行" 功能，启动步骤 2.2.12 中设定的逐步梯度。进样时将小瓶编号设为 -1，以确保此步骤不注入样品。记录程序启动时采集的帧数。
    19. 在 ISPyB20 中打开 "数据采集"，点击 "前往" 按钮，查看数据集和自动分析结果21。
    20. 通过 "运行后分析" 软件将 HPLC 系统的紫外数据导出为 ASCII 格式。

3. 凝胶过滤-小角X射线散射数据处理 & 分析

  1. 通过点击 "Go" 按钮，在 ISPyB 的数据采集界面中打开数据。在概览中确定 SAXS 数据采集的哪些帧对应于洗脱峰。验证在峰的整个过程中回转半径是否稳定。
  2. 确认自动缓冲液校正已正确执行。将峰中心区域的帧加载到一个可对实验 SAXS 数据文件进行操作的程序中22，并对其进行平均。然后加载自动生成的缓冲液文件，检查平均帧与缓冲液帧的高 q 区域是否匹配。
  3. 使用 CORMAP 检验23对峰内采集的所有帧进行定量比较。
    1. 加载覆盖目标区域的自动生减法文件（*_sub.dat 文件）。
    2. 点击 "Scale" 按钮，将它们相互归一化。
    3. 使用 "Data Comparison" 功能进行比较。在整个峰的范围内，各帧之间应无系统性变化。
  4. 打开所有感兴趣的 *-_sub.dat 帧，使用 "Merge" 按钮将它们合并，并将合并后的文件以 .dat 格式保存。
  5. 使用程序中的 "Radius of Gyration" 工具确定回转半径，并记录 Guinier 区域中的第一个数据点，用于后续在低分辨率下裁剪数据。
  6. 使用程序中的 "Distance Distribution" 工具确定对距离分布函数，并将生成的 .out 文件保存为 gnom.out。

4. 从头算法 建模

  1. 在 Unix 机器上，运行一个 40 次的从头建模（ab initio）模型重建程序，且不施加对称性限制。创建一个新文件夹，并将 gnom.out 文件复制到该文件夹中。按如下方式运行程序：
    for (( i = 1; i <= 40; i++ )); do dammif gnom.out -m s -p dammifp1_$i; done
  2. 类似地，在第二个文件夹中运行一个施加六重对称性限制的从头建模（ab initio）模型重建程序：
    for (( i = 1; i <= 40; i++ )); do dammif gnom.out -m s -s P6 -p dammifp6_$i; done
  3. 对所有从头建模（ab initio）模型重建程序的输出文件（*-1.pdb）进行比对。在步骤 4.1 和 4.2 中的两个文件夹中，分别运行 damaver -a *-1.pdb。
  4. 在合适的分子可视化软件26中打开所有模型的合并结果（damaver.pdb）以及按正确体积过滤后的模型（damfilt.pdb），并对二者进行比较。
  5. 使用文本编辑器打开 damsel.log 文件。文件底部标记为“"reference"”的模型即为最具代表性的模型。

5. IEC-SAXS 数据处理、分析与建模

  1. 在用于处理实验SAXS数据文件的程序22中，加载缓冲液运行中每个混合步骤的约50个SAXS帧，点击"平均"按钮，并保存结果。
  2. 根据通过ISPyB提供的自动处理结果，确定实验中哪些帧对应于蛋白质的洗脱，并验证在整个峰范围内（初步）回转半径保持稳定。
  3. 将这些帧载入实验SAXS数据文件处理程序22并进行平均，方法与缓冲液帧相同（见步骤5.1）。然后加载步骤5.1中生成的缓冲液文件，并比较其高q区域（高于4.2 nm-1），以找到与峰平均值匹配的缓冲液。
    注意：峰平均值与缓冲液之间不应存在系统性偏移。如果样品曲线似乎介于两条缓冲液曲线之间，则通过计算其平均值来插值拟合曲线。
  4. 从峰组分的平均散射曲线中减去步骤5.3中确定的最佳匹配缓冲液，并保存所得的减法文件。此外，使用前一个和后一个混合步骤的平均缓冲液曲线生成减法曲线，以估算减法过程的误差范围。
  5. 对峰的左半部分和右半部分分别重复步骤5.3和5.4，并将结果与步骤5.4的结果进行比较，以检验整个峰内信号的稳定性。
  6. 对步骤5.4得到的三条减法曲线，分别执行步骤3.5和3.6。
  7. 比较三条减法曲线的结果。
    注意：只有在减法误差范围内保持稳健的结果才可信。
  8. 对步骤5.3中确定的最佳减法曲线，按照步骤4.1和4.2进行建模。
  9. 按照步骤4.3至4.5，对模型进行比对并确定最具代表性的模型。

