方法文章

阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

DOI：

10.3791/54868

⸱

2016年12月26日

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种定量三维方法 计算机模拟 脑部建模（q3DISM） 淀粉样蛋白-β（Aβ） 阿尔茨海默病啮齿类动物模型中单核吞噬细胞的吞噬作用。该方法可广泛用于几乎任何吞噬事件的定量分析 体内.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经炎症现已被认为是神经退行性疾病的主要病因因素。单核吞噬细胞是负责吞噬和清除碎片及残渣的先天免疫细胞，包括中枢神经系统内驻留的巨噬细胞（即小胶质细胞）以及从外周浸润而来的单核吞噬细胞。通常采用光学显微镜观察啮齿类或人类脑组织标本中的吞噬作用。然而，定性方法尚未提供明确的证据 体内 吞噬作用。在此，我们描述了定量的三维 计算机模拟 建模（q3DISM），一种用于在啮齿类动物阿尔茨海默病（AD）模型中对单核吞噬细胞吞噬淀粉样蛋白-β（Aβ）进行真实三维定量的稳健方法。该方法通过荧光标记可视化啮齿类动物脑切片中吞噬溶酶体内包裹的Aβ。随后对大范围z轴维度的共聚焦数据集进行三维重建，以定量分析在空间上与吞噬溶酶体共定位的Aβ。我们展示了q3DISM在小鼠和大鼠脑组织中的成功应用，但该方法可推广至几乎所有组织中的吞噬事件研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）是最常见的年龄相关性痴呆1，其特征为脑内淀粉样蛋白-β（Aβ）以“老年性”β-淀粉样斑块形式沉积，伴随慢性低水平神经炎症、tau蛋白病变、神经元丢失以及认知功能障碍2。在AD患者脑组织中，神经炎症表现为反应性星形胶质细胞和单核吞噬细胞（称为小胶质细胞，尽管其中枢来源或外周来源尚不明确）围绕Aβ沉积物分布3。作为中枢神经系统（CNS）的固有免疫哨兵，小胶质细胞在清除脑内Aβ方面处于核心地位。然而，小胶质细胞向Aβ斑块的募集几乎不伴随明显的Aβ吞噬作用，甚至完全缺乏4,5。一种假说认为，小胶质细胞最初通过吞噬少量Aβ聚集体发挥神经保护作用；但随着Aβ负荷过重和/或年龄相关的功能衰退，这些细胞最终转变为功能失调的促炎表型，从而促进神经毒性及认知功能下降6。

近期的全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出一组属于核心天然免疫通路的阿尔茨海默病风险等位基因7 调节吞噬作用8-11因此，针对脑内淀粉样蛋白沉积的免疫反应已成为研究热点，无论是在理解阿尔茨海默病（AD）病因学方面，还是在开发新的治疗策略方面均备受关注。12-14然而，仍迫切需要一种方法来评估Aβ 吞噬作用 在体内为解决这一尚未满足的需求，我们开发了定量三维 计算机模拟 建模（q3DISM）以实现对脑内Aβ 单核吞噬细胞在啮齿类动物类阿尔茨海默病模型中的吞噬作用

动物模型在模拟疾病程度的范围内具有重要价值，已被广泛用于理解阿尔茨海默病（AD）的发病机制以及评估实验性治疗手段。由于早老素（Presenilin）基因突变 （PS）和淀粉样前体蛋白（APP）基因各自独立地导致常染色体显性遗传的阿尔茨海默病（AD），这些突变的转基因已被广泛用于构建转基因啮齿类动物模型。转基因APP/PS1小鼠同时共表达 "瑞典" 突变人APP（APPswe）和 Δ 外显子9突变型人早老素1（PS1）ΔE9）表现为加速的脑淀粉样变性和神经炎症15,16此外，我们还制备了共注射了APP的双转基因大鼠swe 和 PS1ΔE9 构建体（TgF344-AD 品系，背景为 Fischer 344）。与转基因小鼠脑淀粉样变模型不同，TgF344-AD 大鼠会出现先于tau蛋白病变、神经元凋亡性丢失及行为障碍的脑淀粉样变17.

