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通过动态光散射显微技术测量浑浊溶液中的颗粒尺寸分布

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DOI：

10.3791/54885

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2017年1月9日

 , 
1Department of Chemistry, School of Science, University of Tokyo, 2Institute for Solid State Physics, University of Tokyo

本文内容

摘要

介绍了一种利用动态光散射显微镜直接测量浓溶液中粒径分布的实验方案。

摘要

本文描述了一种利用动态光散射技术测量浓聚合物溶液多分散性的实验方案。动态光散射是一种用于测定聚合物溶液或胶体粒子尺寸分布的技术。尽管该技术广泛应用于聚合物溶液的表征，但由于多重散射效应或强烈的光吸收，测量浓溶液中的粒子尺寸仍存在困难。因此，浓溶液在测量前通常需要稀释。在动态光散射显微镜中引入共焦光学组件1有助于克服这一限制。利用此类显微系统，无需稀释即可在相同的实验条件下分析透明和浑浊体系。作为代表性示例，本文进行了温敏性聚合物溶液的尺寸分布测量。在低于低临界溶解温度（LCST）时，聚合物链在水溶液中的尺寸为几十纳米；而当温度高于LCST时，其尺寸增大至超过1.0 µm。该结果与观察到的溶液在LCST以上变浑浊的现象一致。

引言

粒径是胶体和聚合物溶液最基本的性质之一。目前有多种技术可用于测量粒径。粒径在1.0 µm或更大的颗粒可通过光学显微镜直接测量。对于更小的颗粒，则需采用其他技术，例如激光衍射、电子显微镜或原子力显微镜2,3。动态光散射是一种常用于测定溶液中粒径分布的技术4。该技术所得结果并非来自颗粒的图像，而是基于散射光强度波动的特征时间。这些波动源于布朗运动，而布朗运动可通过扩散系数进行表征。粒径分布则通过爱因斯坦-斯托克斯方程，由扩散系数分布推导得出。由于操作简便，动态光散射被广泛应用于各类溶液的常规检测，如涂料和食品胶体。

大多数用于溶液样品粒径测量的技术都需要进行预处理。以电子显微镜和原子力显微镜为例，样品必须在真空条件下进行分析，因此难以观察样品的原始状态。此外，激光衍射和动态光散射技术仅能测量经过稀释、无多重散射和光吸收干扰的样品。为克服这一难题，已提出多种新技术用于直接测量未稀释浓溶液的动态光散射，例如互相关光谱法5,6、低相干动态光散射7,8、扩散波谱法9,10和微分动态显微术11,12。

我们开发了一种名为动态光散射显微镜的新装置1。该装置采用共焦光学系统，利用针孔消除多重散射，从而实现对浑浊样品无需稀释的测量。然而，其测量步骤和数据分析比 commercially-available 仪器略为复杂。本视频以温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)的分析为例，详细讲解了该装置的测量流程与数据处理方法。

方案

1. 样品制备

  1. 温敏性单体的纯化
    1. 将 20 g N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）溶解于 100 mL 甲苯中。
    2. 在减压条件下过滤溶液，以去除灰尘。
    3. 将滤液与 500 mL 石油醚混合。
    4. 将反应容器置于冰水浴中。
    5. 搅拌溶液直至单体析出（通常为 30 分钟）。
    6. 在减压条件下过滤溶液，收集析出的单体。
    7. 在减压（100 Pa）条件下干燥单体过夜。
  2. 温敏性聚合物溶液的制备
    1. 使用隔膜泵对 20 mL 去离子水脱气 1.0 分钟。
    2. 将 780.8 mg 纯化后的 NIPA 溶解于 9.5 mL 已脱气的去离子水中。
    3. 将反应容器置于冰水浴中。
    4. 用铝箔包裹装置，避免反应暴露于光线下。
    5. 轻轻搅拌溶液 10 分钟，同时通过连接气体钢瓶的管路将氩气经移液枪头以适中流速通入溶液中。
    6. 使用微量移液器向溶液中加入 11.9 µL N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
    7. 继续通入氩气（如步骤 1.2.5 所述），同时搅拌溶液 1.0 分钟。
    8. 在持续搅拌样品的同时，将 4.0 mg 过硫酸铵溶解于 0.5 mL 已脱气的去离子水中。
    9. 将样品溶液（来自步骤 1.2.7）与过硫酸铵溶液（来自步骤 1.2.8）混合。
    10. 继续通入氩气（如步骤 1.2.5 所述），同时搅拌溶液 30 秒。
    11. 用铝箔覆盖溶液，并在冰箱（4 °C）中静置过夜。
  3. 样品载片的制备
    1. 取 60 µL 样品溶液（来自步骤 1.2.11）加入凹面载玻片的凹槽中。
    2. 用圆形盖玻片覆盖溶液，注意避免产生气泡。
    3. 使用微量移液器和实验室擦拭纸去除多余的溶液。
    4. 用胶水密封样品，室温下静置使胶水干燥（通常为 6 小时）。
    5. 按照步骤 1.3.1–1.3.4 制备另一张载片，其中加入 0.1 wt% 聚苯乙烯乳胶悬浮液（粒径 100 nm），该载片作为标准样品使用。