6. 结果比较

  1. 运行程序，将3D结构12与SEC的代表性模型（步骤4.5）和IEC-SAXS数据（步骤5.9）在P6对称性条件下进行叠加：supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. 将model_sec.pdb和model_iec-r.pdb导入分子可视化软件中。
  3. 在电子表格中打开modelsec.pdb和modeliec-r.pdb的.fir文件，并绘制实验散射曲线与计算散射曲线的二维图。

结果

无模型不变量分析的结果列于表1中。对D5323-785 SEC-SAXS数据的分析显示，其分子质量估计值（来自Porod分析）为345 kDa，而IEC-SAXS测得的值为338 kDa。两者均与六聚体预期质量（6 × 53.5 kDa = 321 kDa）相符。对两组数据均进行了ab initio建模，建模时未施加对称性约束（SEC-SAXS：χ2 = 0.88，IEC-SAXS：χ2 = 3.1）以及采用C6对称性（SEC-SAXS：χ2 = 1.0，IEC-SAXS：χ2 = 4）。由于在两种情况下，两种重构模型对散射数据的整体拟合程度相当（图1D和E），因此可假设其具有C6对称性。因此，该模型对应于一种具有中心通道的六边形锥状结构，且该通道似乎部分受阻（SEC：图1F；IEC：图1G，叠加图：图1H）。对平均化前各个独立模型的检查表明，这种阻塞现象很可能是平均化过程造成的人工假象。

色谱图；SEC/IEC 实验；吸光度与强度关系图；分子模型
图1SAXS 数据分析与 D5 的比较323-785 （图改编自参考文献12和18）。 AD5蛋白及D5的示意图结构域结构323-785. B离线离子交换色谱图，显示三个峰。橙色曲线：280 nm 处的吸光度（au）；蓝色曲线：缓冲液 B 的百分比。图中已标出各峰处缓冲液 B 的百分比。 C在线离子交换色谱图。颜色标识同B图，此外，测量强度以绿色标示。该图显示了通过SEC-SAXS实验获得的散射曲线及模型计算曲线 D) 和 IEC ED5 数据分析323-785. FD5的珠状模型323-785 基于SEC数据和 G) IEC 数据。 H) SEC 与 IEC 模型的叠加图。图 F) 至 H) 使用分子可视化软件制作24. 请点击此处以查看此图的放大版本。

数据采集参数
仪器：ESRF BM29
波长 (Å)0.99
q 范围 (Å-1)0.0032 – 0.49
样品到探测器距离2.864 m
曝光时间 (秒)每帧 1 秒
浓度范围n.a.
温度 (K)293
探测器Pilatus 1M (Dectris)
通量 (光子/秒)1 × 1012
光束尺寸 (µm2)700 × 700
D5323-785 SEC 的结构参数
I0 (cm-1) [来自 Guinier 分析]0.0237
Rg (Å) [来自 Guinier 分析]48
用于 Guinier 分析的 qminRg – qmaxRg0.77 - 1.24
Dmax (Å) [来自 p(r) 分析]145
用于 p(r) 分析的 q 范围 (Å-1)0.02 - 0.17
Porod 体积 Vp (Å3) [来自 Scatter 软件](570 ± 5) × 103
分子质量 Mr (kDa) [来自 Vp]345
根据序列计算的单体分子质量 (kDa)321
D5323-785 IEC 的结构参数
I0 (cm-1) [来自 Guinier 分析]0.386
Rg (Å) [来自 Guinier 分析]46.5 ± 0.1
用于 Guinier 分析的 qminRg – qmaxRg0.44 - 1.29
Dmax (Å) [来自 p(r) 分析]120
用于 p(r) 分析的 q 范围 (Å-1)0.03 - 0.18
Porod 体积 Vp (Å3) [来自 Scatter 软件](577 ± 5) × 103
分子质量 Mr (kDa) [来自 Vp]339
根据序列计算的六聚体分子质量 (kDa)321

