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方法文章

通过定制前体对胍基进行修饰与功能化

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DOI：

10.3791/54873

⸱

2017年4月27日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Technische Universität München

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

介绍了一种基于使用相应前体合成烷基修饰胍类化合物的方案。

摘要

胍基是药物化学中最重要的药效团之一。唯一含有胍基的氨基酸是精氨酸。本文提供了一种对肽类配体中胍基进行修饰的简便方法，并以RGD结合型整合素配体为例进行了说明。最近研究表明，对这些配体中胍基进行特定修饰，可实现对亚型的选择性调控例如， 亚型αv与α5之间）。此外，本文还展示了一种通过胍基进行功能化修饰的先前未知策略，并综述了该合成方法。此处描述的修饰涉及末端（Nω) 烷基化和乙酰化的胍基团。在合成过程中，首先制备定制的前体分子，随后与正交脱保护的胺发生反应，从而转移预先修饰的胍基团。对于烷基化胍的合成，采用基于 N,N′-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒用于合成酰化化合物，首选前体为相应酰化的衍生物 N-Boc-S甲基异硫脲，可通过一步或两步反应制得。

引言

天然配体中最常见的药效团之一是胍基，该基团可参与多种分子间相互作用1,2。例如，它可在氢键相互作用中作为潜在的四重氢供体，同时参与静电相互作用，如盐桥或阳离子-π相互作用。在药物化学中，该基团常见于药物及药物候选分子中4，但更多情况下以胍基模拟物的形式存在5,6。开发胍基模拟物的原因在于消除普遍存在的带正电荷的胍基，并调节配体的脂溶性。在肽类配体中，唯一含有胍基的氨基酸是精氨酸，因此精氨酸常出现在肽类配体的生物活性区域。

含有精氨酸的配体家族中一个非常典型的例子是识别RGD序列的整合素亚家族。一般来说，整合素是一类细胞黏附受体，在所有高等生物体中发挥着重要的功能，其中包括细胞黏附、迁移以及细胞存活等过程。因此，它们也参与多种病理过程，如癌症和纤维化。整合素是由α亚基和β亚基组成的跨膜异源二聚体蛋白，目前已知可形成24种不同的整合素亚型，其中8种能够识别其配体中的三肽序列Arg-Gly-Asp（即RGD）7。该结合区域位于这两个亚基在胞外区的交界处，即所谓的整合素头部结构域8。RGD序列通过两种常见的相互作用被识别：一是位于β亚基上的金属离子依赖性黏附位点（MIDAS）区域，该区域结合配体中的羧基（天冬氨酸的侧链）；二是位于α亚基上的配体中的胍基。大多数整合素亚型具有广泛的配体识别能力，并至少共享部分天然的细胞外基质（ECM）配体9。因此，在人工整合素配体的开发中，除了高结合亲和力外，主要关注点之一是亚型选择性。最近，我们发现了一个实现亚型选择性配体设计的关键结构单元：胍基。通过对胍基进行特定修饰，原本对含αv和α5亚基的整合素亚型具有双选择性的配体，可通过简单的化学修饰转变为具有选择性的化合物，从而能够区分不同的α亚基10。

在αv的口袋中，胍基团发生相互作用 侧向 通过与 Asp218 形成双齿盐桥11,12该相互作用也可在 α5β1 中观察到（此处为 α5 中的 Asp227），但此外，还存在一个 末端 在该位点观察到胍基与谷氨酰胺残基（Gln221）之间的相互作用13因此，我们以两种相反的方式对胍基进行了修饰：一种情况是通过阻断该基团 侧向 与甲基化之间的相互作用 Nδ 胍基的甲基化，另一种情况下，为胍基的甲基化 Nω，阻断 末端 相互作用。令人惊讶的是，这一微小修饰导致配体的选择性完全改变。除了烷基化修饰外，本研究还引入了一种新的功能化方法。此类五肽配体的经典功能化方法是通过与结合无关的氨基酸侧链进行偶联例如， K in c(RGDfK)14,15在此，我们证明通过使用酰基或烷基化连接臂对在结合中起关键作用的胍基进行修饰，同样可以实现功能化。结合所必需的正电荷得以保留，模型表明长链从结合口袋向外延伸，从而为连接更多的连接臂和标记单元提供了理想的可能性。例如， 荧光标记物或用于分子成像的螯合剂