在本报告中，我们描述了一种用于免疫染色小胶质细胞、吞噬溶酶体和Aβ APP/PS1 小鼠和 TgF344-AD 大鼠脑切片中沉积物的检测及大范围 z 轴共聚焦图像的采集。我们详细描述了 计算机模拟 从共聚焦数据集生成和分析真实的三维重建，以实现对吞噬溶酶体中空间共定位的淀粉样蛋白-β（Aβ）进行定量β 摄取至小胶质细胞的吞噬溶酶体中。更广泛而言，本文详述的方法可用于定量几乎所有形式的吞噬作用 在体内.

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究伦理声明：本文所述所有涉及动物的实验均经南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院指南以及国际实验动物评估和认证协会的建议进行。

1. 啮齿类动物脑组织的分离及免疫染色前处理

第1天：

  1. 将14月龄的TgF344-AD大鼠或12月龄的APP/PS1小鼠置于持续的深度异氟烷麻醉（4%）下。通过夹趾测试及无回缩反射来评估麻醉深度。
  2. 剪开两侧肋骨 cage，抬起以暴露心脏。将23 G针头插入心脏左心室，并在右心房处做一小切口。使用蠕动泵经心脏灌注冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）进行放血（小鼠30 mL ；大鼠 150 - 200 mL ）。
  3. 沿皮肤尾侧正中线做切口，将皮肤和肌肉分开。沿正中线及两眼之间切开颅骨顶部。去除骨板，从颅腔中完整分离脑组织。
  4. 将脑组织放入冠状面啮齿类脑切片模具中，切成四等份。将后部四分之一脑组织在4%多聚甲醛固定液（PBS配制）中4 °C过夜（16 h）孵育。用PBS洗涤3次后，转移至70%乙醇中。注意：多聚甲醛具有毒性，应在化学通风橱内佩戴适当的个人防护装备操作。

第2天：

  1. 将脑组织四分之一部分放入包埋盒中，并依次用浓度逐渐增加的乙醇溶液进行梯度脱水（70%、80%、95% 和 100% 各 1 小时，100% 乙醇更换三次）。
  2. 使用三轮 100% 二甲苯溶液（每轮 1 小时）清除组织中的乙醇。注意：二甲苯具有毒性，操作时应在通风橱内佩戴适当的个人防护装备。
  3. 将组织经两轮熔融石蜡浴（56–58 °C，每轮 90 分钟）处理后，包埋于石蜡块中。

第3天：

  1. 使用切片机对石蜡包埋的脑组织进行10 μm厚度的切片。将切片浸入水浴（50 °C，1分钟），然后贴附于显微镜载玻片上。将载玻片放置过夜干燥，以确保组织牢固黏附于载玻片。

2. 免疫染色

注意：可使用不同的抗体组合进行下述染色步骤。适用于大鼠和小鼠脑组织的抗体混合物列于表1中。

第4天：

  1. 使用两份100%二甲苯溶液（每份12分钟）对脑切片进行脱蜡处理。
  2. 将脑切片依次浸入梯度乙醇溶液中进行水化——100%乙醇10分钟，95%乙醇5分钟，80%乙醇10分钟，最后70%乙醇15分钟，随后用PBS缓冲液洗涤3次（每次5分钟，室温，轻度振荡）。同时，在加热板上将抗原修复液加热至95–97 °C，并使用磁力搅拌器持续搅拌。
  3. 将脑切片置于95–97 °C的抗原修复液中孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤3次（每次5分钟，室温，轻度振荡）。
  4. 使用精细擦拭纸快速擦干载玻片，避免组织干燥，并用疏水屏障笔在组织周围画出疏水圈。在圈定的组织区域内加入封闭缓冲液［含0.3% Triton X-100和10%正常驴血清（NDS）的PBS缓冲液］，于湿盒中室温孵育1小时。
  5. 弃去封闭缓冲液，加入Iba1一抗（用封闭缓冲液稀释）以标记单核吞噬细胞，于湿盒中4 °C过夜孵育。有关抗体宿主及工作稀释比例，请参见表1和材料表。

第5天：

  1. 用3次PBS洗涤液清洗一抗（每次5分钟，室温，轻度振荡）。在避光条件下，室温下用荧光标记的二抗（与发射波长为594 nm的荧光染料偶联）在封闭缓冲液中孵育1小时，随后进行3次PBS洗涤（每次5分钟，室温，轻度振荡）。此步骤中应始终保持切片避光，以避免荧光信号淬灭。

