通过动态光散射显微技术测量浑浊溶液中的颗粒尺寸分布

摘要

介绍了一种利用动态光散射显微镜直接测量浓溶液中粒径分布的实验方案。

摘要

本文描述了一种利用动态光散射技术测量浓聚合物溶液多分散性的实验方案。动态光散射是一种用于测定聚合物溶液或胶体粒子尺寸分布的技术。尽管该技术广泛应用于聚合物溶液的表征，但由于多重散射效应或强烈的光吸收，测量浓溶液中的粒子尺寸仍存在困难。因此，浓溶液在测量前通常需要稀释。在动态光散射显微镜中引入共焦光学组件¹有助于克服这一限制。利用此类显微系统，无需稀释即可在相同的实验条件下分析透明和浑浊体系。作为代表性示例，本文进行了温敏性聚合物溶液的尺寸分布测量。在低于低临界溶解温度（LCST）时，聚合物链在水溶液中的尺寸为几十纳米；而当温度高于LCST时，其尺寸增大至超过1.0 µm。该结果与观察到的溶液在LCST以上变浑浊的现象一致。

引言

粒径是胶体和聚合物溶液最基本的性质之一。目前有多种技术可用于测量粒径。粒径在1.0 µm或更大的颗粒可通过光学显微镜直接测量。对于更小的颗粒，则需采用其他技术，例如激光衍射、电子显微镜或原子力显微镜^2,3。动态光散射是一种常用于测定溶液中粒径分布的技术⁴。该技术所得结果并非来自颗粒的图像，而是基于散射光强度波动的特征时间。这些波动源于布朗运动，而布朗运动可通过扩散系数进行表征。粒径分布则通过爱因斯坦-斯托克斯方程，由扩散系数分布推导得出。由于操作简便，动态光散射被广泛应用于各类溶液的常规检测，如涂料和食品胶体。

大多数用于溶液样品粒径测量的技术都需要进行预处理。以电子显微镜和原子力显微镜为例，样品必须在真空条件下进行分析，因此难以观察样品的原始状态。此外，激光衍射和动态光散射技术仅能测量经过稀释、无多重散射和光吸收干扰的样品。为克服这一难题，已提出多种新技术用于直接测量未稀释浓溶液的动态光散射，例如互相关光谱法^5,6、低相干动态光散射^7,8、扩散波谱法^9,10和微分动态显微术^11,12。

我们开发了一种名为动态光散射显微镜的新装置¹。该装置采用共焦光学系统，利用针孔消除多重散射，从而实现对浑浊样品无需稀释的测量。然而，其测量步骤和数据分析比 commercially-available 仪器略为复杂。本视频以温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)的分析为例，详细讲解了该装置的测量流程与数据处理方法。

方案

1. 样品制备

1. 温敏性单体的纯化
   1. 将 20 g N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）溶解于 100 mL 甲苯中。
   2. 在减压下过滤溶液，以去除灰尘。
   3. 将滤液与 500 mL 石油醚混合。
   4. 将反应容器置于冰水浴中。
   5. 搅拌溶液直至单体析出（通常为 30 分钟）。
   6. 在减压下过滤溶液，收集析出的单体。
   7. 在减压（100 Pa）条件下干燥单体过夜。
2. 温敏性聚合物溶液的制备
   1. 使用隔膜泵对 20 mL 去离子水脱气 1.0 分钟。
   2. 将 780.8 mg 纯化后的 NIPA 溶解于 9.5 mL 脱气并去离子的水中。
   3. 将反应容器置于冰水浴中。
   4. 用铝箔包裹装置以避光。
   5. 在搅拌的同时，通过连接至气瓶的管路将氩气经移液枪头缓慢通入溶液，保持适度气流，持续 10 分钟。
   6. 使用微量移液器向溶液中加入 11.9 µL N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
   7. 继续搅拌溶液 1.0 分钟，同时如步骤 1.2.5 所述持续通入氩气。
   8. 在持续搅拌样品的同时，将 4.0 mg 过硫酸铵溶解于 0.5 mL 脱气并去离子的水中。
   9. 将样品溶液（来自步骤 1.2.7）与过硫酸铵溶液（来自步骤 1.2.8）混合。
   10. 继续搅拌溶液 30 秒，同时如步骤 1.2.5 所述通入氩气。
   11. 用铝箔覆盖溶液，并置于冰箱（4 °C）中过夜。
3. 样品载片的制备
   1. 取 60 µL 样品溶液（来自步骤 1.2.11）置于凹面载玻片的凹槽中。
   2. 用圆形盖玻片覆盖溶液，注意避免产生气泡。
   3. 使用微量移液器和实验室擦拭纸去除多余溶液。
   4. 用胶水密封样品，室温下静置使其干燥（通常为 6 小时）。
   5. 按照步骤 1.3.1–1.3.4 制备另一张载片，其中加入含 0.1 wt% 聚苯乙烯乳胶颗粒（粒径 100 nm）的悬浮液。该载片用作标准样品。