本研究聚焦于含精氨酸配体中胍基修饰的制备步骤。这包括合成Nω-甲基化产物，以及带有较长连接基团的胍类化合物。不同的修饰包括酰基和烷基基团。

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方案

注意： 所有试剂和溶剂均购自商业供应商，未经进一步纯化即直接使用。

注意： 请在使用前查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。进行化学合成时，请使用所有适当的个人安全防护装备。例如， 通风橱、护目镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋。

1. 脒基化前体的合成

  1. 烷基化物种
    1. 甲基化物种
      1. 溶解 1.0 g 的 N,N′-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒（3.2 mmol，1当量）和1.0 g三苯基膦（PPh₃）3，3.8 mmol，1.2 当量）溶于 10 mL 干燥四氢呋喃（THF）中，置于 50 mL 圆底烧瓶内，在惰性气氛下使用橡胶隔膜密封，于室温（RT）反应。用注射器加入 194 µL 干燥甲醇（4.8 mmol，1.5 当量），于室温下搅拌反应。
      2. 另取一个小玻璃瓶，加入747 µL偶氮二甲酸二异丙酯（DIAD，3.8 mmol，1.2当量）和2 mL无水四氢呋喃（THF），配制成溶液。在搅拌条件下，将该DIAD的THF溶液逐滴加入到另一溶液中 N,N′-二叔丁氧羰基-1H吡唑-1-甲脒，PPh3，然后使用注射器在15分钟内加入甲醇。室温下搅拌反应液2小时。
      3. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂，将粗产物溶解于1 mL二氯甲烷（DCM）中。用100 g硅胶装填一个快速柱（2.5 cm × 20 cm），硅胶预先用含10%乙酸乙酯（EtOAc）的戊烷溶液平衡。将溶解的粗产物上样至柱中，然后在压力（1.5 bar）下加入洗脱溶剂。
      4. 收集馏分（洗脱体系：等度洗脱，戊烷中含10%乙酸乙酯），通过薄层色谱（TLC）鉴定目标化合物斑点，并收集该组分（Rf = 0.4，乙酸乙酯/戊烷 1:9，紫外检测）。合并目标馏分，使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂，得到0.85 g标题化合物，为黄色粘稠油状物（2.6 mmol，产率81%）。将所得化合物于室温下储存，以供后续使用。
    2. 己胺修饰的物种
      1. 溶解 1.0 g 的 N,N′-二-叔丁氧羰基-1H-吡唑-1-甲脒（3.2 mmol，1.0 当量），0.9 g Dde-6-氨基己醇（3.8 mmol，1.2 当量）和 1.0 g PPh3 在惰性气氛下，于50 mL圆底烧瓶中，将（3.8 mmol，1.2当量）溶于10 mL干燥THF中，使用橡胶隔膜密封，室温反应。
      2. 分别在小型玻璃小瓶中，将747 µL DIAD（3.8 mmol，1.2当量）溶于2 mL无水THF中，配制成溶液。在搅拌条件下，将THF中的DIAD溶液逐滴加入另一溶液中 N,N′-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒，PPh3，以及使用注射器在15分钟内加入Dde-6-aminohexanol。室温下搅拌反应液2小时。