第6 - 7天：

  1. 重复步骤 2.5 & 2.6，使用CD68（大鼠脑组织）或LAMP1（小鼠组织）抗体及相应偶联488 nm发射荧光染料的二抗标记吞噬溶酶体。

第7 - 8天：

  1. 重复步骤 2.5 & 2.6，使用OC抗体（大鼠组织）或4G8抗体（小鼠脑组织）以及相应的偶联647 nm荧光染料的二抗标记Aβ沉积物。
    注意：6E10 抗体也可成功用于小鼠和大鼠组织。有关合适的抗体组合，请参见 材料表.
  2. 在避光条件下于室温下过夜完全干燥切片。然后，使用含DAPI的荧光封片剂封片。

3. 大型Z轴堆栈共聚焦数据集的获取

注意：本实验方案需要配备60倍物镜以及405 nm、488 nm、594 nm和647 nm激光器的全自动激光扫描共聚焦显微镜。所有设备均由成像与激光控制软件通过计算机进行控制。在开始成像实验方案之前，请开启计算机、落射荧光灯、显微镜、激光器和相机的电源。

第9天：

  1. 选择60倍显微镜物镜。在镜头上添加浸油，并将样本放置于显微镜载物台的玻片夹持器上。升高物镜直至浸油与玻片接触。通过目镜使用落射荧光照明，调节焦平面以定位海马体或大脑皮层中的淀粉样斑块。
  2. 使用共聚焦显微镜（60倍放大倍数，z轴步进：0.25 μm < z < 0.40 μm，步数 25 < n < 35）采集啮齿类动物海马体或皮层中围绕淀粉样沉积物的活化单核吞噬细胞的共聚焦图像。

4. q3DISM

注意：为了获得具有显著性的结果，我们建议每只动物/每个目标区域至少分析3张图像。对于每张图像，待分析细胞的数量可能因实验范式不同而有所差异。在本报告展示的代表性结果中，我们每种条件下分析了3个细胞。例如远离或与斑块相关的单核吞噬细胞；参见 图1C - D 和 2C - D).

