迷走神经刺激已被证实具有显著降低外周炎症的效果。本文介绍了一种改良的迷走神经刺激方案，可用于进一步研究胆碱能抗炎机制在局限性炎症反应中的作用。
本文内容
摘要
摘要
炎症是机体对感染和组织损伤的局部反应，由活化的巨噬细胞、单核细胞及其他免疫细胞介导，这些细胞会释放细胞因子和其他炎症介质。长期以来，体液和细胞机制在调节免疫反应中的作用已被广泛研究，但免疫学与神经科学领域的最新进展揭示了具有潜在治疗价值的特定神经机制。所谓胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP）已被证实能够强有力地调控先天免疫反应和炎症过程。20世纪初，Tracey 及其合作者开发了一种刺激迷走神经的技术，可模拟该通路的作用。该方法基于低电压、低频率的迷走神经电刺激，旨在避免过度刺激可能引起的副作用，例如心率变异性失调。目前已有商用的电刺激装置，使得在实验室中建立该方法变得简便可行。本研究旨在探讨前列腺素在 CAP 中可能发挥的作用。然而，基于前期尝试，我们未能成功应用原始方案，因为所诱导的炎症反应强度过高，或不符合酶代谢特性的要求。原始手术方案的各项参数基本保持不变，但针对炎症诱导条件以及处死前的时间点进行了优化，以更好地满足本研究的需求。即， 以研究CAP在更局限的炎症反应中的作用。
本文所展示的原始方案改良版本，增加了迷走神经刺激与分析之间的时间间隔，从而降低了炎症反应的诱导水平。此外，在减少注射脂多糖（LPS）剂量的同时，我们还发现了关于脾脏机制特性的新现象。
引言
先天免疫为多种生物提供了抵御感染和疾病的即时第一道防线。它不仅启动初级免疫反应以清除威胁，还在激活和指导适应性免疫方面发挥关键作用，后者以病原体特异性的方式执行次级免疫反应。炎症由大量细胞因子和趋化因子协调调控，这些因子能够募集其他免疫细胞至感染部位，并引发炎症的典型体征，如红肿、肿胀、疼痛、功能丧失和发热。炎症的持续时间和强度取决于多种因素，而及时消退炎症并恢复稳态是避免慢性炎症性疾病发生的关键步骤。神经科学与免疫学领域的最新进展揭示了若干具有巨大治疗潜力的神经机制，可用于调控中枢神经系统及外周组织的炎症反应。其中一种机制是胆碱能抗炎通路（CAP），也称为炎症反射，该通路由自主神经系统驱动4,5。
目前认为，炎症介质可激活感觉神经，并将炎症状态信号传递至中枢神经系统。随后，通过传出迷走神经启动反射性反应。一项关于胆碱能抗炎通路（CAP）解剖学细节的深入研究揭示了一种由迷走神经和脾神经分别组成的副交感-交感神经模型6。在CAP中，被激活的胆碱能传出迷走神经终止于腹腔-肠系膜神经节，进而通过一种尚未明确的机制激活肾上腺素能脾神经。已知被激活的脾神经支配脾脏白髓、边缘区和红髓中靠近免疫细胞的区域，脾脏是CAP的主要且必需的器官7,8。脾神经末梢释放的去甲肾上腺素（NE）与脾T淋巴细胞表面表达的β2肾上腺素能受体结合，诱导胆碱乙酰转移酶（ChAT）介导的乙酰胆碱（ACh）释放；而乙酰胆碱继而激活巨噬细胞上的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nACh），从而抑制细胞因子的产生和炎症反应2。因此，目前明确神经系统能够调控外周组织的炎症反应，并恢复局部免疫稳态。