      3. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂，将粗产物溶于1 mL二氯甲烷（DCM）中。准备一个装有100 g硅胶的快速柱（2.5 cm × 20 cm），用戊烷/乙酸乙酯（2:1）溶液平衡。将溶解的粗产物上样至柱中，然后在压力（1.5 bar）下加入洗脱溶剂。
      4. 收集洗脱组分（溶剂体系：等度 2:1 戊烷/EtOAc），通过薄层色谱（TLC）鉴定目标组分，并合并收集（Rf = 0.66，石油醚/乙酸乙酯（2:1），紫外检测）。合并目标馏分，使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂，得到1.6 g标题化合物，为黄色黏稠油状物（2.8 mmol，88%收率）。将所得化合物于室温下保存，以供后续使用。
  2. 酰化物种（2步反应）
    1. 溶解1.4 g的 S甲基异硫脲半硫酸盐（10 mmol，1.0 当量）和 2.2 g 的二(叔-叔丁基)二碳酸酯（10 mmol，1.0 当量）加入剧烈搅拌的二氯甲烷/水两相体系中 饱和水溶液. NaHCO₃3 在室温下搅拌24小时。
    2. 使用分液漏斗分离各层，并用二氯甲烷（DCM）对水相进行三次萃取。合并有机相，用 Na2SO4，并使用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂。将粗产物溶于1 mL正己烷中。
    3. 使用4:1的正己烷/乙酸乙酯溶液将100 g硅胶装填至一根闪蒸柱（2.5 cm × 20 cm）中。将溶解的粗产物上样至柱中。加压加入洗脱溶剂。通过薄层色谱（TLC）鉴定目标组分（溶剂体系：4:1等度正己烷/乙酸乙酯，UV 254 nm检测），并收集相应馏分（Rf = 0.30).
    4. 合并所需馏分，使用旋转蒸发仪在减压条件下蒸发溶剂，得到1.1 g标题化合物，为黄色粘稠油状物（5.8 mmol，产率58%）。将试剂储存于 N-(叔丁基-丁氧羰基-S-methylisothiourea，于室温下保存以备后续使用。
    5. 溶解250 mg的 N-(叔-叔丁氧羰基-S-甲基异硫脲（1.3 mmol，1.0 当量）溶于 10 mL 干燥 N,N二甲基甲酰胺（DMF）于50 mL圆底烧瓶中，在惰性气氛下室温反应。用注射器加入440 µL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）（2.6 mmol，2当量）。搅拌下加入245 µL乙酰基2使用注射器逐滴加入 O（5.2 mmol，4.0 当量），室温下搅拌反应 1 小时。
    6. 使用注射器向混合物中加入过量甲醇（2 mL），在室温下搅拌15分钟。使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。将粗产物溶于1 mL二氯甲烷中。
    7. 使用3:1的己烷/乙酸乙酯溶液将60 g硅胶装填至一根闪蒸柱（2.5 cm × 20 cm）中。将溶解的粗产物上样至柱内。加入洗脱溶剂（3:1 己烷/乙酸乙酯）并施加1.5 bar压力。通过TLC（3:1 己烷/乙酸乙酯，UV：220 nm）鉴定目标馏分，并收集相应馏分（Rf = 0.62).
    8. 合并所需馏分，使用旋转蒸发仪在减压条件下蒸发溶剂，得到210 mg白色固体标题化合物（0.9 mmol，70%收率）。将该化合物于室温下储存，以供后续使用。