第10天：

  1. 使用科学的三维图像处理与分析软件中的共定位（coloc）模块，对共聚焦数据集进行分析，同时在所有z平面中评估Iba1/CD68（大鼠组织）或Iba1/LAMP1（小鼠组织）染色的空间邻近性。创建Iba+/CD68+或Iba+/LAMP1+共定位通道，该通道对应于活化的单核吞噬细胞内的吞噬溶酶体。
    1. 在软件窗口右侧的“模式检查”中，选择A通道为TRITC（对应于与594 nm荧光染料偶联的Iba1染色），B通道为FITC（对应于与488 nm荧光染料偶联的CD68或LAMP1染色）。在“模式检查”右侧，选择“阈值”模式，在“共定位强度”中选择“源通道”。
    2. 点击“编辑”，在软件窗口右侧选择“共定位颜色”。
    3. 针对每个通道分别调整阈值，以包含特异性染色信号并排除背景或非特异性信号。一旦完成调整，在不同图像之间不得更改阈值，以确保分析的无偏性。共定位体素（来自所有z层堆栈的像素）将在所有z层堆栈中以步骤4.1.2中选定的颜色显示。
    4. 点击“构建共定位通道”。所创建的共定位通道将出现在显示调节窗口中。
    5. 点击共定位通道以打开通道统计信息。“高于阈值的体积/物质A共定位百分比”表示Iba1信号（对应于594 nm荧光染料的体素）与LAMP1或CD68信号（对应于488 nm荧光染料的体素）共定位的比例。更简单地说，这代表被吞噬溶酶体占据的单核细胞体积（见图1C和图2C）。
      注：“高于阈值的体积/物质B共定位百分比”表示LAMP1或CD68信号与Iba1信号共定位的比例。该值应接近100%，因为吞噬溶酶体是细胞内结构。数值基于所有z层堆栈中高于阈值且共定位的信号比例计算得出。
  2. 使用共定位模块，分析步骤4.1中生成的共定位通道与OC（大鼠组织）或4G8（小鼠组织）Aβ信号之间的空间邻近性。这可用于定量分析被包裹在吞噬溶酶体内的Aβ。
    1. 选择A通道的共定位数据集（对应于步骤4.1中生成的Iba1/CD68或Iba1/LAMP1共定位通道），B通道选择Cy5（对应于与647 nm荧光染料偶联的OC或4G8染色）。
    2. 按照步骤4.1.2至4.1.5所述方法构建共定位通道。
    3. 点击共定位通道以打开通道统计信息。“高于阈值的体积/物质A共定位百分比”表示Iba1/LAMP1或Iba1/CD68（对应于步骤4.1.5中构建的共定位通道的体素）与OC或4G8信号（对应于647 nm荧光染料的体素）共定位的比例。这代表被Aβ占据的吞噬溶酶体体积（见图1D和图2D）。
      注：“高于阈值的体积/物质B共定位百分比”表示总Aβ信号中与吞噬溶酶体共定位的比例。该值可用于评估被包裹在吞噬溶酶体内的总Aβ沉积物所占比例（在本代表性结果中未显示）。
  3. 使用surpass模块重建共聚焦图像堆栈，并生成单核细胞吞噬溶酶体内Aβ的三维模型。
    1. 在“显示调节”窗口中，选择TRITC（仅显示Iba1染色）。在“体积属性”窗口中，点击“添加新表面”。
    2. 在“1/5 算法”步骤中，“设置”中选择“表面”；在“颜色”中选择调色板或RGB颜色类型，并调整透明度（在图1B和图2B中红色设置为60%透明度）。勾选“选择感兴趣区域”复选框。点击下一步。
    3. 在“2/5 感兴趣区域”步骤中，通过调整x、y和z坐标，在目标细胞周围绘制一个窗口（见图1A和图2A中的白色框）。点击下一步。
    4. 在“3/5 源通道”步骤中，选择TRITC源通道。勾选“平滑”选项，并将表面细节级别设置为0.4 μm。在“阈值设定”中选择绝对强度。点击下一步。
    5. 在“4/5 阈值”步骤中，调整阈值，使生成的体积与TRITC通道信号完全重叠。点击下一步。
    6. 在“5/5 分类表面”步骤中，在“滤波类型”部分，根据对象大小选择需包含或排除在生成体积之外的对象。点击完成，执行所有创建步骤，并退出向导。
    7. 重复步骤4.3.1至4.3.6，为FITC通道（LAMP1+或CD68+吞噬溶酶体）创建三维表面。
    8. 重复步骤4.3.1至4.3.6，为Cy5通道（OC+或4G8+ Aβ沉积物）创建三维表面。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用上述针对q3DISM的多阶段方法，我们能够定量分析Aβ在APP/PS1小鼠（图1）和TgF344-AD大鼠（图2）脑内单核细胞吞噬溶酶体中的摄取情况。因此，q3DISM方法使得可在阿尔茨海默病（AD）的小鼠和大鼠模型中对单核吞噬细胞进行分析。有趣的是，在APP/PS1小鼠（图1B, C）和TgF344-AD大鼠（图2B, C）中，与远离斑块的Iba1+单核吞噬细胞相比，与斑块相关的细胞中CD68+吞噬溶酶体所占体积显著增加。这些数据表明，靠近斑块的单核吞噬细胞相较于远离斑块的细胞，更倾向于执行吞噬功能。为了展示针对不同Aβ构象体染色所得数据的范围，我们在小鼠和大鼠组织中使用了多种抗体（详见表1及讨论部分）——但本研究并非旨在直接比较小鼠与大鼠AD模型在Aβ吞噬方面的差异。尽管如此，值得注意的是，在APP/PS1小鼠中，与斑块相关的单核吞噬细胞对Aβ的摄取量高...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本报告中所述用于Aβ吞噬作用真实三维定量的方案 体内 单核吞噬细胞对细胞和亚细胞区室以及Aβ沉积物的特异性标记依赖于特定标记方法。具体而言，我们使用Iba1（离子化钙结合接头分子1），该蛋白在细胞活化后参与膜皱褶形成和吞噬作用。18,19，用于染色脑内单核吞噬细胞。尽管 Iba1+ 细胞通常被认为是脑内常驻的小胶质细胞，但仍有可能存在外周浸润的单核吞噬细胞构成免疫标记细胞的一部分。