修改MicroSecure玻璃化:一种安全，简便，高效的冷冻程序人胚泡

Summary

MicroSecure 玻璃化是一种非商业、无菌封闭玻璃化设备系统，符合 FDA 良好生产和组织处理规范。由于疏水性堵塞胚胎吸管从工业中撤出，玻璃化程序被修改为在标准内部棉塞之前包括一个内部密封。

Abstract

临床胚胎玻璃化冷冻与发展，在21 ^世纪 ，并与误解，独特的玻璃化设备，在"开放式"系统（即直接LN ₂接触）的超快速冷却是必不可少的，以优化玻璃化成功的发展。周围的冷却速率的重要性的教条导致受技术变化和创造玻璃化设备的不安全做法忽视重要的质量控制因素（ 例如，易用性，可重复性，可靠性，标签安全和存储安全）。了解允许旨在最大限度地减少区域内和跨技术变化的安全，可靠，可重复和可靠μS-VTF方法的开发其它设备的质量控制瑕疵。同样重要的是，它结合了两种现有符合FDA标准的设备的可用性:1）0.3毫升的离子交联聚合物树脂胚胎吸管内化，双色，篡改-P屋顶标签可重复密封焊缝潜力;和2）缩短，常用，300微米的ID无菌flexipettes直接加载胚胎（多个），以便创造一个高度有效的全球玻璃化设备。像其他无菌，封闭玻璃化系统（ 例如，高安全性玻璃化（HSV），快速-i和VitriSafe）生殖医学有效利用，microSecure玻璃化（μS-VTF）已经证明，它可以实现高变暖后的生存和怀孕结果凭借其注重简单性，并降低技术变化。虽然含有内疏水塞0.3毫升胚胎秸秆市售用标准精液吸管具有棉聚乙烯吡咯烷酮（PVP）插头取代，它保持了其离聚物树脂组合物，以确保焊接密封。但是，棉塞可以在接触时灯芯出flexipettes的流体胚胎内容。一种改进μS-VTF方法适用于包括附加的内部焊接在设备负载侧的插头前密封。增加的技术步骤，将μS-VTF程序并没有影响它的成功应用，为高存活率（> 95％）和妊娠率今天仍在继续。

Introduction

玻璃化是一个最有影响力的辅助生殖技术的体外受精 （IVF）行业自内单精子注射的发展。今天，囊胚是没有事先与传统的慢速冷冻方法¹相关的胚胎活力的丧失冻存。凭借可靠的气候变暖后的胚胎存活率，不孕不育行业转变成首选用冷冻胚胎移植周期，其产生类似的或更高的怀孕结果比传统的新鲜胚胎移植。胚泡活检和胚胎植入前遗传学筛选（PGS）协会，玻璃化已经成为一个重要的临床工具，通过整倍体单胚胎移植^2，3，优化健康的活产结果。

小鼠胚胎玻璃化冷冻是在80年代中期开发的^{4， 5}和⁶ 1990年适用于畜牧业。基于的前提是，玻璃化的解决方案，形成一个亚稳glasseous状态，自由损坏冰晶形成的，它已被证明更有效地保护胚胎的完整细胞完整性。有趣的是，有前途的玻璃化验收进入人体胚胎中才开始实现，直到21 ^世纪 。早期出版物推广使用玻璃化恰逢独特的"开放式"系统设备^7，8，9的开发。然而，采用玻璃化到临床实践是缓慢的，因为它是在一个时候缓慢冷冻囊胚进行了改进，还发生。成功的常规慢速速率冷冻，除了玻璃化，用在胚胎培养系统的改进对准，以及与incorporat的囊胚压扁办法离子，这增强了滋养层的两个总体存活，随后注入^10。

在过去十年中，玻璃化技术已迅速取代常规冷冻做法。在很大程度上，这是由于专业玻璃化设备的开发。一些设备已经通过引入内在设计缺陷在IVF行业¹¹所使用的设备阻碍临床玻璃化的整体安全性，效率和效益。事实上，不同的设备之间的细微差别引入程序之间显著技术变型中，通常被称为"技术签字^"12。因此，科学期刊，如可视化杂志实验（朱庇特），可以作为证明的技术细节，这将有助于减少结果差异的宝贵资源。另一项正在进行的问题在于S青梅胚胎学家继续被误导，即使在今天的基础上声称，在"开放的玻璃化系统"胚胎或卵母细胞的"超快速冷却（即用液氮（LN _2）直接胚胎接触）是优化的前提条件成功率"。显然，这种信仰是不准确的基础上，无菌的成功经验封闭系统^{13，14，15。}

