改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

摘要

MicroSecure玻璃化冷冻技术是一种非商业化、无菌封闭式玻璃化冷冻装置系统，符合美国食品药品监督管理局（FDA）的优良生产规范和组织处理规范。由于行业内已停用疏水性带塞胚胎 straw，该玻璃化冷冻程序已改进，增加了一道内封步骤，置于标准的内部棉塞之前。

摘要

临床胚胎玻璃化冷冻技术随着独特的玻璃化冷冻装置的发展而不断进步^st 世纪，并伴随着对在超快速冷却过程中 "开放" 系统即， 直接淋巴结₂ 接触）对于优化玻璃化冷冻的成功至关重要。围绕冷却速率重要性的教条导致了存在安全隐患的操作，这些操作易受技术差异的影响，并催生了一些忽视重要质量控制因素的玻璃化冷冻装置。例如， 使用便捷性、可重复性、可靠性、标签安全性及储存安全性）。了解其他设备的质量控制缺陷，有助于开发出一种安全、可靠、可重复且结果稳定的微型封口-玻璃化冷冻（µS-VTF）方法，旨在最大限度地减少不同技术人员之间以及同一技术人员在不同操作之间的差异。同样重要的是，该方法结合了两种现有且符合美国食品药品监督管理局（FDA）标准的设备：1）一种容量为0.3 mL的离子型树脂胚胎细管，内置双色防篡改标签，并具备可重复热封的密封性能；2）经截短处理的常用内径为300 µm的无菌柔性移液管（flexipettes），可直接用于装载胚胎，从而构建出一种高效、全球适用的玻璃化冷冻装置。该系统与其他无菌封闭式玻璃化冷冻系统类似（例如， 高安全性玻璃化冷冻法（HSV）、Rapid-i 和 VitriSafe）在生殖医学中有效应用的同时，微安全玻璃化冷冻法（µS-VTF）因其操作简便且技术变异小，已证实可实现较高的解冻后存活率和妊娠率。尽管原本商业化的含内部疏水性塞的0.3 mL胚胎细管已被带有棉-聚乙烯吡咯烷酮（PVP）塞的标准精液细管所取代，但其离子型树脂成分得以保留，以确保热封密封效果。然而，棉质塞在接触时可能通过灯芯效应将flexipette中的液体-胚胎内容物吸出。为此，对µS-VTF方法进行了改良，在装置装载侧的塞子之前增加了一道额外的内部热封。尽管该改进为µS-VTF流程增加了一个技术步骤，但并未影响其成功应用，仍保持了高存活率（> 95%）且妊娠率至今仍保持较高水平。

引言

玻璃化冷冻是辅助生殖技术中最具影响力的一项技术 体外 自胞浆内单精子注射技术发展以来，体外受精（IVF）行业取得了重大进展。如今，囊胚经冷冻保存后仍能保持胚胎活力，避免了以往传统慢速冷冻方法所导致的活力下降问题¹随着胚胎解冻后存活率的可靠保障，不孕治疗领域正逐步转向优先采用冷冻胚胎移植周期，其妊娠成功率与传统的鲜胚移植相当甚至更高。结合囊胚活检和植入前遗传学筛查（PGS），玻璃化冷冻已成为一项关键的临床技术，通过整倍体单胚胎移植，优化健康活产结局。^2,3.

小鼠胚胎玻璃化冷冻技术于20世纪80年代中期开发而成^4,5 并于1990年被应用于畜牧业⁶基于玻璃化冷冻溶液能够形成一种亚稳态的玻璃态，避免有害冰晶形成的原理，该技术已被证明能更高效地保存胚胎的完整细胞结构。有趣的是，尽管如此，玻璃化冷冻技术在人类胚胎学领域的广泛应用前景直到21世纪初才开始逐步实现。^st 世纪。早期推广玻璃化冷冻技术应用的出版物与独特方法的发展同时出现 "开放" 系统设备^7,8,9然而，玻璃化冷冻技术在临床实践中的应用进展较为缓慢，因为当时传统的缓慢冷冻技术也在不断改进。成功的常规慢速冷冻技术与玻璃化冷冻技术的发展，均伴随着胚胎培养系统的优化，以及囊胚腔塌陷技术的应用，这些进步共同提高了滋养外胚层的整体存活率，进而提升了着床率。¹⁰.

