方法文章

阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

DOI：

10.3791/54868

⸱

2016年12月26日

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

本文内容

摘要

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我们开发了一种定量三维方法 计算机模拟 脑部建模（q3DISM） 淀粉样蛋白-β（Aβ） 阿尔茨海默病啮齿类动物模型中单核吞噬细胞的吞噬作用。该方法可广泛用于几乎任何吞噬事件的定量分析 体内.

摘要

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神经炎症现已被认为是神经退行性疾病的主要病因因素。单核吞噬细胞是负责吞噬和清除碎片及残渣的先天免疫细胞，包括中枢神经系统内驻留的巨噬细胞（即小胶质细胞）以及从外周浸润而来的单核吞噬细胞。通常采用光学显微镜观察啮齿类或人类脑组织标本中的吞噬作用。然而，定性方法尚未提供明确的证据 体内 吞噬作用。在此，我们描述了定量的三维 计算机模拟 建模（q3DISM），一种用于在啮齿类动物阿尔茨海默病（AD）模型中对单核吞噬细胞吞噬淀粉样蛋白-β（Aβ）进行真实三维定量的稳健方法。该方法通过荧光标记可视化啮齿类动物脑切片中吞噬溶酶体内包裹的Aβ。随后对大范围z轴维度的共聚焦数据集进行三维重建，以定量分析在空间上与吞噬溶酶体共定位的Aβ。我们展示了q3DISM在小鼠和大鼠脑组织中的成功应用，但该方法可推广至几乎所有组织中的吞噬事件研究。

引言

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阿尔茨海默病（AD）是最常见的年龄相关性痴呆1，其特征是脑内淀粉样蛋白-β（Aβ）积聚形成"老年性"β-淀粉样斑块，伴随慢性低水平神经炎症、tau蛋白病变、神经元丢失以及认知功能障碍2。在AD患者脑组织中，神经炎症表现为反应性星形胶质细胞和单核吞噬细胞（通常称为小胶质细胞，尽管其中枢来源与外周来源尚不明确）聚集于Aβ沉积物周围3。作为中枢神经系统（CNS）的先天免疫哨兵，小胶质细胞在清除脑内Aβ方面处于核心地位。然而，小胶质细胞向Aβ斑块的募集几乎不伴随Aβ的吞噬作用，甚至完全缺乏4,5。一种假说认为，小胶质细胞最初通过吞噬少量Aβ聚集体发挥神经保护作用。但随着Aβ负荷过重和/或年龄相关的功能衰退，这些细胞最终转变为功能失调的促炎表型，从而促进神经毒性并导致认知功能下降6。

近期的全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出一组属于核心先天免疫通路的阿尔茨海默病风险等位基因7 调节吞噬作用8-11因此，针对脑内淀粉样蛋白沉积的免疫反应已成为研究热点，无论是在理解阿尔茨海默病病因方面，还是在开发新的治疗策略方面均备受关注12-14然而，仍迫切需要一种方法来评估Aβ 吞噬作用 体内为解决这一尚未满足的需求，我们开发了定量三维 计算机模拟 建模（q3DIS....

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方案

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研究伦理声明：本文所述所有涉及动物的实验均经南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院指南以及国际实验动物评估和认证协会的建议进行。

1. 啮齿类动物脑组织的分离及免疫染色前处理

第1天：

  1. 将14月龄的TgF344-AD大鼠或12月龄的APP/PS1小鼠置于持续的深度异氟烷麻醉（4%）下。通过夹趾测试及无回缩反射来评估麻醉深度。
  2. 剪开两侧肋骨 cage，抬起以暴露心脏。将23 G针头插入心脏左心室，并在右心房处做一小切口。使用蠕动泵经心脏灌注冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）进行放血（小鼠30 mL ；大鼠 150 - 200 mL ）。
  3. 沿皮肤尾侧正中线做切口，将皮肤和肌肉分开。沿正中线及两眼之间切开颅骨顶部。去除骨板，从颅腔中完整分离脑组织。
  4. 将脑组织放入冠状面啮齿类脑切片模具中，切成四等份。将后部四分之一脑组织在4%多聚甲醛固定液（PBS配制）中4 °C过夜（16 h）孵育。用PBS洗涤3次后，转移至70%乙醇中。注意：多聚甲醛具有毒性，应在化学通风橱内佩戴适当的个人防护装备操作。

第2天：

  1. 将脑组织四分之一部分放入包埋盒中，并依次用浓度逐渐增加的乙醇溶液进行梯度脱水（70%、80%、95% 和 100% 各 1 小时，100% 乙醇更换三次）。....

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结果

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采用上述针对q3DISM的多阶段方法，我们能够定量分析Aβ在APP/PS1小鼠（图1）和TgF344-AD大鼠（图2）脑内单核细胞吞噬溶酶体中的摄取情况。因此，q3DISM方法使得可在阿尔茨海默病（AD）的小鼠和大鼠模型中对单核吞噬细胞进行分析。有趣的是，在APP/PS1小鼠（图1B, C）和TgF344-AD大鼠（图2B, C）中，与远离斑块的Iba1+单核吞噬细胞相比，与斑块相关的细胞中CD68+吞噬溶酶体所占体积显著增加。这些数据表明，靠近斑块的单核吞噬细胞相较于远离斑块的细胞，更倾向于执行吞噬功能。为了展示针对不同Aβ构象体染色所得数据的范围，我们在小鼠和大鼠组织中使用了多种抗体（详见表1及讨论部分）——但本研究并非旨在直接比较小鼠与大鼠AD模型在Aβ吞噬方面的差异。尽管如此，值得注意的是，在APP/PS1小鼠中，与斑块相关的单核吞噬细胞对Aβ的摄取量高.......

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讨论

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本报告中所述用于Aβ吞噬作用真实三维定量的方案 体内 单核吞噬细胞对细胞和亚细胞区室以及Aβ沉积物的特异性标记依赖于特定标记方法。具体而言，我们使用Iba1（离子化钙结合接头分子1），该蛋白在细胞活化后参与膜皱褶形成和吞噬作用。18,19，用于染色脑内单核吞噬细胞。尽管 Iba1+ 细胞通常被认为是脑内常驻的小胶质细胞，但仍有可能存在外周浸润的单核吞噬细胞构成免疫标记细胞的一部分。利用识别溶酶体/内体相关膜糖蛋白（LAMP）家族成员的抗体可显示细胞内的吞噬溶酶体：LAMP120 或 CD6821后者主要定位于溶酶体和内体，仅有少量循环至细胞表面。LAMP1 和 CD68 抗体均已成功应用于大鼠和小鼠组织，选择使用哪种抗体主要取决于共染色所用其他抗体的宿主（参见 表1）。需要注意的是，可使用多种抗体来检测 Aβ。在小鼠组织中，4G8 抗体可识别 Aβ 肽段第 17 - 24 位的氨基酸残基（该序列在人和小鼠中相同）22,

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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M-V.G-S. 获得布莱特福克斯基金会阿尔茨海默病研究博士后奖学金（A2015309F）以及阿尔茨海默病协会加利福尼亚南加州分会青年研究者奖的支持。T.M.W. 获得ARCS基金会和约翰·道格拉斯·弗伦奇阿尔茨海默病基金会玛吉·麦金尼特-约翰·道格拉斯·弗伦奇纪念博士后奖学金的支持。本研究工作获得美国国家神经疾病和中风研究所（1R01NS076794-01，资助对象：T.T.）、阿尔茨海默病协会巅峰学者奖（ZEN-10-174633，资助对象：T.T.）以及美国衰老研究联合会/艾里森医学基金会朱莉·马丁中年学者衰老研究奖（M11472，资助对象：T.T.）的支持。我们感谢齐尔卡神经遗传学研究所提供的启动资金，这些资金为本研究的开展提供了重要支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷AbbottNDC 0044-5260-05
解剖剪刀VWR82027-582
钝头解剖剪刀VWR82027-588
镊子VWR94024-408
23 G 针头VWRBD305145
蠕动泵 FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02磷酸盐缓冲液；工作浓度为 1x
成年小鼠脑切片模具，冠状切面，不锈钢，1 mm Kent ScientificRBMS-200C
成年大鼠脑切片模具，冠状切面，不锈钢，1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
32% 甲醛水溶液（PFA）EMS15714-S注意：有毒。工作浓度：PBS 中含 4%
乙醇VWR89125-188不同浓度，参见实验方案
组织包埋盒 Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
包埋与浸润用石蜡VWR15147-839
Leica RM2125 切片机Leica Biosystems
一次性切片机刀片 VWR25608-964
Leica HI 1210 水浴锅Leica Biosystems
Superfrost plus 载玻片VWR48311-703
二甲苯Sigma-Aldrich534056-4X4L注意：有毒 
靶修复液 10xDAKOS1699工作浓度 1x
KimWipes 擦镜纸VWR21905-026
疏水性 PAP 笔VWR95025-252
吐温 X-100VWR97062-208
正常驴血清（NDS）Jackson Immuno017-000-121
盖玻片VWR48393081
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36935
玻璃载片架VWR100492-942
Iba1 抗体（多克隆，兔源）Wako019-19741 工作浓度 1:200
Iba1 抗体（多克隆，山羊源）LifeSpan BioscienceLS-B2645工作浓度 1:200
大鼠 CD68 [KP1] 抗体（单克隆，小鼠源）Abcamab955工作浓度 1:200
小鼠 CD68 [FA-11] 抗体（单克隆，大鼠源）Abcamab53444工作浓度 1:200
小鼠 CD107a (LAMP1) 抗体（单克隆，大鼠源）Affymetrix14-1071工作浓度 1:100
β-淀粉样蛋白 17-24 (4G8) 抗体（单克隆，小鼠源）CovanceSIG-39220工作浓度 1:200
β-淀粉样蛋白 1-16 (6E10) 抗体（单克隆，小鼠源）CovanceSIG-39320工作浓度 1:200
OC 抗体（多克隆，兔源）由 D. H. Cribbs 和 C. G. Glabe（加州大学欧文分校）惠赠工作浓度 1:200
Alexa Fluor 488 小鼠二抗InvitrogenA-11001工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 488 大鼠二抗InvitrogenA-11006工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 594 兔二抗InvitrogenA-11037工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 594 山羊二抗InvitrogenA-11080工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 647 小鼠二抗InvitrogenA-21235工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 647 兔二抗InvitrogenA-21443工作浓度 1:1,000
浸油Nikon 
A1 共聚焦显微镜Nikon 
NIS Elements Advanced Research 软件Nikon 
Imaris:Bitplane 软件版本 7.6Bitplane"coloc" 和 "supass" 模块被使用。 也可使用开源免费软件 ImageJ 对共聚焦 z 轴层扫数据集进行共定位 分析。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., G....

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