2. 使用动态光散射显微镜测量颗粒尺寸

  1. 仪器优化
    1. 将聚苯乙烯乳胶悬浮液载玻片（来自步骤 1.3.5）放置在倒置显微镜的载物台上，盖玻片一侧应朝下。
    2. 在探测器（雪崩光电二极管和自相关器）前方放置一个光束阻尼器。
    3. 通过物镜（10×）将激光束（固体激光器，λ = 488 nm，30 mW，连续波）照射到样品上。部分反射光经显微镜的导光镜射出，并由安装在显微镜侧端口的CCD相机观察图1).
    4. 调节物镜高度，通过将物镜从低到高移动，使焦点位于样品悬液处。在此过程中，反射图像需三次聚焦：分别在盖玻片表面、盖玻片与样品之间的界面，以及样品与打孔载玻片之间的界面。将焦点设定在第二与第三聚焦点之间。
    5. 通过调节激光功率来减弱散射光强度。
    6. 通过移除探测器前方的光束阻尼器，将散射光引入探测器。该装置用于测量光强度的时间相关性。
    7. 设置针孔（ϕ = 50 µm) 在显微镜与检测器之间以实现共聚焦效果。调节针孔的位置，使检测器处的光强度达到最大。
    8. 通过计算机启动相关器操作，测量散射光强度的时间关联函数，持续30秒。测得的关联函数通常表示为 g(2) (t) - 1，其中 t 是相关时间4 和 光子关联，方程，\(g^{(2)}(t) = \langle I(0)I(t) \rangle/\langle I(t) \rangle^2\)，光学。这里， I(t) 是时间处的散射光强度 t 以及（•••）T 是时间平均。衰减时间约为0.1 ms。
    9. 调整焦点位置，以获得时间关联函数初始振幅的较宽范围g(2) (t = 0) - 1).
      注意：初始振幅受反射光量的影响较大。通过将焦点移向盖玻片与样品之间的界面，反射光量会增加。对于聚苯乙烯乳胶等强光散射体，初始振幅可从0调节至1。然而，对于更常见的聚合物溶液，由于反射光强度远高于散射光强度，难以将初始振幅设置到接近1的水平。
    10. 应用逆拉普拉斯变换（使用约束正则化程序 CONTIN）13,14) 拟合所获得的时间相关函数，以得到尺寸分布函数。当初始振幅设置为小于0.2时，流体动力学半径的分布函数将在约100 nm处出现一个尖锐的峰，该值是实际半径的两倍（详见讨论部分）。
  2. 样品测量
    1. 将舞台温度设置为 25 °C.
    2. 将用聚-N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）溶液制备的载玻片（步骤1.3.4）放置在显微镜载物台上。
    3. 通过执行步骤 2.1.4–2.1.8 测量散射光强度的时间关联函数。如果初始振幅大于 0.2，则按照步骤 2.1.9 调整焦点，使时间关联函数的初始振幅小于 0.2。较小的初始振幅有助于简化分析。
    4. 将舞台温度设置为 35 °C 并等待溶液变浑浊。PNIPA 溶液的低临界溶解温度（LCST）是 32 °C15.
    5. 按照步骤2.1.4至2.1.8测量时间相关函数。若条件允许，调整焦点的位置，使时间相关函数的初始振幅小于0.2。对于浑浊溶液，其初始振幅往往增大，这是因为散射光强度增加而反射光强度保持不变。
    6. 对获得的时间关联函数应用逆拉普拉斯变换，以得到粒径分布函数。注意，当初始振幅小于0.2时，实际粒径为所得值的一半。