在过去十年中，玻璃化冷冻技术已迅速取代了传统的冷冻方法。这在很大程度上得益于专用玻璃化冷冻装置的开发。然而，其中一些装置因引入了固有的设计缺陷，反而在一定程度上影响了体外受精（IVF）行业中临床玻璃化冷冻的整体安全性、效率与有效性。¹¹确实，不同设备的细微差异会在各项目之间引入显著的技术变异，通常被称为 "技术特征"¹²因此，像《可视化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments, JoVE）这样的科学期刊可作为展示技术细节的宝贵资源，有助于减少结果的变异性。另一个持续存在的问题是，时至今日，一些胚胎学家仍然基于某些说法而存在误解， "胚胎或卵母细胞在“开放玻璃化冷冻系统”中的超快速冷却即， 胚胎与液氮（LN₂）直接接触₂)) 是提高成功率的前提条件。" 显然，这种观念是不准确的，因为无菌封闭系统已被证实具有显著的成功应用。^13,14,15.

根据玻璃化冷冻的低温生物学原理，玻璃化冷冻的效果在更大程度上依赖于复温速率，而非降温速率^16,17,18。通常情况下，无论使用何种玻璃化冷冻装置，复温速率必须超过降温速率，才能确保较高的存活率。较高的复温速率可最大限度地减少在复温过程的脱玻璃化阶段发生冰晶生长（即冷冻溶液中已成核杂质的再结晶）的可能性。诚然，玻璃化溶液的稳定性（即所用冷冻保护剂的种类和浓度）可能会产生混杂效应，但这一点已在另一篇出版物中专门讨论¹¹。鉴于降温与复温速率的问题，MicroSecure 玻璃化冷冻法（µS-VTF）于2008年被开发出来，作为一种经济、非商业化且符合美国食品药品监督管理局（FDA）规范的方法，优化了玻璃化冷冻过程中的质量控制环节。该方法的独特之处在于采用了防篡改、内置式、双色标记系统。此外，通过将胚胎直接装载并保存在用于移液的无菌柔性吸头（即无需将样本转移至第二装置表面）中，并使用可通过自动封口机实现完全热熔密封的离子聚合物树脂细管，有效地消除了技术操作中的变异因素。

在评估玻璃化冷冻装置的完整性以确定其潜在用途时，应考虑以下几个质量控制因素，包括：1）标签适用性——标签能否牢固粘附？是否防篡改？是否具备双色识别功能？是否需要附加标签，且在复温后标签能否方便地移除以用于记录保存（例如，患者身份核验）？2）操作便捷性——能否及时、简便地将胚胎装载到装置上，并在复温后轻松识别和追踪？3）操作简便性与可重复性——该玻璃化冷冻方法是否具备简单性和可靠性，从而易于实现操作的可重复性，以最大限度减少技术人员之间（内部）及不同项目之间（外部）的操作差异？4）液氮（LN₂）储存能力——这些装置是否易于安全操作和识别？其储存空间利用是否高效？该装置是否作为一个无菌封闭系统，能够提供防止物理损伤或潜在污染物的安全保障？5）回收率/存活率——该装置的设计是否存在影响胚胎可靠回收的潜在问题？胚胎能否稳定地实现玻璃化冷冻，并在复温后保持完全的细胞完整性？其中关于回收率这一具体质量关注点，在已发表的报告中实际上被意外地低估了；通常通过将不良结果（例如，丢失的胚胎或卵子）隐藏在总体良好的存活率数据中来实现。任何回收率不稳定（<99%）的装置均存在严重缺陷，并构成操作上的风险。

我们的无菌封闭式微体积透析液过滤（µS-VTF）方法在设计时已系统性地纳入了各项质量控制措施。然而，在历经5年卓越的临床成功与验证之后¹⁴，该操作步骤需要进行修改。原使用的0.3 mL胚胎细管（带有疏水性塞子）已从体外受精产业中淘汰，现已被带有标准棉/PVP塞子的0.3 mL精液细管所取代（即， 重新标记为精液/胚胎吸管）。本实验方案详细说明了安全、简便且有效地实施µS-VTF所需的具体步骤和策略。此外，我们还强调了在理想的替代吸管容器重新进入临床实验室之前，为可靠应对供应限制所必需的修改措施。

方案

µS-VTF 技术的开发是作为 2008–2009 年一项经机构审查委员会（IRB）批准的研究（Aspire IRB，加利福尼亚州桑蒂）中人类卵母细胞和胚胎冷冻保存工作的一部分而开展的。此后，该技术已常规应用于已签署知情同意书的不孕症患者的临床治疗。