基于玻璃化的cryobiological原理，玻璃化的功效比上冷却速率^16，17，18更高度依赖变暖率。在一般情况下，独立于所使用的玻璃化装置的，在暖速率必须超过的冷却速度，以确保高的存活率。高变暖速率尽量减少任何冰的增长（ 即 RECR机会期间变暖的失透相在低温溶液核杂质）ystallization。理所当然的，玻璃化溶液（ 即，类型和所用冷冻保护剂的浓度）的稳定性可能有混淆的效果，但是这是在一个单独的出版物¹¹寻址。考虑到冷却速度变暖问题，MicroSecure玻璃化（μS-VTF）在2008年被开发为一种廉价，非商业，FDA标准的方法优化玻璃化的质量控制方面的问题。这是因为它提供了防篡改，内化，双色标记是唯一的。此外，通过装载和直接在用于移液无菌flexipette存储胚胎（即没有吸移到辅助装置表面），并通过使用使用自动缩放器完全焊封，技术变化已经有效地消除离聚物树脂吸管。

在评估的C为潜在用途的玻璃化设备ompleteness，有应考虑几个质量控制的因素，包括:1） 标注电位 -可以标签牢固附着？他们在防篡改？他们提供了双颜色标识的潜力？是否需要一个次要的标签，并可以在标签保存记录（ 即病人的验证）气候变暖后很容易地删除？ 2） 技术轻松 -能胚胎很容易装入/到设备，及时，简单地识别和跟踪升温后？ 3） 程序简单/重复性 -Does玻璃化方法提供简单，可靠，可以轻松地允许重复性，其中技术人员（内部）和项目（外部）之间的变化降到最低？ 4）LN ₂的存储容量 -可以在设备上轻松和安全地处理，并确定了？是他们的申通快递风靡全球的潜在空间效率？从是否物理损坏或可能的污染物如无菌封闭系统的设备提供安全保障？ 5） 恢复潜力/生存能力 -Is器件设计容易出现胚胎的保证回收潜在的问题，并能可靠地玻璃化并保持完整的细胞的完整性后变暖？后者具体质量的关注，回收率，实际上已令人惊奇地最小化在已发表的报告;这是由通常藏身于一般好的生存率不利的结果（ 即，丢失胚胎或卵子）完成的。任何容易出现不一致的恢复时间（<99％）的设备存在严重缺陷，并构成一个程序的责任。

我们的无菌，封闭μS-VTF方法已发展战略性考虑到每个质量控制措施。然而，5年内优良临床成功和确认¹⁴之后，程序不得不吨Ø修改。原0.3毫升胚胎吸管（具有疏水塞）从体外受精行业中除去，并用0.3毫升精液吸管具有一个标准的棉/ PVP插头（ 即，重新标记为精液/胚稻草）取代。该程序文件概述安全，简单和有效地执行μS-VTF所需要的具体步骤和策略。此外，我们强调需要可靠地占供给的限制的变形（多个），直至作为替代理想吸管容器重新放回临床实验室。

Protocol

μS-VTF 程序的开发是作为 2008-2009 年批准的机构审查委员会 （IRB） 研究的一部分（Aspire IRB，Santee，CA）关于人类卵母细胞和胚胎冷冻保存。此后，该程序已常规应用于签署知情同意书的不孕症患者的临床治疗。

1. 质量控制注意事项

1. 如果在一天内冷冻保存多组胚胎，请使用不同颜色（例如，笔、标签或识别 （ID） 杆或塞子）来区分患者。
2. 为每位患者使用不同的培养皿和移液器。将囊胚从一种溶液移动到另一种溶液时，尽量减少转移的培养基体积。
3. 每个吸管或装置冷冻保存一个囊胚。保持无菌/无菌技术并遵守所有安全预防措施。
4. 在开始手术之前，确认医生转诊表并签署患者同意书。检查库存中患者胚胎的处置情况。
5. 如果要将囊胚转移到其他设施，请使用"免责和运输同意书"。确保所有签名都在现场见证或经过公证。
6. 酌情确认培养基和蛋白质补充剂的适当质量控制措施，包括生物测定、内毒素测定以及有效期/批号验证和跟踪。
7. 为临床低温保存结果监测和评估建立关键限值（即低关注度），例如恢复率：< 95%，存活率：< 80%，使用单倍体囊胚的临床妊娠率：< 50%。

2. 冻存程序

1. 制备
   1. 完成适当的文书工作，包括将数据输入工作表、冻存数据库和库存日志。
   2. 准备新鲜的冻存溶液或使用商业来源（遵守制造商推荐的储存和保质期条件）。
   3. 稻草准备。
      1. 打开个体化无菌包装的贴标面。将传统 0.3 mL 胚胎吸管上的填充喷嘴紧紧抓住包装，部分提起并拉出吸管，从而拆下该喷嘴;这将使标签端暴露在环境条件下，而吸管则无菌地放在塑料包装内。
         1. （修改）对于 0.3 mL 精液/胚胎吸管，将塞子向下推 0.5 厘米。通过使用基本的桌面脉冲封口机，在棉 PVP 塞子前面应用内部密封。
         2. 将吸管放在电极的特氟龙表面上，就在插头的前面。按下手柄以激活加热。当红灯出现时松开手柄。为确保完全焊接密封，请在足以使相对表面变平的温度下加热，然后将其翻转 180° 并重新密封相对表面¹⁹ 根据需要。
   4. 使用低温标记器，在每根吸管/设备和低温杯上标记患者姓名、唯一 ID 号（例如 SSN、DOB 或患者 ID 号）和冷冻日期。此外，在每个吸管/设备上包括一个唯一的编号（例如，1、2、3 等）。
      1. 将标签（最好是彩色的）固定在彩色加权 ID 杆上，以插入并密封到 0.3 mL 胚胎吸管中。将吸管放回其单独的无菌包装中，直到使用。
         注意：如果只有 30 mm 的彩色配重内径杆可用，则需要在内径杆的每一侧附近额外插入两个滚珠轴承。
   5. 用唯一的刻字 ID 号识别每根手杖。确定 LN₂ 储罐编号和罐编号，以便每位患者的样本可以长期存放。
   6. 通过用患者姓名、溶液 ID 和胚胎/保持液滴 ID 标记底面来准备新鲜的冷冻培养皿 （100 mm）（图 1A）。具体来说，设置 4 行液滴：等渗异渗缓冲培养基（顶部）、V1（平衡溶液 （ES））、V2（中间溶液 （IS））、V3（玻璃化溶液 （VS）;底部）。在右上角写下带有标记列的胚胎 ID。
      注意：使用一系列 25 至 50 μL 洗涤液滴 （n = 3），以确保每个单独的最终 10 至 15 μL 固定液滴/溶液类型（即 V1、V2 或 V3）都是纯净且未稀释的。使用这种方法，最多可以使用单个培养皿对五个单独的胚胎进行玻璃化。不使用时，请盖上每个培养皿，以避免液滴在室温下蒸发/脱水。
   7. 通过从基端切下 3 cm 来制备无菌 flexipettes（称为"VTF tips"）。将它们插入单个移液器（设置为 3 μL）并将移液器-VTF 吸头直立放置在聚苯乙烯泡沫塑料管架中（图 1B）。
2. 胚胎选择
   1. 确认患者/样本识别。
   2. 使用倒置显微镜（放大 200 - 400 倍），根据加德纳分级系统对囊胚进行分级和分类²⁰，分别使用数字分类 1 到 6 表示早期到孵化的囊胚，并将 A、B 或 C 等级分配给内细胞团 （ICM） 和滋养外胚层 （TE><）。 注意：为了准备囊胚活检和整倍体分析，在第 3 天通过激光消融术预先孵化透明带，以促进 TE 的早期突出，因此需要修改分级分类²。简而言之，3 级全囊胚表现出高达 10% 的 TE 疝，4 级扩大的囊胚有 10 - 50% 的孵化，5 级孵化囊胚有 > 50% 的 TE 挤压（图 2A-C><）。 注意：我们倾向于在第 5 天或第 6 天冷冻保存 ≥BB 质量的 3 级或更高级别的囊胚。然而，较低质量 （C） 的玻璃化囊胚和早期阶段的压缩后胚胎（包括桑椹晚期至 1 级或 2 级囊胚）肯定可以在温暖中存活，完全完整，并产生能够实现活产的活胚胎。
   3. 在使用低摩尔浓度玻璃化溶液（< 6.5 M 或 40% v/v）时，通过微穿刺滋养外胚层连接或对滋养外胚层细胞进行激光脉冲消融^{21，在低温稀释过程开始之前塌陷每个囊胚}的囊胚><。 注意：塌陷囊胚的需要不依赖于设备。在我们自己早期开发的 μS-VTF （2008） 中，我们最初成功地将乙二醇 （EG）/DMSO 溶液用于卵母细胞（1 例足月妊娠中的 1 例），但小鼠囊胚的存活率/发育不理想 （< 80%）¹⁶ 被其他人经历过²¹。由于我们目前的 VTF 系统（自 2009 年以来）使用基于高摩尔甘油的溶液（超过 7.9 M），因此不需要物理囊胚塌陷。然而，一般来说，孵化的囊胚的选择性孵化是可取的。
3. 冷冻稀释和囊胚加载
   1. 从培养箱中取出患者培养皿，并与另一个人确认患者/标本识别（即，由次要来源见证），然后再取出要玻璃化的胚胎。
   2. 按照步骤 2.2.2 确认囊胚发育，更新冷冻数据表，并在立体显微镜下，将囊胚从培养皿中移液到冷冻培养皿的等渗保持液滴中。
   3. 使用玻璃化 flexipette（即 VTF 尖端）将每个囊胚移动到单独的固定液滴中。
   4. 将每个囊胚移动到 V1 （ES） 溶液中。
      1. 用 V1 溶液 （3 μL） 预填充 flexipette，并将一半的内容物放在胚胎上。
      2. 吸出胚胎并移动到三个 V1 洗涤液滴中的第一个（在步骤 2.1.6 中提及），在周边吸取胚胎 2 - 3 次，并清除液滴中的移液器内容物（避免气泡形成）或培养皿表面的外部。
   5. 用下一个 V1 洗涤液滴填充 VTF 尖端，并重复胚胎的抽吸。重复第三次并将囊胚移动到单个 V1 固定滴。稀释/洗涤步骤应需要 30 至 45 秒。用下一个解决方案（例如，V2）预加载每个 VTF 吸头，将移液器插入架子中，然后使用下一个移液器（根据步骤 2.1.7 中的设置）（图 1B）
      注意：由于在含有 V1 和 V2 溶液的非二甲基亚砜 （DMSO） 中的总暴露时间为 5 分钟，因此考虑到最后的 V3 步骤需要每个囊胚至少 1 分钟才能执行，因此应在该间隔内均匀交错分配单个囊胚的移液。例如，如果玻璃化组中有 4 个囊胚，则以 75 秒的间隔移液囊胚 #1-2-3-4><。 注意：上述创新 Cryo Enterprises （ICE） 稀释方案与大多数其他商业玻璃化程序明显不同，后者通常涉及含 DMSO 的溶液。这些方案通过逐渐但控制较少的洗涤液（即等渗培养基）、ES 和 VS 的合并来实现相同的逐步稀释。
   6. 使用 V2 （IS） 解决方案重复步骤 2.3.4 和 2.3.5。
   7. 使用 V3 （VS） 解决方案重复步骤 2.3.4 和 2.3.5
   。
   8. 将每个囊胚放入 V3 固定液滴中后，清除 VTF 尖端（液滴外）的残留溶液和气泡，然后用胚胎周围干净的 V3 完全填充尖端。排出大约三分之一的体积 （1 μL），并将囊胚和剩余的 V3 完全移液到 VTF 尖端中。
   9. 从移液器中取出 VTF 吸头，使用无菌纱布垫擦干吸头外表面残留的 V3，然后将吸头端先插入预标记吸管的开口端。"干吸管尖端"对于防止可能的吸管内部粘附至关重要。
   10. 倒置吸管（标签端朝下），观察内塞或密封件处的尖端，并用 1 厘米的空气空间安全地密封开口端。最好使用自动密封装置（例如 Syms I）来消除技术变化。
       注意：使用由离聚物树脂塑料（例如 HSV 或 μS-VTF）组成的吸管的优点是，使用任何正确作的热封装置都会产生可靠的"焊接"密封，如步骤 2.1.3.1 中所述。
   11. 密封后，将封闭的吸管直接放入不锈钢杜瓦瓶中的 LN₂ 中，然后将吸管放入连接到患者手杖上的开口高脚杯中进行储存><。 注意：由于 μS-VTF 吸管使用 40 mm 加重的内径杆来抵消充气吸管的浮力，因此除非涉及运输，否则不需要使用倒置的高脚杯或空的冻存管来覆盖标本。
4. 加热和冷冻溶液洗脱/稀释
   1. 确认医生转诊表，了解玻璃化胚胎移植日期、预定时间和胚胎详细信息（解冻/移植的次数、PGS 测试时的具体胚胎编号等）。
   2. 准备新鲜的加热溶液（1.0 M 蔗糖储备溶液）和/或使用商业来源（建议使用后 1 周至 1 个月的保质期，4 °C 储存）。
      在
      1. 初次打开时（例如，每周供应来源）将 17.1 g 蔗糖分装到 50 mL 无菌培养瓶中，因为反复暴露在环境环境中时，内毒素可能会积聚在蔗糖颗粒中。
      2. 将预先称重的颗粒蔗糖混合到溶液中（1.0 M 原液 = 3.42 g/10 mL Hepes 缓冲人输卵管液 [H-HTF]），并将溶液加热至 37 °C 以增加颗粒的溶解度。反复倒置容器以帮助加速并完成最终混合。
         注意：对于粘性溶液（> 0.5 M 蔗糖）或大体积溶液，建议使用正压过滤装置进行过滤（0.22 μm 过滤器）。手动压力泵足够且价格低廉，而电动泵噪音大，会引起振动，根本不需要。
   3. 每位患者温热 （37 °C） 一管 10 mL 1.0 M 蔗糖溶液和 H-HTF 培养基，用于 μS-VTF 加热浴。