顾名思义，乙酰胆碱（ACh）系统在这一神经-免疫调节通路的功能中具有核心重要性。有趣的是，迷走神经抗炎通路（CAP）的激活机制在外周和中枢神经系统中似乎有所不同。尽管脾脏中烟碱型受体（α7nAChR）的重要性早已被证实9，但毒蕈碱型受体（mAChR）则是该通路中枢激活所必需的10,11。最近的研究发现，外周给予一种具有中枢作用的M1型毒蕈碱受体激动剂，可在致死性小鼠内毒素血症期间显著抑制血清和脾脏中肿瘤坏死因子α（TNFα）的水平，而这一作用依赖于完整的迷走神经和脾神经信号传导12。我们近期还发现，缺乏前列腺素E2（PGE2）的小鼠无法对迷走神经刺激产生反应，也不能下调脂多糖（LPS）诱导的血清和脾脏细胞因子释放3。因此，CAP可能还受到除主要ACh通路以外的其他系统的调控。
迷走神经因其在体内走行蜿蜒而得名，支配包括肝脏、肺、脾脏、肾脏和肠道在内的主要器官13。鉴于其广泛的神经支配以及迷走神经强大的免疫抑制作用，胆碱能抗炎通路（CAP）的治疗潜力可能涵盖多种炎症性疾病。迷走神经可通过电刺激（或机械刺激）进行激活，并可精确调控电压和频率，与传统治疗方法不同，该方法无需向体内添加药物。目前已有针对风湿病患者的临床试验正在进行，以评估迷走神经刺激（VNS）在治疗慢性炎症中的临床意义14。总体而言，神经-免疫之间的相互作用及其对炎症的调控机制正在被深入研究，这将为传统疗法提供一种潜在的替代治疗策略。因此，分析迷走神经刺激对不同支配器官的影响，以及在慢性炎症动物模型中对其潜在治疗作用的表征，必将为发现新的潜在治疗靶点提供重要线索和希望。
Tracey 及其同事最初开发的方法4由于脂多糖（LPS）致死剂量引起的炎症反应过度激活，以及冷大气等离子体（CAP）激活与检测读数之间的时间间隔过短，无法直接应用于我们的研究领域。在本文中，我们将介绍对原始方案所做的修改，比较两种不同方法在细胞因子水平上的差异，并揭示在靶器官（脾脏）中出现的一种新的、相反的观察结果。
方案
所有动物实验均按照斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院当地伦理委员会批准的动物护理和使用指南进行。当地伦理委员会遵循欧盟关于动物护理的指令。
注意：与原始方案的主要区别在于术后恢复时间（6 小时） 与 1 小时）以及注射的 LPS 剂量（2 mg/kg） 与 15 mg/kg）。否则，与手术本身相关的不同设置均未改变。
1. 准备刺激用材料
- 打开计算机以及连接至刺激电极的数据采集系统（图1A）。
- 启动 Acknowledge 程序。
- 用 1× PBS 配制浓度为 5 mg/ml 的 LPS 储存液，分装后于 -20 °C 保存。实验当天取出一份分装样品融化，并根据动物体重用 1× PBS 稀释至 0.5 mg/ml，准备约 100 µl 用于注射。
2. 麻醉动物的准备工作
- 使用 C57Bl/6 小鼠。在可控气候条件下饲养，保持 12 小时光照/12 小时黑暗循环，提供标准啮齿类动物饲料，并给予饮水 随意摄取.