1. 质量控制注意事项

1. 使用不同的颜色（例如， 使用笔、标签或标识（ID）棒/塞来区分患者，特别是在一天内冷冻保存多组胚胎时。
2. 为每位患者使用不同的培养皿和移液器。将囊胚从一种溶液转移至另一种溶液时，尽量减少随胚胎转移的培养基体积。
3. 每个吸管或冷冻装置中保存一个囊胚。操作过程中须保持无菌技术，并遵守所有安全防护措施。
4. 在开始操作前，确认医生转诊表及患者签署的知情同意书。核对患者胚胎在库存中的存放情况。
5. 使用一个 "免责与运输同意书" 如果囊胚需要转运至其他机构，须确保所有签名均在现场见证或经公证。
6. 根据需要对培养基和蛋白质补充剂采取适当的质量控制措施，包括生物测定、内毒素检测以及有效期/批号的核验与追踪。
7. 建立关键限值（即， 低度关注）用于临床冷冻保存结果的监测与评估，例如复苏率： < 95%，生存率： < 80%，以及使用单个整倍体囊胚的临床妊娠率： < 50%.

2. 冷冻保存程序

1. 准备
   1. 完成适当的文书工作，包括将数据录入工作表、冷冻保存数据库以及库存日志。
   2. 配制新鲜的冷冻保存溶液，或使用商品化产品（需遵循生产商推荐的储存条件和保质期要求）。
   3. 稻草制备。
      1. 打开独立无菌包装袋的标签面。抓住传统0.3 mL胚胎细管上的填充喷嘴，将其抵住包装，部分提起并拉出细管；这样可使标签端暴露于环境条件下，同时细管其余部分仍无菌地置于塑料包装内。
         1. （改良方法）对于0.3 mL精液/胚胎细管，将棉-聚乙烯吡咯烷酮（PVP）塞向管内推入0.5 cm，在其前方使用普通台式脉冲封口机进行内部密封。
         2. 将吸管置于电极的聚四氟乙烯表面，位于塞子正前方。按压手柄以启动加热，当红灯亮起时松开手柄。为确保形成完整的焊接密封，需在足够高的温度下加热，使相对的表面充分压平，然后将其翻转180°，并对另一侧表面重新进行密封。¹⁹ 根据需要。
   4. 使用冷冻标记笔，在每根麦管/装置和冷冻载具上标记患者姓名和唯一编号（例如， SSN、出生日期或患者编号）以及冷冻日期。同时在每根麦管/装置上标注唯一编号（例如， 1, 2, 3, 等。).
      1. 将标签（ preferably 彩色）固定在彩色编码的识别杆上，插入 0.3 mL 胚胎细管并密封。将细管放回其独立的无菌包装中，直至使用。
         注意： 如果仅有30毫米的彩色加权内径杆可用，则需在内径杆两侧相邻位置额外插入两个滚珠轴承。
   5. 用唯一的刻印编号标识每根手杖。标识一个LN₂ 储存罐编号和储藏罐编号，用于长期保存每位患者的样本。
   6. 使用新鲜的冷冻皿（100 mm），在皿底标注患者姓名、溶液编号以及胚胎/ holding 液滴编号（图1A）。具体设置4排液滴：等渗HEPES缓冲液（顶部）、V1（平衡液，ES）、V2（中间液，IS）、V3（玻璃化冷冻液，VS；底部）。在右上角标注胚胎编号，并标记各列。
      注意： 使用一系列25至50 µL的洗涤液滴（n = 3），以确保每种最终的10至15 µL保留液滴/溶液类型即， V1、V2 或 V3）为纯净且未稀释状态。采用此方法，可使用一个培养皿对多达五个单独的胚胎进行玻璃化冷冻。不使用时应始终保持培养皿加盖，以避免液滴在室温下蒸发或脱水。
   7. 通过从无菌flexipettes的底端切去3 cm（以下简称 "VTF 技巧"）。将它们分别插入已设定为3 µL的移液器上，并将装有VTF吸头的移液器垂直放置于泡沫塑料试管架中（图1B).
2. 胚胎筛选
   1. 确认患者/样本身份。
   2. 使用倒置显微镜（200–400倍放大），根据Gardner评分系统对囊胚进行分级和分类²⁰，采用1至6的数字分级法对从早期到已孵化的囊胚进行分类，并对内细胞团（ICM）和滋养层（TE）分别赋予A、B或C等级。
      注意： 为进行囊胚活检和整倍体分析，需在第3天通过激光消融对透明带进行预孵化处理，以促进滋养外胚层（TE）的早期突出，因此需要采用改良的评级分类方法²简而言之，3级完全囊胚的滋养层（TE）突出不超过10%，4级扩张囊胚孵化程度为10%–50%，5级孵化囊胚则具有 > 50% TE 挤出（图2A-C).
      注意： 我们优先选择在第5或第6天冷冻保存等级为3级及以上、质量≥BB的囊胚。然而，质量较低（C级）的玻璃化冷冻囊胚，以及较早期阶段的桑葚胚压缩后胚胎（包括晚期桑葚胚至1级或2级囊胚），在解冻后也完全有可能完整存活，并发育为能够实现活产的可移植胚胎。
   3. 在开始冷冻稀释过程之前，通过显微穿刺滋养外胚层细胞连接处或激光消融一个滋养外胚层细胞，使每个囊胚的囊胚腔塌陷。²¹ 若使用低摩尔浓度的玻璃化冷冻溶液（< 6.5 M 或 40% v/v
      注意： 囊胚塌陷的需要与设备无关。在我们早期开发µS-VTF（2008年）时，最初曾成功使用乙二醇（EG）/DMSO溶液处理卵母细胞（1例中1例获得足月妊娠），但效果次优（< 80%的小鼠囊胚存活/发育¹⁶ 被其他人所经历²¹由于我们目前的VTF系统（自2009年起）使用高摩尔浓度的甘油溶液（超过7.9 M），因此无需进行物理性囊胚腔塌陷。然而，通常建议对已孵化的囊胚进行选择性孵化。
3. 冷冻稀释与囊胚加载
   1. 从培养箱中取出患者的培养皿，并与另一人共同核对患者/标本的身份信息（即， 由第二人确认后，再将待玻璃化的胚胎移出。
   2. 按照步骤2.2.2确认囊胚发育情况，更新冷冻数据表，并在体视显微镜下将囊胚从培养皿移入冷冻皿的等渗保存液滴中。
   3. 使用玻璃化冷冻柔性移液管将每个囊胚转移至单独的保存液滴中即， VTF 尖端
   4. 将每个囊胚移入V1（ES）溶液中。
      1. 用V1溶液（3 µL）预填充Flexipette，将其中一半液体转移至胚胎上。
      2. 吸出胚胎并移至三个V1洗涤液滴中的第一个（见步骤2.1.6），用移液器在液滴边缘反复吹打胚胎2-3次，将移液器内的液体排入液滴中（避免产生气泡），或排至培养皿表面。
   5. 用下一个V1洗涤液滴填充VTF吸头，重复吸取胚胎。重复此步骤第三次，并将囊胚转移至单独的V1保存液滴中。稀释/洗涤步骤应持续30至45秒。每次均需预先用下一溶液填充VTF吸头。例如， V2），将移液器插入支架中，并使用下一个移液器（按照步骤 2.1.7 中的设置）（图1B).
      注意： 由于不含二甲基亚砜（DMSO）的V1和V2溶液中的总暴露时间均为5分钟，因此在该时间间隔内应均匀错开各个囊胚的移液操作，同时需考虑到最后的V3步骤每枚囊胚至少需要1分钟完成。例如，若玻璃化冷冻组中有4枚囊胚，则应每隔75秒依次移取囊胚#1-2-3-4。
      注意： 上述描述的Innovative Cryo Enterprises（ICE）稀释方案与大多数其他商业玻璃化冷冻程序明显不同，后者通常使用含二甲基亚砜（DMSO）的溶液。这些方案通过洗涤液与冷冻保护剂溶液之间逐步、但控制性较差的混合来实现相同的梯度稀释过程。即， 等渗培养基、ES 和 VS。
   6. 使用 V2 (IS) 溶液重复步骤 2.3.4 和 2.3.5。
   7. 使用 V3 (VS) 溶液重复步骤 2.3.4 和 2.3.5。
   8. 将每个囊胚放入V3 holding液滴后，清除VTF吸头末端（液滴外部）残留的溶液和气泡，然后在囊胚周围用干净的V3完全填充吸头。推出约三分之一体积（1 µL），再将囊胚及剩余的V3完全吸入VTF吸头中。
   9. 从移液器上取下VTF吸头，用无菌纱布擦拭吸头外表面残留的V3，擦干后将吸头尖端朝前插入预先标记好的麦管开口端。 "干燥尖端" 对于防止内管可能的粘连至关重要。
   10. 将吸管倒置（标签端朝下），观察内塞或封口处的管尖，并在开口端留出1 cm的空气间隙后安全封口。建议使用自动封口装置（例如， Syms I）以消除技术差异。
       注意： 使用由离子性树脂塑料制成的吸管的优势例如， HSV 或 µS-VTF）的关键在于，使用任何操作正确的热封装置均可形成可靠的密封 "焊接" 密封，如步骤 2.1.3.1 所述。
   11. 密封后，立即将封闭的麦管直接浸入液氮中₂ 将吸管放入患者拐杖上附带的敞口杯中，置于不锈钢杜瓦瓶内储存。
       注意： 由于 µS-VTF 吸管使用 40-mm 加重内径杆以抵消充满空气的吸管所产生的浮力，因此除非涉及运输，否则无需使用倒置的安瓿瓶或空冻存管覆盖样本。
4. 加热与冷冻溶液洗脱/稀释
   1. 确认医生转诊表中的冻融胚胎移植日期、预定时间及胚胎信息（解冻/移植胚胎数量，若经PGS检测需注明特定胚胎编号）， 等等。).
   2. 配制新鲜的预热溶液（1.0 M 蔗糖储备液）和/或使用商用来源（建议启用后保存期限为1周至1个月，4 °C 保存）。
      1. 将17.1 g蔗糖分装至50 mL无菌烧瓶中，于首次开启时使用（例如， 由于蔗糖颗粒在反复暴露于常温环境时存在内毒素积聚的风险，因此应避免将其作为每周供应的来源。
      2. 将预先称重的颗粒状蔗糖加入溶液中（1.0 M 储存液 = 3.42 g/10 mL HEPES缓冲的人输卵管液 [H-HTF]），并将溶液加热至 37 °C 以提高颗粒的溶解度。反复倒置容器以加快并完成最终混合。
         注意： 建议使用正压过滤装置对粘稠溶液进行过滤（0.22 µm 滤膜）> 0.5 M 蔗糖）或大体积液体。手动压力泵已足够且价格低廉，而电动泵噪音大、会产生振动，实际上并无必要。
   3. 为每位患者准备1支10 mL的1.0 M蔗糖溶液和1支10 mL的H-HTF培养基，均预热至37 °C，用于µS-VTF复温浴。
