本方案介绍了一种通过生物胞素填充及后续免疫组织化学处理，对电生理记录过程中进行膜片钳的神经元进行形态学重建的方法。我们展示，经过染色并加盖盖玻片的较厚生物胞素填充脑片，可在数天后使用第二种一抗重新染色 或数月后。
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摘要
摘要
利用膜片钳技术对细胞进行电生理记录，已能够根据放电模式鉴定不同类型的神经元。在记录电极中加入生物胞素（biocytin）或神经生物素（neurobiotin），可在记录后回收细胞形态学细节，这对于确定被记录神经元的树突分支结构及其轴突投射区域至关重要。然而，由于存在形态相似但神经化学特性与功能不同的神经元，因此必须通过针对细胞类型特异性蛋白的免疫组织化学染色，才能对神经元进行确切鉴定。为了维持神经网络的连接性，用于生理记录的脑切片通常制备成300 µm或更厚。但这种厚度常因抗体难以穿透组织而影响免疫组织化学的后续处理，因而需要对组织重新切片。切片的再切片是一项技术难度较高的操作，常常导致已获得电生理数据的细胞组织和形态丢失，从而使数据无法使用。由于形态学的回收可减少数据丢失，并指导神经元标志物的选择，我们采用了一种先进行形态学回收、再进行二次免疫染色的策略。本文介绍了一种在生理记录过程中进行生物胞素填充，并随后进行连续免疫染色以回收形态学特征的实用方法，之后对切片重新染色以确定其神经化学特性。我们报告指出，已填充生物胞素、经多聚甲醛（PFA）固定、染色并封片的切片，可在数天后去除盖玻片并用第二种一抗重新染色。该重新染色过程包括去除盖玻片、将切片在缓冲液中清洗，以及孵育一抗和二抗以显示其神经化学特性。该方法的优势在于可避免因无法回收形态而导致的数据丢失，并可根据形态特征缩小需检测的神经化学标志物范围。
引言
大脑以其神经元个体在结构和功能特征上的多样性而著称。要理解不同类型神经元在脑功能和病理过程中的作用，必须对神经元进行表征并明确识别。从结构上看，由胞体-树突位置决定的形态学特征决定了特定神经元可能接收的输入信号，而轴突分支模式则揭示了其潜在的突触后靶标。自拉蒙·卡哈尔（Ramón y Cajal）开创性的组织学研究以来，人们便已认识到神经元在结构上的多样性1。单细胞记录技术的出现表明，结构上不同的神经元在放电模式和突触特性方面也存在差异。在GABA能抑制性神经元中，结构与生理的多样性尤为显著2,3。此外，越来越多的研究表明，结构相似的神经元可能表达不同的神经化学标记物，并表现出相应的功能差异4。同样，具有相同神经化学标记物的神经元也可能具有不同的结构和功能5-10。因此，在实际研究中，分析神经元的功能特性及其在神经网络中的作用，需要同时确定其形态学特征和神经化学身份。即使已有针对特定神经化学标记物的报告基因小鼠品系，通常仍需通过免疫组织化学方法来确定神经元的形态及其亚型身份11。
用于表征急性脑切片中记录细胞的标准方法是在记录过程中用生物胞素（biocytin）或神经生物素（neurobiotin）填充细胞，记录结束后用多聚甲醛（PFA）固定切片，再通过免疫组织化学方法揭示细胞的形态学特征和神经化学性质。由于用于脑片电生理实验的切片厚度通常为 300 µm 或更厚，且大多数抗体无法完全穿透至如此深度，因此需要将切片重新切成 60 µm 或更薄，以实现生物胞素与神经化学标记物的同步免疫染色12-14。然而，重新切片过程费时费力，存在切片过程中组织丢失的风险，并可能导致组织收缩不均，从而增加形态学重建的复杂性。此外，若能预先了解细胞形态，将有助于缩小可能表达的神经化学标记物的候选范围。我们对标准的生物胞素免疫组织化学流程进行了改进，使切片可依次进行序列化处理：首先用于恢复细胞形态，随后用于鉴定潜在的神经化学标记物。