2. 使用动态光散射显微镜测量颗粒尺寸

1. 仪器优化
   1. 将步骤 1.3.5 中制备的聚苯乙烯乳胶悬浮液载玻片放置在倒置显微镜的载物台上，盖玻片一侧应朝下。
   2. 在检测器（雪崩光电二极管和自相关器）前方放置一个光束阻尼器。
   3. 通过物镜（10×）将激光束（固体激光器，λ = 488 nm，30 mW，连续波）照射到样品上。部分反射光经显微镜的导光镜进入安装在显微镜侧端口的 CCD 相机进行观察（图 1）。
   4. 通过从低到高调节物镜的高度，将焦点设定在样品悬浮液位置。在此过程中，反射图像会依次在三个界面聚焦：盖玻片表面、盖玻片与样品之间的界面、以及样品与孔板载玻片之间的界面。将焦点设置在第二和第三个聚焦点之间。
   5. 通过调节激光功率来衰减散射光强度。
   6. 移除检测器前方的光束阻尼器，使散射光进入检测器。该单元用于测量光强度的时间相关性。
   7. 在显微镜与检测器之间设置一个针孔（ϕ = 50 µm），以实现共焦效应。调节针孔位置，使检测器处的光强度最大化。
   8. 通过计算机启动相关器，测量散射光强度的时间相关函数，持续 30 秒。测得的相关函数通常表示为 g⁽²⁾ (t) - 1，其中 t 为相关时间⁴，。此处，I(t) 表示时间 t 时的散射光强度，(•••)_T 表示时间平均。衰减时间约为 0.1 ms。
   9. 调节焦点位置，以获得较宽范围的时间相关函数初始振幅（g⁽²⁾ (t = 0) - 1）。
      注：初始振幅受反射光量影响显著。将焦点向盖玻片与样品之间的界面移动时，反射光量增加。对于聚苯乙烯乳胶等强光散射颗粒，初始振幅可在 0 至 1 之间调节。然而，对于更常见的聚合物溶液，由于反射光强度远高于散射光强度，难以将初始振幅设置接近 1。
   10. 对获得的时间相关函数应用逆拉普拉斯变换（使用约束正则化程序 CONTIN^13,14），以获取粒径分布函数。当初始振幅设置小于 0.2 时，流体力学半径的分布函数将在约 100 nm 处出现尖锐峰，为实际半径的两倍（详见讨论部分）。
2. 样品测量
   1. 将载物台温度设定为 25 °C。
   2. 将步骤 1.3.4 制备的聚-N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）溶液载玻片放置在显微镜载物台上。
   3. 按照步骤 2.1.4–2.1.8 测量散射光强度的时间相关函数。若初始振幅大于 0.2，则按照步骤 2.1.9 调节焦点位置，使时间相关函数的初始振幅小于 0.2。较小的初始振幅可简化数据分析。
   4. 将载物台温度升至 35 °C，并等待溶液变浑浊。PNIPA 溶液的低临界溶解温度（LCST）为 32 °C¹⁵。
   5. 按照步骤 2.1.4–2.1.8 测量时间相关函数。如可行，调节焦点位置，使时间相关函数的初始振幅小于 0.2。对于浑浊溶液，由于散射光强度增加而反射光强度保持不变，其初始振幅往往增大。
   6. 对获得的时间相关函数应用逆拉普拉斯变换，得到粒径分布函数。需注意，当初始振幅小于 0.2 时，实际粒径为所得值的一半。

结果

对聚苯乙烯乳胶悬浮液（粒子半径：50 nm）在不同焦平面处测得的散射光强度时间关联函数如图2(a)所示。这些关联函数通过逆拉普拉斯变换转换为流体力学半径的分布函数（参见图2(b)和(c)）。采用相同方法，分别在25 °C和35 °C下获得了PNIPA溶液的散射光强度时间关联函数及其流体力学半径分布函数。图3(a)和(b)分别展示了LCST以下（25 °C）和以上（35 °C）PNIPA溶液的散射光强度时间关联函数及其对应的粒径分布函数。粒径分布函数通过逆拉普拉斯变换并结合部分外差效应校正获得。LCST以下的平均流体力学半径为几十纳米，这在聚合物溶液中具有典型性。相比之下，LCST以上的流体力学半径约为1.0 µm。该结果与LCST以上溶液变浑浊的现象一致。图3中的红线和蓝线分别代表溶液刚变浑浊后立即测得以及浑浊后20分钟测得的PNIPA溶液粒径分布。图3(b)清晰地表明了聚集体的生长过程。

图1. 动态光散射显微镜的示意图。 小孔（PH）、分束器（BS）、偏振片（Pol）和雪崩光电二极管（APD）。请点击此处查看此图的放大版本。

图2. 聚苯乙烯乳胶悬浮液的代表性结果。（a）聚苯乙烯乳胶悬浮液散射光强度的时间相关函数。标称半径为 50 nm，浓度为 0.1 wt%。两条数据来自不同的散射点。（b）、（c）通过对（a）进行逆拉普拉斯变换得到的相应粒径分布函数。红线对应初始振幅约为 1.0 的时间相关函数，蓝线对应初始振幅约为 0.2 的时间相关函数。横坐标分别在未考虑（b）和考虑（c）部分外差效应（PHD）（当 A << 1 时）的情况下计算得出。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. PNIPA溶液的代表性结果。 （a）PNIPA溶液的散射光强度时间相关函数。（b）通过(a)的逆拉普拉斯变换得到的PNIPA溶液相应的粒径分布函数。横坐标计算时考虑了每组数据的部分外差效应。黑色线条代表在25 °C下获得的数据；红色线条代表溶液刚变浑浊时（35 °C）获得的数据；蓝色线条代表红色线条数据测量20分钟后获得的数据。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