   4. 通过在盖面上标记患者姓名和解决方案 ID 来准备新鲜的解冻皿（6 孔板><）。 注意： 在本例中，我们使用：（1） T1 洗涤液（200 μL，无油覆盖层，（2） T1 （100 μL），含 1 mL 油，（3） T2 （100 μL），（4） 含油的 T3 （100 μL），（5） 含油的 T4 （100 μL），以及 （6） 含 10% 人血清白蛋白 （HSA） 或 20% 血清替代品的 T5/200 μL 等渗 HEPES 缓冲培养基，不含油覆盖层。应用通用蔗糖溶液降级方案 - T1 = 1.0 M，T2 = 0.5 M，T3 = 0.25 M，T4 = 0.125 M - 如果 ICE 或其他商业来源不可用，如慢速冷冻胚胎所建议的那样²²。此外，请注意，初始 T1 洗涤和最终 T5 平衡可以在 30 mm 培养皿和用于上述步骤 2-5 的 4 孔培养皿中进行，涉及油覆盖。
   一次
   5. 只解冻一个患者的胚胎。
      1. 检查医生转诊表并确认周期，然后再加热指定数量（即 1 或 2 个囊胚）;通过观察渗透变化（即收缩和再水合）和完整的膜来评估生存/可能的活力，如果有疑问，请在加热另一个囊胚之前联系医生和/或患者。
   6. 与同事确认患者/标本身份（即由第二来源见证）。
   7. 将患者手杖放入装满 LN₂ 的杜瓦瓶中并分离，确定要加热的吸管。
   8. 将 6 孔稀释皿带到立体显微镜载物台的中心。将 60 毫米培养皿放在一侧（即，取决于技术人员的左手或右手偏好），加入加热的蔗糖 （1.0 M） 和 H-HTF 溶液，制成 0.5 M 蔗糖加热浴（未覆盖><）。 注意：VTF 吸头仅在 0.5 M 蔗糖溶液中加热作为 QC 保护措施，以确保在胚胎在快速升温时排出的罕见情况下保持胚胎活力²²。
   9. 将上吸管密封保持在液位以上以确认身份，然后使用梅奥剪刀抓住并固定内部塞子下方的吸管（VTF 尖端仍应浸入 LN₂ 中）。
      作为
      1. QC 预防措施，用剪刀用力敲击杜瓦瓶上的剪刀（几次），从吸管内侧壁上取下 VTF 尖端;如果 VTF 尖端粘附，则敲击可确保尖端底部下降到与标记端相对的密封端，从而在插头端附近提供空气空间。
   10. 用剪刀将吸管水平提起到环境空气中（立体镜表面旁边或下方），并抓住未标记的一端（标签在右侧）。剪断内塞或密封件处的吸管，然后将其抬到温暖的浴盘上方。将 VTF 尖端以 60° 角倒入温暖的蔗糖浴中，直到它完全挤出并迅速加热（> 6,000 °C/min）;Flexipette 的底座将位于碟形天线侧壁上方。
       1. 让 VTF 尖端自由落体到浴缸中。如果吸管尖端没有立即出现，请轻轻敲击吸管上表面。如果它只出现一半，请用剪刀或细镊子抓住 flexipette 的轴来帮助挤出。
   11. 5 - 10 秒后，抓住移液器底座并插入一次性移液装置;球上的孔在插入时起到释放压力的作用。用食指盖住球孔，轻轻挤压球，在通过立体显微镜观察的同时将玻璃化的囊胚释放到 T1 洗涤液中 （#1）。确认后，通过正压清除残留的 V3 （VS） 溶液和气泡，将内容物排空到中心未使用的丢弃井中。启动 5 分钟计时器。
       注意：所有蔗糖稀释步骤均在室温 （21 ± 2 ºC） 下进行。
   12. 取下 VTF 吸头并将其放在移液器上。继续将胚胎在油下移至 T1 #2 中剩余时间（约 3 - 4 分钟）。
       1. 如果需要第二个囊胚进行移植，请在开始步骤 2.4.12 之前立即从患者身上加热第二个吸管和 VTF 尖端（重复步骤 2.4.9 - 2.4.11）。将两个囊胚一起移动，在 T1（1.0 M 蔗糖）中至少洗脱 3 分钟。
   13. 用下一种溶液预填充 flexipette，然后每隔 3 分钟移动并稀释 T2、T3 和 T4 中的囊胚。如果透明带之前没有进行过激光消融（即阴影），请在 T4 中进行。将培养皿放在倒置显微镜的载物台上，并在计算机显示器上对胚胎进行成像。将区域对齐到指定的红色圆圈内，并激活二极管激光器的 2 或 3 次脉冲（从卵周间隙的边缘开始并向外移动）以创建开口^2，19。
   14. 在温暖的表面 （37 °C） 上平衡 T5（即等渗培养基）中的囊胚 5 分钟。
   15. 根据完整细胞膜的主要存在以及均匀、半透明的细胞质，没有 Pyknotic 变暗来评估初始胚胎存活率。在胚胎移植前将胚胎培养 2 - 6 小时，此时应重新评估和记录胚胎发育/存活><。 注意：如果在转移时存在超过 1 个活囊胚，并且患者选择只进行 1 个囊胚，则可以通过重复步骤 2.3.3 - 2.3.11 成功地重新玻璃化 （rVTF） 补充囊胚。在单个 rVTF 事件后，我们有几例确认的活产婴儿。
       注意：rVTF 已实验进行多达 5 次，对在亚稳态甘油基溶液中玻璃化的非整倍体人囊胚的存活/活力没有显着影响。

Results

2012 年至 2014 年 6 月期间，对 1,341 个玻璃化囊胚进行了加热，1,341 个胚胎恢复 （100%），而 1,316 个存活 （98.1%）。活检囊胚的存活率超过 99.5%。根据疾病控制中心和辅助生殖技术协会最近报告的国家统计数据，在主要移植单个、经过基因测试的整倍体玻璃化胚胎后，我们能够实现美国最高的植入率和活产率，与年龄无关（图 3）²⁰（表 1 和表 2).单独评估冷冻保存周期的良好预后患者群体（小于 35 岁）（表 1），我们实验室在植入率（即胚胎建立妊娠的效率）和最终活产率方面都优于全国平均水平 30% 以上。此外，在 2014 年年中，我们使用 70 个研究同意的再玻璃化非整倍体囊胚对我们的改良储存吸管进行了初步验证/验证，结果实现了 100% 的恢复率和 100% 的存活率。

图 1. MicroSecure VTF 设置。 VTF 培养皿 （A） 由 3 行不同的玻璃化溶液组装而成，这些溶液利用 3 个洗涤液滴，然后放入不同的编号保持液滴中。此外，带有缩短 VTF 吸头的单个移液器（即 300 μm ID Flexipettes）被固定并组织在聚苯乙烯泡沫塑料管架 （B） 中，该管架可以旋转以便有序使用。请注意，具有代表性的一次性微量移液器球移液组件位于聚苯乙烯泡沫塑料架上。请点击这里查看此图的较大版本。

图 2. 改良的囊胚分级系统。 我们改良的 Gardner 囊胚分级系统考虑了 TE 细胞的诱导疝，以促进囊胚活检。该修改考虑了完整的囊胚过早孵化（A：3 级 = 小于 10% 的脑疝）和扩大的囊胚（B：4 级 = 高达 50% 的脑疝），而孵化的囊胚 （C） 的脑疝大于 50¹⁶。请点击这里查看此图的较大版本。