2. 环肽前体的合成

  1. 装载并封闭 TCP 树脂
    1. 将 1.00 g 的 2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂（0.9 mmol/g）和 320 mg 的 Fmoc-Gly-OH（1.2 当量）加入带有烧结滤板的塑料 20 mL 注射器中。配制 313 µL 的 DIPEA（2 当量）溶于 5 mL 无水 DCM 的溶液，并将其加入注射器中。使用旋转装置在室温下旋转反应 1 小时。
    2. 同时，配制 2 mL 体积比为 5:1 的甲醇/DIPEA 溶液（v/v；封闭溶液）。将该封闭溶液加入注射器中，继续旋转 15 分钟。用 DCM（5 次）和 DMF（3 次）洗涤树脂。
  2. 树脂上 Fmoc 去保护
    1. 用 20% 哌啶的 DMF 溶液处理树脂结合的 Fmoc-Gly，先反应 10 分钟，再反应 5 分钟。用 DMF 洗涤树脂（3 次）。
  3. 树脂上偶联 Fmoc-Orn(Dde)-OH
    1. 将 934 mg 的 Fmoc-l-Orn(Dde)-OH（2 当量）、684 mg 的 1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三氮唑[4,5-b]吡啶鎓 3-氧化六氟磷酸盐（HATU）（2 当量）和 245 mg 的 1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）（2 当量）加入一个小玻璃小瓶中，溶于 5 mL DMF。加入 814 µL 的 DIPEA。
    2. 将此溶液加入已去除 Fmoc 保护基、洗涤后的树脂结合的 Gly 中，旋转反应 1 小时。用 DMF 洗涤树脂（3 次）。
  4. 树脂上 Fmoc 去保护
    1. 用 20% 哌啶的 DMF 溶液处理树脂结合的 Fmoc-Orn(Dde)-Gly，先反应 10 分钟，再反应 5 分钟。用 DMF 洗涤树脂（3 次）。
  5. 树脂上偶联 Fmoc-Val-OH
    1. 将 610 mg 的 Fmoc-Val-OH（2 当量）、684 mg 的 HATU（2 当量）和 245 mg 的 HOAt（2 当量）加入一个小玻璃小瓶中，溶于 5 mL DMF。加入 814 µL 的 DIPEA。
    2. 将此溶液加入已去除 Fmoc 保护基、洗涤后的树脂结合的 Orn(Dde)-Gly 中，旋转反应 1 小时。
  6. 树脂上 Fmoc 去保护
    1. 用 20% 哌啶的 DMF 溶液处理树脂结合的 Fmoc-Val-Orn(Dde)-Gly，先反应 10 分钟，再反应 5 分钟。用 DMF 洗涤树脂（3 次）。
  7. 树脂上 N- 甲基化
    1. 用 DCM 洗涤树脂（3 次）。将 887 mg 的 2-硝基苯磺酰氯（o-NBS-Cl，4 当量）溶于 DCM，并加入 1.2 mL 的 2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-collidine，10 当量）。
    2. 将该溶液加入树脂结合的肽中，在室温下孵育 20 分钟。
    3. 用 CH2Cl2（3 次）和 THF（5 次）洗涤树脂。配制含 1.18 g 的 PPh3（5 当量）和 365 µL 甲醇的 THF 溶液。将此溶液加入注射器中。
    4. 配制含 883 µL 的 DIAD 溶于 2 mL THF 的溶液，并加入注射器中。孵育 15 分钟。用 THF（5 次）和 DMF（5 次）洗涤树脂。
  8. o-Ns 去保护
    1. 配制含 570 µL 巯基乙醇（10.0 当量）和 672 µL 二氮杂双环十一碳烯（DBU）的 2 mL DMF 溶液。将此溶液加入注射器中，孵育 5 分钟。
    2. 重复一次去保护步骤，然后用 DMF 洗涤树脂（5 次）。
  9. 树脂上偶联 Fmoc-D-Phe-OH
    1. 将 697 mg 的 Fmoc-D-Phe-OH（2 当量）、684 mg 的 HATU（2 当量）和 245 mg 的 HOAt（2 当量）加入一个小玻璃小瓶中，溶于 5 mL DMF。加入 814 µL 的 DIPEA。
    2. 将此溶液加入已去除 Fmoc 保护基、洗涤后的树脂结合的肽中，旋转反应 1 小时。
  10. 树脂上 Fmoc 去保护
    1. 用 20% 哌啶的 DMF 溶液处理树脂结合的肽，先反应 10 分钟，再反应 5 分钟。用 DMF 洗涤树脂（3 次）。
  11. 树脂上偶联 Fmoc-Asp(OtBu)-OH
    1. 将 741 mg 的 Fmoc-Asp(OtBu)-OH（2 当量）、684 mg 的 HATU（2 当量）和 245 mg 的 HOAt（2 当量）加入一个小玻璃小瓶中，溶于 5 mL DMF。加入 814 µL 的 DIPEA。
    2. 将此溶液加入已去除 Fmoc 保护基、洗涤后的树脂结合的肽中，旋转反应 1 小时。
  12. 线性肽从树脂上裂解
    1. 用 DCM 洗涤树脂（3 次），然后配制 10 mL 体积比为 1:4 的六氟异丙醇（HFIP）与 DCM 混合溶液（v/v）。
    2. 将该溶液加入树脂中，旋转反应 15 分钟。将溶液收集至圆底烧瓶中。重复一次裂解操作，并使用旋转蒸发仪除去溶剂。
  13. 线性肽的环化
    1. 将 384 mg 的 NaHCO3（5.0 当量）和 582 µL 的二苯基磷酰叠氮化物（DPPA）（3.0 当量）溶于 50 mL DMF 中，并加入粗产物中。搅拌过夜，或直至 ESI-MS 检测不到线性肽（约 10 小时）17。
    2. 在减压条件下，使用旋转蒸发仪将溶剂浓缩至小体积。配制饱和氯化钠水溶液（盐水）。使用巴斯德移液管将环化肽逐滴加入装有 40 mL 饱和氯化钠水溶液的离心管中。
    3. 离心悬浮液（5,000 × g，5 分钟），并用 HPLC 级水洗涤沉淀（2 次）。冷冻干燥产物。

3. 溶液中的胍基化与脱保护

  1. 使用定制前体进行胍基化
    1. 将少量（例如，25 mg）正交去保护的环肽溶解于少量 DMF（例如，2 mL）中。向该溶液中加入 2 当量的胍基化前体和 2 当量的 DIPEA，室温下搅拌反应 2 小时。
    2. 通过 HPLC-MS 监测反应进程。反应完成后，除去溶剂，将胍基化的环肽重新溶解于乙腈中，并进行半制备型 HPLC 纯化16。
  2. 去除酸敏感侧链保护基
    1. 配制 2 mL 含三氟乙酸（TFA）、水和三异丙基硅烷（TIPS）的溶液（95/2.5/2.5；v/v/v）。将该溶液加入盛有纯化产物的小玻璃小瓶中，室温下搅拌至少 1 小时。通过 ESI-MS 观察去保护反应是否完全17。
    2. 减压条件下将溶剂蒸发至小体积。准备冰冻乙醚，在 50 mL 离心管中加入 10 mL。使用巴斯德移液管逐滴加入反应液，使去保护的肽在冰冻乙醚中沉淀。离心悬浮液（5,000 × g，5 分钟），收集沉淀。
    3. 用冰冻乙醚洗涤沉淀物，并离心（5,000 × g，5 分钟，重复两次）。将产物溶解于 2 mL HPLC 级水中，并通过半制备型 HPLC 进行纯化16。

4. 纯化过程的分析数据与参数

  1. 分析型高效液相色谱-电喷雾电离质谱
    1. 使用 LCQ 质谱仪，采用 C18 色谱柱（12 nm 孔径，3 µm 粒径，125 mm × 2.1 mm）或 C8 色谱柱（20 nm 孔径，5 µm 粒径，250 mm × 2.1 mm），进行分析型 HPLC-ESI-MS，以 H2O（0.1% v/v 甲酸）/乙腈（0.1% v/v 甲酸）作为流动相。
  2. 半制备型高效液相色谱
    1. 使用制备型HPLC仪器，配备ODS-A柱（20 x 250 mm，5 µm），流速为8 mL/min，采用H的线性梯度进行半制备型HPLC2O（0.1% v/v TFA）和乙腈（0.1% v/v TFA）

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结果

环肽前体首先被合成为线性肽，随后进行环化，并正交脱除Dde保护基。沉淀后，采用HPLC-MS分析化合物的纯度（图1）。为监测反应进程，在反应进行2小时后进行了HPLC分析（图2）。

对于胍基上较大的取代基，2小时的反应时间通常不足。此时，需继续反应并用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行监测。反应完成并经过最终脱保护后，采用半制备型高效液相色谱（HPLC）设备对化合物进行纯化（产率通常在低毫克级别）。最终化合物通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析以评估纯度（参见 图3).

取少量样品溶于微量离心管中，用DMSO稀释，得到母液，用于ELISA类似固相结合实验中对该化合物的生物学评价。结果如图4

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讨论

鸟氨酸胍基化反应的前体是一种正交去保护的环状肽衍生物（c(OrnD(OtBu)Gf(NMe)V)），该化合物通过标准Fmoc固相肽合成（SPPS）方法制备。其中使用了正交保护的鸟氨酸衍生物（Fmoc-Orn(Dde)-OH），在肽骨架环化完成后，可在DMF中用肼进行去保护。肽前体通过化合物沉淀及随后的冷冻干燥进行纯化。

胍基化反应的烷基化前体可通过一步反应以良好产率获得，该反应以市售的N,N′-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒为起始原料，在Mitsunobu条件（PPh3、DIAD、THF）下进行烷基化反应即可实现19,10。通过该反应，可由相应的醇类化合物获得多种多样的前体。使用烷基化前体进行胍基化反应可得到结构明确的产物，且反应过程干净。若反应2小时后未观察到反应物完全转化，应继续反应。根据本实验方案所述条件，仅生成少量副产物；然而，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

T.G.K. 感谢慕尼黑工业大学国际科学与工程研究生院（IGGSE）提供的经济资助。H.K. 感谢慕尼黑综合蛋白质科学中心（CIPSM）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N,N′-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒，98% 西格玛-奥德里奇434167 ALDRICH
三苯基膦，99%西格玛-奥德里奇T84409 SIGMA-ALDRICH
四氢呋喃，>99.5%卡尔·罗思4745
无水四氢呋喃，99.8%卡尔·罗思5182
无水甲醇，99.8%西格玛-奥德里奇322415 SIGMA-ALDRICH
偶氮二甲酸二异丙酯，98%西格玛-奥德里奇225541 ALDRICH
二氯甲烷，用于合成，99.5%卡尔·罗思8424
用于快速色谱的硅胶西格玛-奥德里奇60738 SIGMA-ALDRICH
正戊烷，99%卡尔·罗思8720
正己烷，99%卡尔·罗思CP47
乙酸乙酯，99.5%卡尔·罗思7338
氨基己醇，95%西格玛-奥德里奇A56353 ALDRICH
S-甲基异硫脲半硫酸盐，98%西格玛-奥德里奇M84445 ALDRICH
二-叔-丁基二碳酸酯，99%西格玛-奥德里奇205249 ALDRICH
N,N-二甲基甲酰胺，99.8%卡尔·罗思A529
N,N-二异丙基乙胺，99.5%卡尔·罗思2474
乙酸酐，99%卡尔·罗思4483
氯三苯甲基树脂CarbolutionCC11006
Fmoc-Gly-OH，98%CarbolutionCC05014
哌啶，99%西格玛-奥德里奇104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OHIris-BiotechFAA1502
HATU，99%CarbolutionCC01011
HOAt，99%CarbolutionCC01004
Fmoc-Val-OHCarbolutionCC05028
2-硝基苯磺酰氯，97%西格玛-奥德里奇N11507 ALDRICH
2,4,6-三甲基吡啶，99%西格玛-奥德里奇27690 SIGMA-ALDRICH
巯基乙醇，99% 西格玛-奥德里奇M6250 ALDRICH
二氮杂双环十一烯，98%西格玛-奥德里奇139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH，98%西格玛-奥德里奇47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH，98%CarbolutionCC05008
六氟异丙醇CarbolutionCC03056
二苯基磷酰基叠氮化物，97%西格玛-奥德里奇178756 ALDRICH
三氟乙酸，99.9%卡尔·罗思P088
三异丙基硅烷，98%西格玛-奥德里奇233781 ALDRICH
乙腈，HPLC级卡尔·罗思HN44

参考文献

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