时间关联函数的初始振幅强烈依赖于焦点位置，如图2(a)所示。这似乎与溶液是均匀的这一事实相矛盾（界面处的薄层除外）⁸。初始振幅的这种变化归因于反射光量的变化。部分外差理论¹⁶预测，初始振幅A、散射光强度I_s和反射光强度I_r满足以下方程¹

该方程表明，I_r 越大，A 越小。因此，通过将焦点位置设置在靠近界面处，可以减小 A。在单分散溶液的情况下，可通过拟合时间相关函数获得表观扩散系数 D_A：

其中 。在此处， n 是溶剂（水，1.33）的折射率， θ 为散射角（180°），以及 λ 是光的波长（514.5 nm）。由于我们采用了背向散射几何结构，该值的 q 是固定的。然而，这一问题可通过使用不同波长的光来解决。请注意，任何类型的连续波激光光源均可用于构建动态光散射显微镜。由于照射体积较小，相干因子¹⁷ 估计值大于 0.99，可忽略不计。对于多分散溶液，其分布函数为 D_A 通过逆拉普拉斯变换获得。部分外差理论还预测了 D_A 与实际的扩散常数不同 D这两个扩散常数满足以下方程：

扩散常数 D 通过爱因斯坦-斯托克斯方程⁴ 转换为流体动力学半径 R_h。当 A = 1 时，该关系变为 D_A = D。在此情况下，数据转换过程与常规动态光散射相同。如图 2(b) 中的红线所示，即为此情况。相反，当 A → 0 的极限条件下，该关系变为 D_A = 0.5D。因此，当 A 较小时（实际中，小于 0.2），所估算的粒径约为实际粒径的两倍，如图 2(b) 中的蓝线所示。如果我们已知 A 显著偏小，则可对横坐标进行平移校正，如图 2(c) 所示。原则上，对于任意 A 值，均可将 D_A 转换为 D。然而在实际操作中，最好将初始振幅设置为小于 0.2，因为此时简单的近似关系 D_A ∼ 0.5D 成立。

利用聚-N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）溶液展示了动态光散射显微技术的显著特征。PNIPA在低临界溶解温度（LCST）以下和以上的构象已通过小角中子散射进行了广泛研究^15,18相比之下，由于聚异丙基丙烯酰胺在低临界溶解温度以上时产生浊度，动态光散射尚未被用于其分析¹⁹。这一问题可通过动态光散射显微镜解决，如图所示 图3(a) 和 (b)这些聚集体的尺寸为数个 µm，这是小角X射线/中子散射或常规光散射技术无法获得的。利用该系统进行时间分辨测量，可获得温度变化过程中聚集过程的信息。

动态光散射显微镜的缺点也在图3中得到说明。在LCST以下的结果中，时间相关函数受到溶液中极少量灰尘的显著影响（图3中的黑线）。例如，即使相关时间达到约1.0 s，时间相关函数仍未完全衰减。这是因为该装置照射的体积（约1.0 µm）明显小于常规动态光散射装置的照射体积（约100 µm）。在散射光强度较弱的情况下，信号会被噪声掩盖，例如溶液中微量灰尘所引起的噪声。因此，图3(b)中显示的三个峰可能不具有定量意义，尽管其总体粒径顺序仍具参考价值。需要注意的是，此类弱散射体可通过常规动态光散射装置进行测量。

我们已证明，动态光散射显微镜能够在同一实验装置下测量透明和浑浊样品。由于样品中的光路长度较短，该技术可应用于强光吸收样品，例如碳纳米管悬浮液²⁰。此外，由于其具有高空间分辨率，该技术还可用于生物细胞的检测。在生物学应用方面，该方法还可与其他成像技术（如荧光成像和拉曼成像）相结合。因此，我们认为动态光散射显微镜是适用于广泛研究领域的有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N异丙基丙烯酰胺，98%	东京化成工业株式会社	I0401
甲苯，99%	和光纯药工业株式会社	201-01876
石油醚，蒸馏温度 30 ~ 60 °C	和光纯药工业株式会社	169-22565
N,N,N',N'四甲基乙二胺，99%	Sigma	T9281
过硫酸铵，98%	Sigma	248614
聚苯乙烯乳胶悬浮液，1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
氩气	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		纯度 > 99.999 体积%
腔室载玻片	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
倒置显微镜	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
温控板	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
固体激光器	相干	OBIS 488LX
雪崩光电二极管	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. 雪崩光电二极管
相关器	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP