生物素填充并处理的脑组织切片中神经化学标记物的免疫染色

摘要

本方案介绍了一种通过生物胞素填充及后续免疫组织化学处理，对电生理记录过程中进行膜片钳的神经元进行形态学重建的方法。我们展示，经过染色并加盖盖玻片的较厚生物胞素填充脑片，可在数天后使用第二种一抗重新染色 或数月后。

摘要

利用膜片钳技术对细胞进行电生理记录，已能够根据放电模式鉴定不同类型的神经元。在记录电极中加入生物胞素（biocytin）或神经生物素（neurobiotin），可在记录后回收细胞形态学细节，这对于确定被记录神经元的树突分支结构及其轴突投射区域至关重要。然而，由于存在形态相似但神经化学特性与功能不同的神经元，因此必须通过针对细胞类型特异性蛋白的免疫组织化学染色，才能对神经元进行确切鉴定。为了维持神经网络的连接性，用于生理记录的脑切片通常制备成300 µm或更厚。但这种厚度常因抗体难以穿透组织而影响免疫组织化学的后续处理，因而需要对组织重新切片。切片的再切片是一项技术难度较高的操作，常常导致已获得电生理数据的细胞组织和形态丢失，从而使数据无法使用。由于形态学的回收可减少数据丢失，并指导神经元标志物的选择，我们采用了一种先进行形态学回收、再进行二次免疫染色的策略。本文介绍了一种在生理记录过程中进行生物胞素填充，并随后进行连续免疫染色以回收形态学特征的实用方法，之后对切片重新染色以确定其神经化学特性。我们报告指出，已填充生物胞素、经多聚甲醛（PFA）固定、染色并封片的切片，可在数天后去除盖玻片并用第二种一抗重新染色。该重新染色过程包括去除盖玻片、将切片在缓冲液中清洗，以及孵育一抗和二抗以显示其神经化学特性。该方法的优势在于可避免因无法回收形态而导致的数据丢失，并可根据形态特征缩小需检测的神经化学标志物范围。

引言

大脑以其神经元个体在结构和功能特征上的多样性而著称。要理解不同类型神经元在脑功能和病理过程中的作用，必须对神经元进行表征并明确识别。从结构上看，由胞体-树突位置决定的形态学特征决定了特定神经元可能接收的输入信号，而轴突分支模式则揭示了其潜在的突触后靶标。自拉蒙·卡哈尔（Ramón y Cajal）开创性的组织学研究以来，人们便已认识到神经元在结构上的多样性¹。单细胞记录技术的出现表明，结构上不同的神经元在放电模式和突触特性方面也存在差异。在GABA能抑制性神经元中，结构与生理的多样性尤为显著^2,3。此外，越来越多的研究表明，结构相似的神经元可能表达不同的神经化学标记物，并表现出相应的功能差异⁴。同样，具有相同神经化学标记物的神经元也可能具有不同的结构和功能^5-10。因此，在实际研究中，分析神经元的功能特性及其在神经网络中的作用，需要同时确定其形态学特征和神经化学身份。即使已有针对特定神经化学标记物的报告基因小鼠品系，通常仍需通过免疫组织化学方法来确定神经元的形态及其亚型身份¹¹。

用于表征急性脑切片中记录细胞的标准方法是在记录过程中用生物胞素（biocytin）或神经生物素（neurobiotin）填充细胞，记录结束后用多聚甲醛（PFA）固定切片，再通过免疫组织化学方法揭示细胞的形态学特征和神经化学性质。由于用于脑片电生理实验的切片厚度通常为 300 µm 或更厚，且....

方案

1. 电生理记录期间的生物胞素填充

注意：读者可参考其他资料了解基本的膜片钳记录技术及仪器设备^19-22，本文不再详述。此处所述步骤基于膜片钳记录的设备与操作流程已建立的前提，仅聚焦于与生物胞素填充及事后免疫染色相关的具体细节。本论文所述所有实验均在大鼠上进行。

1. 使用振动切片机，制备所需脑区的活体脑片，厚度为 300 - 350 µm²³。
2. 通过将 2 mg 生物素（biocytin）加入 1 mL 内液中，配制含 0.2% 生物素的内液⁶。为获得最佳效果，将内液超声处理 10 - 15 分钟，直至生物素完全溶解。随后，将内液装入配有 0.2 µm 孔径聚丙烯滤头并连接微加样器的 1 mL 注射器中。将此加样注射器置于冰袋上，以维持内液中 Mg-ATP 和 Na-GTP 的稳定性。
   注意：含有葡萄糖酸钾的内液（126 mM K-葡萄糖酸盐、4 mM KCl、10 mM HEPES、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP 和 10 mM 磷酸肌酸）在免疫标记过程中有利于某些神经化学标志物（包括小清蛋白）的保留。根据我们的经验，使用基于铯离子和氯离子的内液会降低某些神经化学标志物免疫染色的回收能力。神经生物素（Neurobiotin）或一种细胞不可渗透、可固定的极性示踪剂（将 Alexa Fluorophore 与生物素结合）可作为生物素的替代物。<....