免疫组织化学是研究抗原在组织或细胞中分布的方法，可通过酶、荧光标记物、放射性元素或胶体金颗粒进行可视化15。该技术流程包括使用一抗特异性标记并放大一种或多种特定抗原，随后使用靶向一抗的荧光二抗进行检测和显像。由于需要区分每种二抗的荧光光谱以避免重叠，因此可同时检测的抗原数量有限。因此，预先了解组织形态学特征有助于选择用于细胞分类的候选神经化学标志物。从概念上讲，对已染色切片进行连续处理的理论依据在于：针对某一蛋白质或多肽的免疫标记不应影响其抗原性，也不会干扰后续对结构上独立的多肽进行的免疫标记16。这种无干扰现象源于抗体仅结合抗原上的特定蛋白表位，因而允许多种抗原在同一组织中同时染色。免疫染色所能揭示的抗原数量受限于荧光二抗之间光谱不重叠的要求，以及必须使用来自不同物种的抗体分别靶向各个抗原，以消除交叉反应性17,18。尽管这是采用连续标记而非两种可能相互作用的抗体同时标记的理论基础，但据我们所知，目前尚未见报道在载片切片上完成一种或多种抗原的免疫标记后，再进行第二种抗原的免疫染色。本文中，我们描述了一种对先前已染色并封片的切片进行连续免疫染色的方法。虽然我们详细阐述的是在厚切片中先恢复形态结构，再进行蛋白质/多肽标志物染色的连续免疫标记流程，但相同方法亦适用于标准的薄组织切片。此外，我们还介绍了一种实用的方法，即在电生理记录过程中将神经元用生物胞素填充，并在记录完成后将电极从细胞中撤出，以优化神经元轴突和树突分支的填充效果，相关内容已在我们近期的研究中报道6,8。
此处所述方法最关键的优点在于，可在尝试对切片进行重切或免疫染色之前，完整回收并成像所记录细胞的形态。尽管某些抗体渗透性问题可能仍需对切片进行重切以完成二次免疫染色，但本文详述的流程可避免从多个切片中重建复杂神经元的需要，同时规避因组织丢失和差异性收缩所导致的重建困难，而这些问题在重切后常会影响重建结果。另一优势在于，该方法可通过仅对含有生物胞素标记神经元的切片进行免疫染色和重切，从而减少成本、时间、人力以及昂贵抗体的消耗。最具实用性的方面是，可对数月前已染色的切片利用上述技术追加进行额外的免疫染色。特别是，细胞形态的成功回收将显著降低因无法获得细胞类型基本形态学特征而被迫弃用其生理学数据的可能性。
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方案
1. 电生理记录期间的生物胞素填充
注意：读者可参考其他资料了解基本的膜片钳记录技术及仪器设备19-22，本文不再详述。此处所述步骤基于膜片钳记录的设备与操作流程已建立的前提，仅聚焦于与生物胞素填充及事后免疫染色相关的具体细节。本论文所述所有实验均在大鼠上进行。
- 使用振动切片机，制备所需脑区的活体脑片，厚度为 300 - 350 µm23。
- 通过将 2 mg 生物素（biocytin）加入 1 mL 内液中，配制含 0.2% 生物素的内液6。为获得最佳效果，将内液超声处理 10 - 15 分钟，直至生物素完全溶解。随后，将内液装入配有 0.2 µm 孔径聚丙烯滤头并连接微加样器的 1 mL 注射器中。将此加样注射器置于冰袋上，以维持内液中 Mg-ATP 和 Na-GTP 的稳定性。
注意：含有葡萄糖酸钾的内液（126 mM K-葡萄糖酸盐、4 mM KCl、10 mM HEPES、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP 和 10 mM 磷酸肌酸）在免疫标记过程中有利于某些神经化学标志物（包括小清蛋白）的保留。根据我们的经验，使用基于铯离子和氯离子的内液会降低某些神经化学标志物免疫染色的回收能力。神经生物素（Neurobiotin）或一种细胞不可渗透、可固定的极性示踪剂（将 Alexa Fluorophore 与生物素结合）可作为生物素的替代物。 - 在红外差分干涉对比（IR-DIC）下观察待记录的合适细胞。为尽量减少对轴突的损伤，应使用大多数显微操作器配备的“接近”（approach）功能，沿细胞体轴向垂直下移记录电极。在红外差分干涉对比下，采用膜片钳电生理方案建立全细胞记录19-22。
注意：避免从假定轴突的方向接近细胞，以免切断轴突，切断处可见肿胀的轴突末端（图 1 中绿色箭头所示）。同时，在接近细胞时避免对记录电极施加过高的正压，以减少生物素的泄漏，否则会导致背景染色增强。
图1. 进行生物胞素填充时推荐的细胞接近平面。 该图像展示了一个记录过程中经生物胞素填充的颗粒细胞（GC），并通过处理显示生物胞素（使用594偶联的链霉亲和素呈红色）。该颗粒细胞的树突朝向位于XY平面。注意由于移液管在XY平面移动，导致颗粒细胞轴突被切断（绿色箭头所示）。请注意，沿XZ平面接近该神经元是较为理想的方式。比例尺：50 µm。
- 在电压钳制模式下，使用电生理数据采集与分析软件中的“膜测试”功能，在浴液模式下施加小幅度（5 mV）、短暂（30 ms）的电压阶跃，测定全细胞电容和串联电阻。这将确保建立全细胞记录条件，以便进行生物胞素（biocytin）填充。
- 根据需要，在电流钳或电压钳模式下进行生理记录。在 34 °C 下记录时间至少 >10 分钟为宜。
注：在室温下进行的实验可能需要更长的记录时间。 - 完成生理记录后，通过在电压钳模式下缓慢地、分步移动记录电极，交替沿 Z 轴向上和 X 轴向外移动，重新建立膜片钳配置。
- 同时使用“膜测试”功能监测电容和输入电阻，观察电容性瞬变信号的消失以及电流响应变为一条直线，表明细胞已重新封闭，并在电极尖端形成外向-out 膜片。将细胞保持在去极化电位（-40 mV）有助于促进重新封闭过程。
注：此移除细胞的操作通常可确保胞体和树突的完整回收。在此过程中或从电极上分离细胞时，切勿对记录电极施加正压。若在脑片中观察到记录细胞的胞体，表明成功脱离。若脱离的电极尖端残留细胞碎片或膜片，通常提示胞体发生移位，将无法获得完整的细胞形态。 - 在电极与细胞分离后，将脑片保留在记录室中 3 - 5 分钟，以确保染料运输至远端树突和轴突结构。
- 将脑片转移至含有 4% PFA 的 24 孔板中进行固定。
警告：PFA 具有致癌性，操作时必须佩戴适当个人防护装备，包括手套和口罩，以避免皮肤刺激和吸入风险。PFA 易燃，应远离火源。PFA 不得排入下水道，必须作为化学废物收集处理。PFA 固定操作必须与活体脑片制备区域隔离，以防污染生理实验装置，包括转移移液管。 - PFA 固定后 24 - 48 小时，将脑片转移至含 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）的容器中储存，以备免疫染色使用。
注：理想情况下，生物胞素回收与免疫染色应在固定后尽快进行；但在固定后 7 天内染色仍可获得良好结果。若需延迟染色，脑片可在含 0.02 - 0.05% 叠氮化钠的 PBS 中保存，最长可超过 90 天。尽管大多数抗体适用于 PFA 过夜固定，但部分抗体在缩短固定时间后效果更佳。PFA 固定超过 48 小时会降低抗原可及性，从而影响神经化学标志物的二次免疫染色成功率。
警告：叠氮化钠具有极高毒性，接触皮肤、眼睛或经摄入、吸入后可引起严重刺激；严重暴露可致死亡。该化合物的致癌性和致突变性尚不明确。操作时必须佩戴适当个人防护装备，包括手套、防溅护目镜、实验服和防尘呼吸器。叠氮化钠不得排入下水道，必须作为化学废物收集处理。
2. 第一主抗体和生物胞素染色
（第1天）
注意：以下免疫染色程序适用于游离漂浮切片，所有孵育步骤均需在摇床上以低速持续震荡（2转/分钟，rpm）进行。
- 用0.1 M PBS（pH = 7.4）洗涤组织，每次10分钟，共洗3次。
注意：0.1 M PBS 可购买商用产品，或按以下方法在实验室配制（配制1 L）：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4，以及 0.24 g KH2PO4 在 1 L 的 dH₂O 中20.
注意：如果已知目标神经化学标记物，可将蛋白/肽的染色与生物胞素染色同时进行（步骤 2.2 - 2.4）。若仅进行生物胞素染色，请直接进入步骤 2.5。 - 可选：用 10% 封闭血清（BS；将正常山羊血清 NGS 用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 稀释）在室温下封闭 1 小时。
注意：每个孔所加入的溶液体积应保持一致；推荐体积为 250 - 500 µL/well. 封闭血清的选择取决于二抗所来源的物种（例如， NGS用于标记偶联染料的山羊抗-（相应一抗物种）抗体。如果需要使用不同物种来源的二抗对切片进行免疫染色，则在封闭步骤（2）中加入每种正常血清的10%，在一抗和二抗孵育步骤中加入每种正常血清的3%。 - （可选）将切片在 CB 一抗中孵育1R（多克隆，豚鼠）与0.3% Triton X-100和3% BSA溶于0.1 M PBS中，室温下孵育过夜。CB1R 用于鉴定 1 型大麻素受体的表达。
注意：此步骤为可选，无需执行即可显示生物胞素填充情况。 图 2 显示标记了生物胞素和CB的切片区域1R 在第一次染色过程中。大多数一抗在室温下孵育过夜（O/N）即可；然而，某些一抗（包括 CB1R，需要孵育3 - 5天。如果孵育时间超过1天，建议在 4 °C 因为Triton X-100可使切片通透化，且在室温长时间孵育过程中可能导致组织解体。每次实验系列中至少应包含一个不加一抗的阴性对照，以验证二抗的特异性。阴性对照中省去一抗，但仍加入含0.3% Triton X-100的0.1 M PBS和BS。
图2. 成功实现CCK染色，该染色在Biocytin染色及C恢复后1周完成大麻素受体1型（CB1R)-标记。 (A - C60倍镜下共聚焦图像显示生物胞素标记的神经元（A）和 CB1R 免疫反应性（B），由箭头指示。同一组织切片在1周后进行CCK免疫染色处理（C）。图像的叠加显示在 D. 采用远红荧光显示CCK免疫反应性，并伪染为青色。E) A中生物胞素标记细胞的形态学重建。注意生物胞素与CB1即使在第二次CCK免疫染色后，R染色仍清晰可见。同时请注意CB的预期分布1R 和 CCK 免疫染色模式。 (F - H细胞轴突的放大图像，如图所示 A，显示生物胞素与CB的紧密共定位1轴突中的 R（箭头所示）。比例尺： 50 µm (A - D), 100 µm (E），以及 10 µm (F - H）。图像由 Yu 重制 等 20159. 请点击此处以查看此图的放大版本。
（第2天）
- 用 0.1 M PBS（pH = 7.4）清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。
- 将切片在含有 0.3% Triton X-100 和 3% BS 的 0.1 M PBS 中，于 4 °C 避光过夜（用铝箔包裹）孵育，加入链霉亲和素红色荧光染料偶联物（浓度：1:1,000；激发波长：594 nm，发射光位于可见红光光谱范围），以显示生物胞素标记。可选：若在第 2.3 步中进行了可选的一抗孵育，则可在上述孵育液中同时加入二抗——山羊抗豚鼠抗体（浓度：1:500；激发波长：488 nm，发射光为绿色）。
注意：仅当执行了可选的一抗染色步骤（第 2.3 步）时，才需要使用二抗。为可视化生物胞素，建议使用发射光谱位于红色区域的链霉亲和素-荧光素偶联物，因其有助于更清晰地观察细小轴突并提供更好的对比度（图 1 - 3）。在进行双重或三重免疫荧光染色时，为避免二抗之间的交叉反应，应依次逐个添加二抗（每次添加间隔 2 小时即可）。图 3A 展示了一个未进行可选一抗染色的生物胞素标记细胞，在重切前成像的结果。
图 3. 在恢复生物胞素形态并重新切片后成功进行第二次免疫染色。 (A1) 300 µm 切片的共聚焦图像，显示生物胞素填充细胞的树突形态得以恢复。(A2) 神经元在 +500 和 -100 pA 电流注入下的膜电位记录。(B) 将 300 µm 切片（见 A1）封片并成像后重新切片，获得 50 µm 切片中生物胞素填充的胞体得以恢复。(B2) 对薄切片进行后续免疫染色，结果显示生物胞素填充的胞体（右图）与 CCK（中图）共定位。右图显示合并图像。比例尺：50 µm。图 A2 经 Yu et al. 许可转载，即将出版25。 请点击此处查看该图的放大版本。