图 3.比较妊娠结局。在累积的 1.5 年间隔内，比较妊娠数据，以评估转移玻璃化加热的整倍体囊胚（n = 172 个周期/144 次转移）与非 PGS 周期（n = 160 个周期/153 次转移）的影响，主要涉及新鲜转移¹⁸。出于我们的实验目的，该数据清楚地表明，通过 μS-VTF 程序玻璃化的活检囊胚保持其活力。请点击这里查看此图的较大版本。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> 数据源 # 循环 移植的胚胎数平均值 # 植入率 （%） 活产率 （%） NB 实验室 * 144 元 1,2 74.00% 74.50% 全国平均 20,423 1,7% 39.60% 44.10% * 数据是根据奥兰治县生育中心、南加州生育中心和南加州生殖医学中心诊所 2014 年的表现平均的，使用目前的 Ovation 生育实验室 （NB Lab），该实验室于 2008 年创立了 microSecure 玻璃化手术。

表 1。2014 年 CDC 辅助生殖统计。 使用我们的 NB 实验室，来自三个报告医师诊所的 35 岁以下女性的冷冻胚胎移植妊娠数据，与美国 2013 年全国平均水平 450 多家报告诊所进行比较。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> SART 全国平均数 诊所 - 州 女人 女人 女人 女人 < 35 岁 35-37 岁 38-40 岁 41-42 岁 SCCRM-CA * 63.1% 58.3% 40.6% 32.3% CCRM-CO * 64.7% 61.5% 40.4% 32.2% RMA-新泽西州 * 63.2% 59.7% 34.6% 18.7% 全国平均 48.6% 38.3% 24.3% 12.3% SCCRM - 南加州生殖医学中心;CCRM — 科罗拉多生殖医学中心;和 RMA — 生殖医学协会 * 这些领先的诊所都主要实施了玻璃化胚胎移植周期，并与植入前基因检测相结合，纳入其患者护理的标准实践中，以优化每个移植胚胎的活产成功率。

表 2.2014 年辅助生殖技术协会 （SART） 报告，使用我们位于加利福尼亚州纽波特海滩的 Ovation 生育实验室的 SCCRM 诊所的累积活产率与其他几个受人尊敬的计划以及 SART 全国平均水平形成对比。

Discussion

如今，人们对实现囊胚完全存活率（> 95%）并实现与新鲜胚胎相似的植入成功率寄予厚望。一些团体认为，当将完整的冷冻保存胚胎移植到健康的、非激素刺激的子宫中时，玻璃化胚胎移植周期的活产率甚至可能高于新鲜囊胚。我们的数据清楚地表明，玻璃化有效且可靠地维持了新鲜胚胎的活力。此外，我们已经证明，我们的无菌封闭方法，称为 MicroSecure 玻璃化 （μS-VTF），可以达到与 IVF 行业使用的商业标准（即 开放式设备系统）相当或更高的最佳结果。

差异与使用多种玻璃化设备/方法的个体之间的技术可重复性和可靠性有关。反过来，这导致应用玻璃化的程序之间不一致。因此，设备熟悉度是影响实验室熟练程度和成功结果的重要因素也就不足为奇了。正是这种“技术签名”¹¹ 的概念解释了为什么程序之间的可重复性可能存在问题。十几种商业设备的发展不仅使这一现象变得复杂，还引发了质量控制问题。幸运的是，封闭式玻璃化系统，如μS-VTF，Rapid-I和VitriSafe，现在被证明对开放式设备系统同样有效12,13,14。

MicroSecure VTF 是一种新型的无菌玻璃化技术，在开发时考虑到了技术上的易用性、可靠性和冷冻安全性。通过结合使用两种先前批准的、符合 FDA 标准的设备，它是一种非商业玻璃化系统，与专用设备相比，具有低成本的明显优势。此外，其独特的防篡改和内部化双色标签系统，以及许多其他质量控制优势，使 μS-VTF 成为有吸引力的全球选择¹¹。然而，作为一种非商业性的VTF设备，其广泛的行业应用正在缓慢发展。只有通过持续发表其安全性、保障性和临床有效性，μS-VTF 的利用率才会越来越高。

2014年8月，当面临无法获得使用内部非芯吸疏水塞制造的原始0.3 mL胚胎吸管时，我们能够可靠地修改μS-VTF方法。简而言之，新型 0.3 mL/胚胎吸管及其棉花 PVP 塞得到了有效的适应。这只是通过在棉塞之前创建内部密封来实现的，从而防止与开放式 VTF 尖端（即含有 胚胎或卵子的柔性纤维）接触和液体芯吸。此外，如果无法接触到 40 毫米内径杆，则可以使用两个滚珠轴承来平衡与较轻的 30 毫米杆相关的浮力问题。