表1： SAXS 数据参数。该表格总结了 SAXS 数据采集与分析的参数。

讨论

对于许多大分子而言，在进行SAXS数据采集之前，通常需要通过层析进行最终纯化，以获得高质量的数据集。然而，并非所有样品都能保持稳定；它们可能易于发生聚集，或重新平衡为不同寡聚状态的混合物。因此，需要在光束线上进行最终的在线纯化步骤，以最大限度缩短纯化与数据采集之间的时间，从而获得最优质的SAXS数据。根据目标蛋白的生物物理特性，可选择SEC-SAXS或IEC-SAXS以获得最佳样品质量。本文以来源于解旋酶/引物酶D5的一个蛋白构建体为例，对这两种技术进行解释和讨论。

SEC-SAXS 数据的采集正变得越来越标准化，并已在许多生物小角X射线散射（BioSAXS）光束线上实现。数据分析，特别是背景扣除，相对直接且简便。然而，稳定的缓冲液信号以及大分子物种的充分分离仍然至关重要。因此，必须预留充足的时间以彻底平衡色谱柱。该方法失败的原因可能包括存在与目标蛋白大小相近的持久性污染物、蛋白浓度过低，以及对辐射敏感的缓冲液。

在实际操作中，最初 SEC-SAXS 很可能作为大多数大分子样品的首选方法。然而，许多纯化方案由于存在杂质或聚集现象，仍需先进行离子交换层析（IEC）步骤。考虑到每一次浓缩和层析步骤都会导致样品损失（估计为 30–50%）并耗费时间，直接采用 IEC-SAXS 具有明显优势。对于无法通过 SEC 纯化的样品，无论是由于存在大小相近的"杂质"，还是因为在所需浓度下严重聚集，IEC-SAXS 始终是更为合适的方法。此外，许多 IEC 柱支持更高的流速，有助于缩短从纯化到测量之间的转移时间。在本文展示的示例中，IEC 采用阶梯式洗脱，通过精确选择盐浓度梯度，可实现 D5323-785 与杂质的相近峰的有效分离。理论上，洗脱步数没有限制，但实际操作中，每个峰至少需要一个步骤，且不宜设置过多步数。对于上述背景扣除方法，必须测量相对较多的不同缓冲液组成，以找到匹配的缓冲液条件。

这两种技术共同的缺点是缺乏精确的蛋白质浓度信息。因此，无法基于前向散射进行精确的质量测定。对于D5323-785等球状蛋白质，Porod体积可提供一种替代的质量估算方法，尽管精度较低；但对于高度柔性或无序结构的蛋白质，该方法则不适用。

本文介绍的分步梯度离子交换色谱-小角X射线散射（IEC-SAXS）方法的一种变体是采用线性梯度洗脱。尽管在分步洗脱中可以通过设置任意数量的洗脱步骤来分离亚峰，但在使用线性梯度方法时，必须仔细优化梯度条件，以确保在开始SAXS实验前完全分离各峰。该方法中的背景扣除可以逐帧进行，并通过比较各个独立帧加以验证，但这需要更复杂的数据处理，目前尚无专用软件可用。

对于这两种技术而言，选择合适的色谱柱至关重要，因为它决定了大分子物质的分离效果。凝胶过滤色谱柱在上样容量、可分离大分子的大小范围以及分辨率方面有所不同，而离子交换色谱柱则在其固定的电荷种类和密度上存在差异。

尽管本文所述方案是针对ESRF的BM29光束线，但原则上可直接适配于其他任何SAXS光束线。主要要求包括足够高的X射线通量和合适的探测器（理想情况下为单光子计数型），以便在数秒或更短时间内获得合理的信噪比数据，以及能够生成梯度的在线液相色谱系统。具体的实施方案当然取决于当地光束线的环境条件。