结果

对聚苯乙烯乳胶悬浮液（颗粒半径：50 nm）在不同焦平面处测得的散射光强度时间关联函数如图2(a)所示。这些关联函数通过逆拉普拉斯变换转换为流体动力学半径的分布函数（参见图2(b)和(c)）。采用相同方法，分别在25 °C和35 °C下获得了PNIPA溶液的散射光强度时间关联函数及其流体动力学半径分布函数。图3(a)和(b)分别展示了LCST以下（25 °C）和以上（35 °C）PNIPA溶液的散射光强度时间关联函数及其对应的粒径分布函数。粒径分布函数通过逆拉普拉斯变换并结合部分外差效应校正获得。LCST以下的平均流体动力学半径为几十纳米，这是聚合物溶液的典型特征；而LCST以上的流体动力学半径约为1.0 µm。该结果与LCST以上溶液变浑浊的现象一致。图3中的红线和蓝线分别代表溶液刚变浑浊后立即测得以及浑浊后20分钟测得的PNIPA溶液粒径分布。图3(b)清晰地表明了聚集体的生长过程。

超快光谱实验装置示意图：激光器、光纤、分束器；用于瞬态吸收实验。
图1. 动态光散射显微镜的示意图。 小孔（PH）、分束器（BS）、偏振片（Pol）和雪崩光电二极管（APD）。请点击此处查看该图的放大版本。

动态光散射图谱；相关时间数据、粒径分布分析、光谱拟合。
图2. 聚苯乙烯乳胶悬浮液的代表性结果。（a）聚苯乙烯乳胶悬浮液的散射光强度时间相关函数。标称半径为50 nm，浓度为0.1 wt%。两个数据集来自不同的散射点。（b）、（c）通过将（a）进行逆拉普拉斯变换得到的聚苯乙烯乳胶悬浮液相应的粒径分布函数。红线对应初始振幅约为1.0的时间相关函数，蓝线对应初始振幅约为0.2的时间相关函数。横坐标在未考虑（b）和考虑（c）部分外差效应（PHD）（当 A << 1 时）的情况下分别计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。

动态光散射（DLS）图谱；不同温度下的相关函数和粒径分布。
图3. PNIPA溶液的代表性结果。（a）PNIPA溶液的散射光强度时间相关函数。（b）通过（a）的逆拉普拉斯变换得到的PNIPA溶液相应的粒径分布函数。横轴计算时考虑了每组数据的部分外差效应。黑色线条代表在25 °C下获得的数据；红色线条代表溶液刚变浑浊时（35 °C）获得的数据；蓝色线条代表红色线条数据测量20分钟后获得的数据。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

时间相关函数的初始振幅在很大程度上取决于焦点位置，如图2(a)所示。这似乎与溶液是均匀的（界面处的薄层除外）这一事实相矛盾8。初始振幅的这种变化归因于反射光量的变化。部分外差理论16预测，初始振幅A、散射光强度Is和反射光强度Ir满足以下方程1

吸光度方程示意图，A=1-(Ir/(Is+Ir))^2，光学测量分析。

该方程表明，Ir 越大，A 越小。因此，通过将焦点位置设置在靠近界面处，可以减小 A。在单分散溶液的情况下，可通过拟合时间相关函数获得表观扩散系数 DA：

动态光散射分析的关联函数方程，g(2)(t)-1=Ae^-2DAq²t。

其中 散射矢量方程 q=4πnsin(θ/2)/λ，用于散射理论分析。。此处，n 为溶剂（水，1.33）的折射率，θ 为散射角（180°），而 λ 为光的波长（514.5 nm）。由于我们采用了背向散射几何构型，q 的值是固定的。然而，该问题可通过使用不同波长的光来解决。请注意，任何类型的连续波激光光源均可用于构建动态光散射（DLS）显微镜。由于照射体积很小，相干因子17 估计大于 0.99，可忽略不计。对于多分散体系溶液，DA 的分布函数可通过逆拉普拉斯变换获得。部分外差理论还预测，DA 并不等于实际的扩散系数 D。这两个扩散系数满足以下方程：