（第3天）
- 用 0.1 M PBS（pH = 7.4）清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。
- 为保护荧光信号并便于将来重新染色，将切片封片于水性封片剂中，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。
注意：建议尽早重新染色，以避免因封片剂从载玻片泄漏导致难以去除指甲油、霉菌污染以及组织脱水等问题。可在 PBS 中加入 0.02% 叠氮化钠以防止微生物污染。
注意：叠氮化钠在接触水时具有高毒性且易燃。请参照危险化学品的标准操作程序进行操作与处置。
（第 4–7 天） - 使用 594 nm 和 488 nm 激发波长，以 20X 或 40X 放大倍数进行共聚焦成像，以显示被生物胞素标记的红色神经元和神经化学标志物（CB1R）的绿色信号。评估共标结果（图 2）。
- 将相机曝光时间设置为小于 100 ms，以避免光漂白，并获取整个神经元轴突和树突树突的共聚焦图像序列。利用共聚焦图像序列和神经元追踪软件包重建神经元形态。
3. 第二种一抗的染色
注意：虽然第二次免疫染色步骤可以在第一次染色后 90 天进行，但如果在第一次染色后的 7 至 10 天内完成第二次一抗染色，则可获得最佳染色效果。
（7 - 90 天后）
- 将丙酮涂于棉签上，擦去载玻片上的指甲油。
- 使用尖头镊子小心移除盖玻片，并在切片上滴加数滴 0.1 M PBS。
- 用细毛笔小心将切片从载玻片上取下，在 0.1 M PBS 中于 4 oC、低光照条件下、用铝箔包裹的摇床上清洗 24–48 小时。
注意：必须用铝箔覆盖切片，以避免荧光淬灭。 - 为确保完全去除封片剂，次日将切片在 0.1 M PBS 中清洗 1–2 次，每次 10 分钟。
- 随后将切片与第二种一抗（例如，胆囊收缩素，一种存在于某些 GABA 能中间神经元中的神经肽（CCK；浓度：1:1,000；小鼠单克隆抗体））在 4 °C 下孵育 1 天（图 2）。
注意：此步骤与步骤 2.3 相似，但使用不同的抗体。此外，在重复染色过程中省略封闭步骤。 - 将脑切片在 0.1 M PBS（pH = 7.4）中清洗三次，每次 10 分钟。
- 使用荧光素标记的二抗山羊抗小鼠抗体（浓度：1:500；激发波长：647 nm）进行染色，确保该二抗的激发-发射光谱不与链霉亲和素（浓度：1:1,000；激发波长：594 nm）及先前的免疫荧光染料发生重叠。
- 将切片置于水性封片剂中封片，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。
注意：将切片置于不透光的储存盒中，于 4 °C 保存，以保护荧光信号。
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结果
成功完成后，切片将保留生物胞素标记以及第2步中进行的免疫标记，可使用共聚焦显微镜或落射荧光显微镜进行成像。此外，经过处理的切片还将显示在第3步后续处理过程中标记的抗原的免疫染色结果。在图2所示切片中，通过红色显示的链霉亲和素和绿色显示的第一种一抗（CB1R），揭示了厚切片（300 µm）中生物胞素填充神经元的形态。首次免疫染色在PFA固定后7天内完成。该脑片使用水性封片剂封片，通过共聚焦显微镜成像，并在首次染色后储存两个月，再进行CCK抗体的二次染色。请注意，记录神经元的形态结构（包括轴突分支，图2E）是根据首次染色后获得的共聚焦图像重建的。轴突与CB1R免疫反应性的共定位（图2 F - H）与已有的生理学研究结果一致。CCK的第二次染色在首次染色程序两个月后进行。CCK以远红荧光成像，在图像中伪染为青色以便观察。类似地，图3展示了一个细胞示例，其中生物胞素标记在厚切片中被成功显示并成像（
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讨论
方案中的关键步骤
用生物胞素（biocytin）填充已打孔的细胞是确保细胞形态完整恢复的最关键步骤。为了实现细胞的完整恢复，必须选择最佳的脑片切向，以尽量减少切片过程中对细胞突起的切断。该切向可能因所研究的神经环路和细胞类型而异。其次，必须给予足够时间，使生物胞素充分扩散至树突和轴突。某些染料（如神经生物胞素，neurobiotin）还可通过缝隙连接进入与记录细胞相耦合的其他神经元。此外，还需优化玻璃微电极尖端的尺寸：若开口过大，容易将胞体拉出；若电极尖端过小，则会影响生物胞素的加载效率。在退出全细胞记录模式时，采取适当的操作步骤对于保留胞体结构也至关重要。记录结束后，将脑片在4%多聚甲醛（PFA）中孵育24小时，随后转入磷酸盐缓冲液（PBS）中，有助于减少组织的过度交联，这对后续免疫组织化学染色尤为关键。将脑片在4 °C下保存对于维持其结构完整性也十分重要。然而，长时间在PFA中保存会降低抗体标记实验的最终成功率。优化一抗孵育的浓度和时间非常重要，因为不同抗体所需条件各异，某些抗体在厚组织中可能需要3–5 d 的孵育时间才能实现最佳渗透...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）R01 NS069861 项目以及新泽西州脑损伤研究计划（NJCBIR）CBIR14IRG024 项目对 VS 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | 免疫染色 |
| KCl | Fluka | 60129 | 免疫染色 |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | 免疫染色 |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | 免疫染色 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 免疫染色 |
| 豚鼠抗 CB1 | Sigma | Af530-1 | 免疫染色 |
| 小鼠抗 CCK | CURE, UCLA | 由 G. Ohning 提供 | 免疫染色 |
| 兔抗 Parvalbumin | Swant | PV27 | 免疫染色 |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 偶联物 | Molecular Probes | S11227 | 免疫染色 |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma | G9023 | 免疫染色 |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | 免疫染色 |
| 二抗 | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor 偶联染料 | 免疫染色 |
| Labnet orbit 低速摇床 | Bioexpress | S-2030-LS | 免疫染色 |
| 镊子 | Dumont | 11231-30 | 免疫染色 |
| 载玻片盒 | EMS | 71520 | 免疫染色 |
| 振动切片机 VT 1200 S | Leica | 14048142066 | 电生理学 |
| Multiclamp 700B 放大器 | Molecular devices | Multiclamp 700B | 电生理学 |
| pCLAMP 10 软件 | Molecular devices | pCLAMP 10 | 电生理学 |
| 数模转换器 | Molecular Devices | Digidata 1440 数模转换器 | 电生理学 |
| 滤芯吸头 | Nalgene | 171-0020 | 电生理学 |
| 超声破碎仪 | Fisher Scientific | 15-335-100 | 电生理学 |
| 微量加样器 | Eppendorf | 930001007 | 电生理学 |
| 生物胞素 | Sigma | B4261 | 电生理学 |
参考文献
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