利用识别溶酶体/内体相关膜糖蛋白（LAMP）家族成员的抗体可显示细胞内的吞噬溶酶体：LAMP120 或 CD6821后者主要定位于溶酶体和内体，仅有少量循环至细胞表面。LAMP1 和 CD68 抗体均已成功应用于大鼠和小鼠组织，选择使用哪种抗体主要取决于共染色所用其他抗体的宿主（参见 表1）。需要注意的是，可使用多种抗体来检测 Aβ。在小鼠组织中，4G8 抗体可识别 Aβ 肽段第 17 - 24 位的氨基酸残基（该序列在人和小鼠中相同）22,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V.G-S. 获得布莱特福克斯基金会阿尔茨海默病研究博士后奖学金（A2015309F）以及阿尔茨海默病协会加利福尼亚南加州分会青年研究者奖的支持。T.M.W. 获得ARCS基金会和约翰·道格拉斯·弗伦奇阿尔茨海默病基金会玛吉·麦金尼特-约翰·道格拉斯·弗伦奇纪念博士后奖学金的支持。本研究工作获得美国国家神经疾病和中风研究所（1R01NS076794-01，资助对象：T.T.）、阿尔茨海默病协会巅峰学者奖（ZEN-10-174633，资助对象：T.T.）以及美国衰老研究联合会/艾里森医学基金会朱莉·马丁中年学者衰老研究奖（M11472，资助对象：T.T.）的支持。我们感谢齐尔卡神经遗传学研究所提供的启动资金，这些资金为本研究的开展提供了重要支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷AbbottNDC 0044-5260-05
解剖剪刀VWR82027-582
钝头解剖剪刀VWR82027-588
镊子VWR94024-408
23 G 针头VWRBD305145
蠕动泵 FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02磷酸盐缓冲液；工作浓度为 1x
成年小鼠脑切片模具，冠状切面，不锈钢，1 mm Kent ScientificRBMS-200C
成年大鼠脑切片模具，冠状切面，不锈钢，1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
32% 甲醛水溶液（PFA）EMS15714-S注意：有毒。工作浓度：PBS 中含 4%
乙醇VWR89125-188不同浓度，参见实验方案
组织包埋盒 Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
包埋与浸润用石蜡VWR15147-839
Leica RM2125 切片机Leica Biosystems
一次性切片机刀片 VWR25608-964
Leica HI 1210 水浴锅Leica Biosystems
Superfrost plus 载玻片VWR48311-703
二甲苯Sigma-Aldrich534056-4X4L注意：有毒 
靶修复液 10xDAKOS1699工作浓度 1x
KimWipes 擦镜纸VWR21905-026
疏水性 PAP 笔VWR95025-252
吐温 X-100VWR97062-208
正常驴血清（NDS）Jackson Immuno017-000-121
盖玻片VWR48393081
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36935
玻璃载片架VWR100492-942
Iba1 抗体（多克隆，兔源）Wako019-19741 工作浓度 1:200
Iba1 抗体（多克隆，山羊源）LifeSpan BioscienceLS-B2645工作浓度 1:200
大鼠 CD68 [KP1] 抗体（单克隆，小鼠源）Abcamab955工作浓度 1:200
小鼠 CD68 [FA-11] 抗体（单克隆，大鼠源）Abcamab53444工作浓度 1:200
小鼠 CD107a (LAMP1) 抗体（单克隆，大鼠源）Affymetrix14-1071工作浓度 1:100
β-淀粉样蛋白 17-24 (4G8) 抗体（单克隆，小鼠源）CovanceSIG-39220工作浓度 1:200
β-淀粉样蛋白 1-16 (6E10) 抗体（单克隆，小鼠源）CovanceSIG-39320工作浓度 1:200
OC 抗体（多克隆，兔源）由 D. H. Cribbs 和 C. G. Glabe（加州大学欧文分校）惠赠工作浓度 1:200
Alexa Fluor 488 小鼠二抗InvitrogenA-11001工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 488 大鼠二抗InvitrogenA-11006工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 594 兔二抗InvitrogenA-11037工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 594 山羊二抗InvitrogenA-11080工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 647 小鼠二抗InvitrogenA-21235工作浓度 1:1,000
Alexa Fluor 647 兔二抗InvitrogenA-21443工作浓度 1:1,000
浸油Nikon 
A1 共聚焦显微镜Nikon 
NIS Elements Advanced Research 软件Nikon 
Imaris:Bitplane 软件版本 7.6Bitplane"coloc" 和 "supass" 模块被使用。 也可使用开源免费软件 ImageJ 对共聚焦 z 轴层扫数据集进行共定位 分析。

参考文献

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