这些额外的步骤使该技术稍微不那么简单，但仍然非常有效。如今，经济性和功效正成为越来越重要的问题，因为活检囊胚通常单独玻璃化，直到其整倍体状态在遗传学报告中得到确认。经患者同意，经患者同意的囊胚通常会在数周内被丢弃。因此，大多数（> 50%）的 VTF 设备在短期存储后被丢弃，导致使用商业设备时的年度成本不断上升。总体而言，μS-VTF 是一种高效、可靠且可重复的人类囊胚冷冻保存程序。卓越的质量控制设计安全地标记和安全地储存胚胎/卵母细胞，同时消除恢复失败并优化升温后的存活率和活力，这证明了该系统作为胚胎玻璃化的通用方法的合理性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
铝制甘蔗	IVM	XC055
滚珠轴承，3/32 英寸	VXB.com	KIT15977	不锈钢
CBS 精液/胚胎吸管，0.3 mL	CryoBioSystems	25292	独立无菌
彩色，ID 杆，30 mm	CryoBioSystems	019021-26	加重
培养管，15 mL	Falcon	352099	锥形管
培养管、10 mL	Falcon	352057	卡扣盖
冻存套	Nalgene	5016-001
过滤器、250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 &亩m
培养瓶，组织培养 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes，300 μm ID	库克医学。	K-FPIP-1300-10BS-5	无菌，20 个/包
镊子，大	Miltex	6-30TC
镊子，碎片 - 细	Miltex	17-305
高脚杯	IVM	PA003
热封机，SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V 或 220 V，带适配器
Hepes 缓冲介质	Life Global 或	LGGH-100; 100 mL，或	以 2 - 8 º 储存;C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	，带非必要的AA
标签，Cryo	GA International	CL-23T1	各种颜色
的液氮罐，40 L	MVE 或 Taylor Warton	各种	液体储存
LN2;杜瓦瓶，0.5 L	Hampton Research	HR4-695	不锈钢
6 孔卡斯特培养皿	Biogenics	015/020	塑料器皿每箱
移液器球，微帽	Drummond	Fisher#13681451	球顶
培养皿上的孔，35 mm	Falcon	351006
培养皿，58 mm	Nunc	150288
培养皿，100 mm	Falcon	351029
移液器吸头，ART long	Fisher Sci。	02-707-80	10 - 100 μL
移液器辅助	Drummond 或 Falcon	各种	充电
移液设备，剥离器	Cooper 外科	MXL3-STR
移液器，血清学 1 mL	Falcon	357521
移液器，血清学 2 mL	Falcon	357507
移液器，血清学 5 mL	Falcon	357543
移液器，血清学 10 mL	Falcon	357551
剪刀，外科手术 Mayo	Miltex	5-SC-16
立体显微镜	尼康，奥林巴斯，徕卡	各种
无菌纱布垫，4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
合成血清	Life Global，或	LGPS-20;20 mL，或	以 2 - 8 º 储存;C
	Irvine Scientific	SS-99193;12 x 10 mL	购买低内毒素批次
蔗糖	Sigma Chemical Co.	#S9378	分装成 50 mL 培养瓶，1 年; 17.1 g/瓶 + 培养基至 50 mL; 制成 1 M 溶液; 滤光片 0.22 & micro;m 单位
定时器	Nalgene	5016-001
解冻液	创新 Cryo Enterprises	BL-TS （≤1.0 M 蔗糖）	T1、T2、T3、T4;在 2 - 8 º 处撕裂;C 代表 ≤开封玻璃化溶液 1 个月后
*，**	创新的 Cryo Enterprises	BL-VS （≥7.9 M [甘油/EG]）	V1、V2、V3;以 2 - 8 º 储存;C 代表 ≤开封
* 非渗透性冷冻保护添加剂可能包括：蔗糖、纤维和透明质酸钠）
** 其他市售制剂通常是乙二醇 （EG）/二甲基亚砜 （DMSO;30% v/v;4.8 M），但也可能是 EG/丙二醇（32% v/v;5.2 M）。混合溶液通常用于减少对高摩尔溶液的低温毒性的担忧。商业解决方案通常包括 ES 和 VS 解决方案。商业制剂的配方通常是专有财产。