光子扩散方程，公式：D<sub>A</sub> = (1 - √1-A)/A × D；光学分析方法。

扩散常数 D 利用爱因斯坦-斯托克斯方程4 转换为流体动力学半径 Rh。当 A = 1 时，该关系变为 DA = D。在此情况下，数据转换过程与常规动态光散射相同。如图 2(b)中红线所示即为此情况。相反，当 A → 0 的极限条件下，该关系变为 DA = 0.5D。因此，当 A 较小（实际小于 0.2）时，所估算的粒径约为实际尺寸的两倍，如图 2(b)中的蓝线所示。如果我们已知 A 显著偏小，则可对横轴进行平移校正，如图 2(c)所示。原则上，对于任意 A 值，均可将 DA 转换为 D。然而在实际操作中，最好将初始振幅设置为小于 0.2，因为此时简单的近似关系 DA ∼ 0.5D 成立。

利用聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）溶液展示了动态光散射显微技术的显著特征。PNIPA在低临界溶解温度（LCST）以下和以上的构象已通过小角中子散射进行了广泛研究15,18相比之下，由于聚异丙基丙烯酰胺（PNIPA）在低临界溶解温度（LCST）以上时出现浑浊，动态光散射尚未被用于其分析19。这一问题可通过动态光散射显微镜解决，如图所示 图3(a) 和 (b)这些聚集体的尺寸为数个 µm，这是小角X射线/中子散射或常规光散射技术均无法获得的信息。利用该系统进行时间分辨测量，可获取温度变化过程中聚集过程的相关信息。

动态光散射显微镜的缺点也在图3中得到说明。在LCST以下的结果中，时间相关函数受到溶液中极微量灰尘的显著影响（图3中的黑色线条）。例如，即使相关时间达到约1.0 s，时间相关函数仍未完全衰减。这是因为该装置照射的体积（约1.0 µm）明显小于常规动态光散射装置的照射体积（约100 µm）。在散射光强度较弱的情况下，信号会被噪声掩盖，例如溶液中微量灰尘所引起的噪声。因此，图3(b)中显示的三个峰可能不具备定量意义，尽管其总体粒径顺序仍具有参考价值。需要注意的是，此类弱散射样品仍可通过常规动态光散射装置进行测量。

我们已证明，动态光散射显微镜能够在相同实验装置下测量透明和浑浊样品。由于样品中的光路长度较短，该技术可应用于强光吸收性样品，例如碳纳米管悬浮液20。此外，由于其具有高空间分辨率，该技术也可用于生物细胞的研究。在生物学应用方面，该方法还可与其他成像技术（如荧光成像和拉曼成像）相结合。因此，我们认为动态光散射显微镜是适用于广泛研究领域的有力工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了日本文部科学省科学研究费补助金（编号：25248027，授予 M.S.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N异丙基丙烯酰胺，98%东京化成工业株式会社I0401
甲苯，99%和光纯药工业株式会社201-01876
石油醚，蒸馏温度 30 ~ 60 °C和光纯药工业株式会社169-22565
N,N,N',N'四甲基乙二胺，99%SigmaT9281
过硫酸铵，98%Sigma248614
聚苯乙烯乳胶悬浮液，1 wt%Duke Scientific Corporation3500A
氩气Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.纯度 > 99.999 体积%
腔室载玻片Matsunami Glass Ind.,Ltd.83-0336
倒置显微镜Nikon Instech Co., Ltd.ECLIPSE Ti-U
温控板Tokai Hit CO.,LtdTP-108R-C
固体激光器相干OBIS 488LX
雪崩光电二极管ALV-GmbHALV-High Q.E. 雪崩光电二极管
相关器ALV-GmbHALV-5000/EPP

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