   4. 用患者姓名和溶液编号标记6孔板的盖子表面，以制备新鲜的解冻培养皿。
      注意： 本实验中采用以下条件：（1）T1 洗涤液（200 µL，无油覆盖层）；（2）T1 溶液（100 µL）加 1 mL 油；（3）T2 溶液（100 µL）加油；（4）T3 溶液（100 µL）加油；（5）T4 溶液（100 µL）加油；（6）T5 溶液/200 µL 等渗 HEPES 缓冲液，含 10% 人血清白蛋白（HSA）或 20% 血清替代物，无油覆盖层。若无法获得 ICE 或其他商业来源，则采用通用的蔗糖溶液梯度递减方案——T1 = 1.0 M，T2 = 0.5 M，T3 = 0.25 M，T4 = 0.125 M，该方案此前已用于慢速冷冻胚胎²²此外，请注意初始的T1洗涤和最终的T5平衡可在30毫米培养皿中进行，而上述第2至第5步中涉及油覆盖的操作则使用4孔板。
   5. 每次仅解冻一位患者的胚胎。
      1. 核对医师转诊表，并在加热指定数量前确认周期即， 1 或 2 个囊胚）；通过观察渗透性变化评估存活情况/可能的存活力即， 收缩和再水化）以及完整膜，如果存疑，应在解冻另一个囊胚前联系医生和/或患者。
   6. 与同事共同确认患者/标本的身份信息即， 由第二来源证实。
   7. 将患者的拐杖放入装有液氮的杜瓦瓶中₂ 并分离鉴定出需要加热的秸秆。
   8. 将6孔稀释培养皿置于体视显微镜载物台中央。将一个60 mm培养皿放置于一侧（即， 根据技术人员的左手或右手习惯，加入预热的蔗糖溶液（1.0 M）和 H-HTF 溶液，配制 0.5 M 蔗糖 warming bath（不加盖）。
      注意： VTF吸头仅在0.5 M蔗糖溶液中进行温育，作为质量控制措施，以确保在极少数情况下胚胎因快速复温而被排出时仍能保持其活力²².
   9. 将上部吸管密封处保持在液面以上以确认其身份，然后使用梅奥剪刀夹住并固定内塞下方的吸管部分（VTF 尖端应仍浸没在 LN 中）₂).
      1. 用力轻敲剪刀数次，以敲击杜瓦瓶（Dewar flask）作为质量控制预防措施，确保去除内层吸管侧壁上的VTF尖端；若VTF尖端粘附于管壁，通过敲击可使其底部滑落至密封端（与标记端相对的一端），从而在塞子端附近形成空气间隙。
   10. 用剪刀将吸管水平提起至环境空气中（置于体视显微镜表面旁边或下方），握住未标记的一端（标签位于右侧）。在内塞或密封处剪断吸管，将其提起至预热浴皿上方。以60°角将VTF尖端倒入温热的蔗糖浴液中，直至其完全挤出并迅速升温。> 6,000 °C/min）；flexipette 的底部将置于培养皿侧壁上方。
       1. 让VTF吸头自由落入水浴中。如果吸头未立即完全伸出，可轻轻敲击上部吸管表面。若吸头仅部分伸出，可用剪刀或精细镊子夹住移液枪的杆部，辅助其完全推出。
   11. 5–10 秒后，握住移液管底部并插入一次性移液装置；移液球上的小孔在插入时可释放压力。用食指堵住移液球上的小孔，轻轻挤压移液球，在体视显微镜下观察，将玻璃化冷冻的囊胚释放至 T1 洗涤液（#1）中。确认释放后，通过正压清除残留的 V3（VS）溶液和气泡，将内容物排入中心未使用的废弃孔中。启动 5 分钟计时器。
       注意： 所有蔗糖稀释步骤均在室温（21 ± 2 ºC）下进行。
   12. 移除VTF吸头并将其置于移液器上。继续将胚胎转移至油下的T1 #2中，保持剩余时间（约3 - 4分钟）。
       1. 如果需要移植第二个囊胚，则在开始步骤 2.4.12 之前，立即从患者样本中取出第二根麦管和 VTF 吸头（重复步骤 2.4.9–2.4.11）并进行预热。将两个囊胚一同转移至 T1 溶液（1.0 M 蔗糖）中，确保至少 3 分钟的最小洗脱时间。
   13. 预先用下一溶液填充移液器，然后每隔3分钟将囊胚转移并稀释至T2、T3和T4中。如果透明带此前未经过激光消融（即， 孵化后），将其置于T4中。将培养皿放置在倒置显微镜的载物台上，通过计算机显示器观察胚胎。将透明带对准指定的红色圆圈内，启动二至三个二极管激光脉冲（从卵周隙边缘开始并向外移动），以形成开口^2,19.
   14. 将囊胚在 T5 中平衡即， 在温暖的表面（37 °C）上孵育5分钟（等渗培养基）。
   15. 根据细胞膜完整、胞质均匀透明且无固缩变暗的现象为主来评估胚胎的初始存活情况。将胚胎放入培养环境中培养2 - 6小时后再进行胚胎移植，此时应重新评估并记录胚胎的发育/存活状况。
       注意： 若移植时存在多个可移植的存活囊胚，而患者选择仅移植一个囊胚，则可对剩余囊胚重复步骤2.3.3–2.3.11进行成功再玻璃化冷冻（rVTF）。我们已有多个经单次rVTF后确认的活产案例。
       注意： 在使用亚稳定的基于甘油的溶液对非整倍体人类囊胚进行玻璃化冷冻后，rVTF已进行过最多5次实验操作，对囊胚的存活率/活力未产生显著影响。