采用两种方法对 D5323-785 所得结果略有差异。IEC 数据的回转半径略小于 SEC 数据，且散射曲线的局部极小值向稍大的散射矢量方向偏移。这表明通过 IEC-SAXS 测得的 D5323-785 比通过 SEC-SAXS 测得的 D5323-785 略为致密。这种差异可能源于样品制备的不同、纯化与测量之间的时间间隔差异（IEC 流程更快），或较不可能的原因是 SEC 纯化样品中存在污染物。两种方法完全独立获得的珠状模型具有可比性（图 1H）。D5323-785 呈现出预期的中空六聚体结构18。

总之，在线离子交换色谱和在线尺寸排阻色谱是重要的生物化学纯化方法，可直接与小角X射线散射（SAXS）联用6,7,9-12,25,26。与SEC-SAXS相比，IEC-SAXS数据的背景扣除略为困难且更具不确定性，但仍然是可行的。根据目标蛋白的生物物理特性，SEC-SAXS和IEC-SAXS均可实现物种分离的优化，并各自具有内在优势。只要正确执行验证步骤（如前所述），即可对所得数据进行可靠分析，并利用领域内现有的标准工具确定结构模型。这两种技术共同实现了对多种生物大分子的在线分离，获得的数据是传统静态测量方法无法获取的。

致谢

本项目获得了法国REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014基金以及法国军队卫生局和服务总署国防采办局研究基金的资助。我们感谢欧洲同步辐射装置（ESRF）提供的小角X射线散射（SAXS） beam time。我们感谢Andrew McCarthy、Gordon Leonard、Wim Burmeister和Guy Schoehn在资金和科研方面提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇 [DTT]EuromedexEU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶Biorad4561033
2x Phusion Flash PCR 预混液ThermoFisher scientificF 548
冰乙酸VWR Chemicals (BDH Prolabo)20104.298
琼脂糖 D-5EuromedexLF45130653
Amicon Ultra -15 离心过滤器 Ultracel -30KMillipore LtdUFC903024
氨苄青霉素钠盐EuromedexEU0400-D
苯并核酸酶（Benzonase）Novagene70750-3
溴酚蓝 MERCK8122
完全蛋白酶抑制剂混合物 Roche11231400
Econo-Pac 10 DG 脱盐柱Bio-rad732-2010
EDTASigmaE-5134
甘油VWR Chemicals (BDH Prolabo)24388.295
甘氨酸Euromedex26-128-6405-C
HindIIIRoche656313
HisSelect HF 镍亲和凝胶SigmaH0537
盐酸 (HCl)VWR Chemicals (BDH Prolabo)20252.295
咪唑AppliChem PanreacA1073,0500
InstantBlueExpedeonISB1L
LB 肉汤 MillerFluka AnalyticalL3152
MgCl2ICN Biomedicals Inc.191421
NaClVWR Chemicals (BDH Prolabo)27808.297
NcoIFermentasER0571
One Shot BL21 Star (DE3) ThermoFisher scientificC6010-03
pProEx HTb 载体 Addgene10711018
引物 Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒QIAGEN27106
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28706
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28106
SDS Sigma75746
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
SYBR Safe DNA 凝胶染料Invitrogen life technologyS33102
T4 连接酶ThermoFisher scientificEL0011
TEV自制
TOP 10Invitrogen life technologyC404003 
Tris 碱Euromedex26-128-3094-B
Uno Q 1R 柱 Bio-rad720 0011
β-巯基乙醇MPBiomedicals, LLC194834
名称公司目录编号备注
软件
光束线控制软件 BsXCuBEESRFPernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664本地开发
Camserver 软件Dectrisn.a.探测器控制软件
DAMAVERATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html用于对初始模型进行比对的程序 
DAMMIFATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html从头建模结构重建程序
HPLC 程序 Biologic Duo FlowBio-rad
HPLC 程序 LabSolutionsShimadzun.a.
ISPyBESRFDe Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.本地开发
PRIMUSATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html用于处理实验 SAXS 数据的程序
PyMOLDeLano Scientific LLChttps://www.pymol.org/可视化软件
SUPCOMBATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html用于叠加三维结构的程序
名称公司目录编号备注
设备
BioLogic Duo FlowBiorad
BioLogic Biofrac 组分收集器Biorad
HPLC 系统Shimadzu
Labsonic PSartorius Stedim biotechBBI8535108

参考文献

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