结果

成功完成后，切片仍保留生物胞素标记以及第2步中进行的免疫标记，可使用共聚焦显微镜或落射荧光显微镜进行成像。此外，经过处理的切片还将显示在第3步后续处理过程中标记的抗原的免疫染色结果。在图2所示切片中，通过红色显示的链霉亲和素标记和绿色显示的第一种一抗（CB₁R）揭示了厚切片（300 µm）中生物胞素标记神经元的形态。首次免疫染色在PFA固定后7天内完成。该切片被封片于水性封片剂中，使用共聚焦显微镜成像，并在首次染色后储存两个月，随后再进行CCK抗体的复染。注意，所记录神经元的形态（包括轴突分支（图2E））是根据首次染色后获得的共聚焦图像重建的。轴突与CB₁R免疫反应性的共定位（图2 F - H）与已知的生理学研究结果一致。第二次CCK染色在首次染色程序完成两个月后进行。CCK以远红通道成像，并伪染为青色以便观察。类似地，图3展示了一个细胞的示例，其中生物胞素标记在厚切片中被成功显示并成像（

讨论

方案中的关键步骤

用生物胞素（biocytin）填充已打孔的细胞是确保细胞形态完整恢复的最关键步骤。为了实现细胞的完整恢复，必须选择最佳的脑片切向，以尽量减少切片过程中对细胞突起的切断。该切向可能因所研究的神经环路和细胞类型而异。其次，必须给予足够时间，使生物胞素充分扩散至树突和轴突。某些染料（如神经生物胞素，neurobiotin）还可通过缝隙连接进入与记录细胞相耦合的其他神经元。此外，还需优化玻璃微电极尖端的尺寸：若开口过大，容易将胞体拉出；若电极尖端过小，则会影响生物胞素的加载效率。在退出全细胞记录模式时，采取适当的操作步骤对于保留胞体结构也至关重要。记录结束后，将脑片在4%多聚甲醛（PFA）中孵育24小时，随后转入磷酸盐缓冲液（PBS）中，有助于减少组织的过度交联，这对后续免疫组织化学染色尤为关键。将脑片在4 °C下保存对于维持其结构完整性也十分重要。然而，长时间在PFA中保存会降低抗体标记实验的最终成功率。优化一抗孵育的浓度和时间非常重要，因为不同抗体所需条件各异，某些抗体在厚组织中可能需要3–5 d 的孵育时间才能实现最佳渗透.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma	S7653	免疫染色
KCl	Fluka	60129	免疫染色
Na2HPO4	Sigma	S7907	免疫染色
KH2PO4	Sigma	229806	免疫染色
Triton X-100	Sigma	T8787	免疫染色
豚鼠抗 CB1	Sigma	Af530-1	免疫染色
小鼠抗 CCK	CURE, UCLA	由 G. Ohning 提供	免疫染色
兔抗 Parvalbumin	Swant	PV27	免疫染色
链霉亲和素，Alexa Fluor 偶联物	Molecular Probes	S11227	免疫染色
正常山羊血清（NGS）	Sigma	G9023	免疫染色
Vectashield	Vector Labs	H-1000	免疫染色
二抗	Invitogen Molecular probes	Alexa Fluor 偶联染料	免疫染色
Labnet orbit 低速摇床	Bioexpress	S-2030-LS	免疫染色
镊子	Dumont	11231-30	免疫染色
载玻片盒	EMS	71520	免疫染色
振动切片机 VT 1200 S	Leica	14048142066	电生理学
Multiclamp 700B 放大器	Molecular devices	Multiclamp 700B	电生理学
pCLAMP 10 软件	Molecular devices	pCLAMP 10	电生理学
数模转换器	Molecular Devices	Digidata 1440 数模转换器	电生理学
滤芯吸头	Nalgene	171-0020	电生理学
超声破碎仪	Fisher Scientific	15-335-100	电生理学
微量加样器	Eppendorf	930001007	电生理学
生物胞素	Sigma	B4261	电生理学