结果

2012年至2014年6月期间，共解冻1,341枚玻璃化冷冻的囊胚，全部1,341枚胚胎均成功复苏（100%），其中1,316枚存活（98.1%）。经活检的囊胚存活率超过99.5%。在主要移植单枚、经遗传学检测确认为整倍体的冷冻保存胚胎后，我们取得了美国国内最高的着床率和活产率之一，且该结果不受年龄影响（图3）²⁰，依据美国疾病控制中心和辅助生殖技术学会近期发布的全国统计数据（表1 和 表2）。仅针对预后良好人群（年龄小于35岁）的冷冻周期进行评估时（表1），本实验室的着床率（即 胚胎建立妊娠的效率）和最终的活产率均比全国平均水平高出30%以上。此外，2014年年中对改进型储存 straw 进行初步验证/确认时，使用了70枚经研究知情同意、重新玻璃化冷冻的非整倍体囊胚，结果实现了100%的复苏率和100%的存活率。

图1。 MicroSecure VTF 设置 VTF 培养皿（A）采用3个不同的玻璃化冷冻溶液排成3排，在放入不同且编号的保存液滴前，需经过3个洗涤液滴。此外，使用带有缩短型VTF吸头的独立移液器（即， 300-µm ID Flexipettes）固定并整齐放置于泡沫塑料试管架中（B），可旋转以方便有序使用。注意，一个典型的 disposable micropipette bulb 移液装置正放置在泡沫塑料架上。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2. 改良的囊胚评分系统。 我们改良的Gardner囊胚评分系统考虑了滋养层（TE）细胞的诱导性突出，以促进囊胚活检。该改良方案对完全囊胚的早期孵化（A：3级 = 少于10%突出）和扩张囊胚（B：4级 = 最多50%突出）进行了分级，而正在孵化的囊胚（C）则表现为大于50%的突出¹⁶。 请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 妊娠结局的比较。 在累计1.5年的时间区间内，比较了妊娠数据，以评估移植经玻璃化复温的整倍体囊胚（n = 172个周期/144次移植）与未进行植入前遗传学筛查（PGS）的周期（n = 160个周期/153次移植，主要为新鲜胚胎移植）之间的差异¹⁸。就本实验目的而言，该数据明确表明，经µS-VTF程序玻璃化冷冻的活检囊胚仍保持其发育潜能。 请点击此处查看该图的放大版本。

数据来源	# 周期	平均移植胚胎数	植入率（%）	活产 比率 (%)
NB 实验室 *	144	1.2	74.00%	74.50%
全国平均水平	20,423	1.7	39.60%	44.10%
* 数据基于橙县生育中心2014年的表现进行平均计算， 南加州生育中心及南加州生殖医学中心，采用现有的 Ovation Fertility 实验室（NB 实验室）开展工作，该实验室成立于 2008年，微密封玻璃化冷冻程序。

表1. 2014年美国疾病控制与预防中心辅助生殖技术统计数据. 使用本实验室NB Lab的三家报告医生诊所中，35岁以下女性的冻融胚胎移植妊娠数据，与美国2013年450多家报告诊所的全国平均水平相比。

SART 全国平均水平
诊所 - 状态	女性	女性	女性	女性
	< 35年	35-37 岁	38-40岁	41-42岁
SCCRM-CA *	63.1%	58.3%	40.6%	32.3%
CCRM-CO *	64.7%	61.5%	40.4%	32.2%
RMA-NJ *	63.2%	59.7%	34.6%	18.7%
全国平均水平	48.6%	38.3%	24.3%	12.3%
SCCRM—南加州生殖医学中心；CCRM—科罗拉多生殖医学中心 生殖医学；以及 RMA—生殖医学协会
*  这些领先的诊所均已将玻璃化冷冻胚胎移植周期与胚胎植入前遗传学检测相结合，作为患者诊疗的标准实践，以优化每移植胚胎的活产成功率。

表2. 2014年累积活产率，由辅助生殖技术学会（SART）报告，来自加利福尼亚州纽波特比奇市Ovation生育实验室支持的SCCRM诊所的数据，与其他几家知名项目以及SART全国平均水平的对比。

讨论

如今，人们期望能够实现完全的囊胚存活率（> 95%），并获得与新鲜胚胎相似的着床成功率。一些研究团队提出，当完整冷冻保存的胚胎被移植到健康、未经激素刺激的子宫内时，玻璃化冷冻胚胎移植周期的活产率甚至可能高于新鲜囊胚。我们的数据明确表明，玻璃化冷冻技术能够有效且可靠地维持新鲜胚胎的活力。此外，我们已证实，我们所采用的无菌封闭式方法——即微密封玻璃化冷冻法（MicroSecure Vitrification, µS-VTF）——可达到与辅助生殖领域现行商业标准（i.e., 开放式装置系统）相当甚至更优的临床效果。

技术重复性和不同操作者使用多种玻璃化冷冻装置/方法之间的可靠性相关，由此导致了各项目在应用玻璃化冷冻技术时存在不一致性。因此，操作者对装置的熟悉程度成为影响实验室技术水平和成功结果的重要因素也就不足为奇。正是这种"技术特征"¹¹的概念解释了为何不同项目之间的可重复性可能存在困难。不仅十余种商业化装置的开发加剧了这一现象，还引发了质量控制方面的担忧。幸运的是，封闭式玻璃化冷冻系统（如 µS-VTF、Rapid-I 和 VitriSafe）现已被证明与开放式装置系统具有同等有效性^12,13,14。

MicroSecure VTF 是一种新型的无菌玻璃化冷冻技术，其设计注重操作简便性、可靠性和冷冻安全性。该技术结合了两种先前已获批准且符合美国食品药品监督管理局（FDA）标准的装置，构成了一种非商业化的玻璃化冷冻系统，与专用设备相比，具有成本低廉的显著优势。此外，其独特的防篡改设计和内置双色标签系统，以及多项其他质量控制优势，使 µS-VTF 成为一种具有吸引力的全球性选择¹¹。然而，作为一种非商业化的 VTF 装置，其在行业中的广泛应用仍在逐步推进中。只有通过持续发表其安全性、可靠性和临床有效性的研究成果，µS-VTF 才能获得越来越广泛的使用。

2014年8月，由于无法获得原始的0.3 mL胚胎细管（其内部带有不吸湿的疏水性塞子），我们对µS-VTF方法进行了可靠改进。简而言之，成功适配了新型0.3 mL精液/胚胎细管（带有棉质-PVP塞子）。该改进仅通过在棉塞前创建一个内密封层即可实现，从而避免了液体与开放式VTF尖端接触及毛细扩散现象。即， 含有胚胎或卵子的Flexipette）。此外，如果无法获得40毫米内径的杆，可使用两个钢珠作为配重，以平衡较轻的30毫米杆所产生的浮力问题。

这些额外的步骤使该技术略微降低了简便性，但仍然具有很高的有效性。如今，经济性和效率正变得越来越重要，因为活检后的囊胚通常需要单独玻璃化冷冻保存，直至遗传学报告确认其整倍体状态。经确认为非整倍体且无发育潜能的囊胚，通常会在患者知情同意下于数周内被废弃。因此，大多数（> 50%）的VTF装置在短期储存后即被废弃，使用商业装置时导致年度成本不断上升。总体而言，µS-VTF是一种高效、可靠且可重复的人类囊胚冷冻保存方法。其优化的质量控制设计能够安全地标记和储存胚胎/卵母细胞，避免复苏失败，并提高复苏后的存活率和发育潜能，这证明该系统可作为胚胎玻璃化冷冻的通用方案加以推广应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝制取样杆	IVM	XC055
钢珠，3/32"	VXB.com	KIT15977	不锈钢
CBS 精液/胚胎细管，0.3 mL	CryoBioSystems	25292	独立无菌包装
颜色识别棒，30 mm	CryoBioSystems	019021-26	带配重
培养管，15 mL	Falcon	352099	锥形
培养管，10 mL	Falcon	352057	snap-cap（快封盖）
冷冻护套	Nalgene	5016-001
滤器，250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μm
培养瓶，组织培养用，50 mL	Falcon	353014
Flexipettes 移液管，内径 300 μm	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	无菌，20 支/包
大号镊子	Miltex	6-30TC
碎屑镊（精细型）	Miltex	17-305
坩埚	IVM	PA003
热封仪，SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V 或 220 V（带适配器）
HEPES 缓冲液	Life Global 或	LGGH-100；100 mL，或	储存于 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	H-HTF；90126；100 mL	含非必需氨基酸
冷冻标签	GA International	CL-23T1	多种颜色可选
液氮罐，40 L	MVE 或 Taylor Warton	多种型号	液相储存
LN2；杜瓦瓶，0.5 L	Hampton Research	HR4-695	不锈钢
6 孔 Custer 培养皿	Biogenics	015/020	塑料器皿，按箱供应
移液球，Micro Cap 型	Drummond	Fisher#13681451	球顶部有孔
培养皿，35 mm	Falcon	351006
培养皿，58 mm	Nunc	150288
培养皿，100 mm	Falcon	351029
移液枪头，ART 长型	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μL
移液辅助器	Drummond 或 Falcon	多种型号	可充电
移液装置，排枪式	Cooper Surgical	MXL3-STR
移液管，血清学用，1 mL	Falcon	357521
移液管，血清学用，2 mL	Falcon	357507
移液管，血清学用，5 mL	Falcon	357543
移液管，血清学用，10 mL	Falcon	357551
手术剪，Mayo 型	Miltex	5-SC-16
体视显微镜	Nikon、Olympus、Leica	多种型号
无菌纱布垫，4" × 4"	Kendall Healthcare	6939
合成血清	Life Global，或	LGPS-20；20 mL，或	储存于 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	SS-99193；12 × 10 mL	购买低内毒素批次
蔗糖	Sigma Chemical Co.	#S9378	分装至 50 mL 培养瓶中，可保存 1 年； 每瓶加 17.1 g + 培养基至 50 mL； 配制成 1 M 溶液； 使用 0.22 µm 滤器过滤
计时器	Nalgene	5016-001
解冻液	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS（≤1.0 M 蔗糖）	T1、T2、T3、T4；开封后于 2 - 8 ºC 储存，≤1 个月
玻璃化冷冻液*，**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS（≥7.9 M [甘油/乙二醇]）	V1、V2、V3；开封后于 2 - 8 ºC 储存，≤1 个月
* 非渗透性冷冻保护添加剂可能包括：蔗糖、ficoll 和透明质酸钠
** 其他市售制剂通常为乙二醇（EG）/二甲基亚砜（DMSO；30% v/v；4.8 M），也可能为乙二醇/丙二醇（32% v/v；5.2 M）。通常使用混合溶液以降低高摩尔浓度溶液的冷冻毒性。市售产品通常包含 ES 和 VS 溶液。商业制剂的具体配方通常属于专有信息。