- 对实验当天体重约为25 g的小鼠进行手术。
注意：当诱导炎症反应时，对动物的临床反应进行定期检查和观察尤为重要。通过二氧化碳实施安乐死时应避免过早进行2 如果动物状况不符合伦理标准，则需要进行吸入麻醉。 - 设置麻醉机。
- 确保管道正确连接且无任何损坏。确保通风区域正常工作。将专用过滤器连接至异氟烷瓶，并向蒸发器中加入足量的异氟烷。
- 打开气体供应（空气和氧气），确保气瓶内气体足以支持实验。随后可通过三通连接管将异氟烷气流导向诱导室或面罩。
- 将三通接头转向诱导室。从饲养笼中取出一只小鼠，放入诱导室内。调节流量调节器，使氧气流速为1.0 L/min，空气流速为1.0 L/min。调节异氟烷浓度至4–5%。
- 当达到所需的麻醉深度时，剃除手术区域的毛发，并将动物从麻醉舱转移至面罩。 将三通接头转向面罩气流方向。调节流量调节器，使氧气流速为0.25 L/min，空气流速为0.25 L/min。
- 将异氟烷浓度调整至1.5 - 2.5%。在开始手术操作前，通过反射控制和呼吸频率检查麻醉深度。
- 用胶带将小鼠的四肢固定在工作台上。确保动物的鼻部仍准确地置于面罩内。
3. 迷走神经手术与刺激
- 用70%乙醇对手术区域进行消毒。
- 使用手术刀，在颈部水平小心切开皮肤（切口长度约为1至1.5 cm）。
注意： 在本实验方案中，假手术动物的手术操作至此结束。事实上，已有研究表明，仅用金属器械接触神经即可在一定程度上刺激神经。因此，当使用少量LPS时，为了获得更准确的手术对照动物，应在本步骤停止手术操作。 - 在显微镜（12.5倍物镜）辅助下，使用解剖镊子将左侧迷走神经从颈动脉中分离。首先通过去除皮肤和脂肪层定位胸锁乳突肌，然后将其牵开，以便将镊子置于神经和动脉后方。
注意： 下一步操作较为困难，因为神经与动脉紧密贴附。因此，很容易切断血管而导致动物死亡。然而，若能非常小心地将镊子插入神经与动脉之间，最终可实现两者的分离，从而成功分离出迷走神经。 - 将电极（图1B）放置于迷走神经下方。针状电极较长，因此即使在刺激过程中神经发生轻微移动，仍能始终保持与电极的接触。
- 借助注射器进行腹腔注射（i.p.）LPS（2 mg/kg）（用于细胞因子水平的检测；即，评估其下调作用）。
- 在开始刺激前等待5分钟。
- 在Acknowledge程序中按下启动按钮，以5 V、1 Hz的参数对迷走神经刺激5分钟。
- 移除电极，并使用外科缝合线缝合动物伤口。
- 在伤口处喷洒无痛屏障保护膜（NSBF），以促进愈合并预防感染。
4. 动物的恢复
- 手术后，将动物移回其饲养笼中以苏醒和恢复。在红外光下保持体温，并确保持续监测动物，直至其完全恢复意识。
- 在处死动物进行分析前，让其在笼中恢复 6 小时。
注意：迷走神经刺激的作用非常迅速，且已被证明具有持久效果（长达 48 小时），因此恢复时间可根据实验需求由研究者自行设定。
5. 为后续分析实施安乐死
- 将动物放入与 CO 相连的笼子中2 给药装置
- 将设备设置为5分钟的CO循环2 吸入
- 安乐死后，立即采集目标器官，并直接置于干冰上冷冻，以备后续分析例如， 使用小鼠TH1/TH2 9-plex检测法测定脾脏提取物中的细胞因子水平3.
结果
手术后延长观察时间及降低LPS剂量对TNFα和白细胞介素-1β（IL-1β）水平的影响
如先前所示，采用原始方案，迷走神经刺激（VNS）降低了TNFα水平（假手术组为169.3 ± 24.9 pg/mg，VNS组为39.7 ± 10.8 pg/mg，p < 0.05）。然而，当使用改良方案时，VNS组与假手术组之间的TNFα水平差异无统计学意义（114.2 ± 17.2 pg/mg vs. 96.6 ± 15.4 pg/mg，p = 0.45）。 < 0.001）以及 IL-1β（假手术组为 360.0 ± 40.21 pg/mg，迷走神经刺激组为 191.7 ± 27.2 pg/mg，p < 0.01）在腹腔注射LPS（15 mg/kg）后脾脏中的变化（图 2A）。在将分析时间从1小时调整为6小时，并将LPS剂量从15 mg/kg降低至2 mg/kg后，我们仅观察到VNS对TNFα的影响（假手术组为13.67 ± 1.81 pg/mg，VNS组为8.82 ± 1.20 pg/mg，p < 0.05）。 < 0.05），而IL-1β未受影响（假手术组为368.62 ± 35.65 pg/mg，对照组为304.99 ± 43.54 pg/mg）（图 2B）。未进行任何LPS注射（即， 生理盐水），在迷走神经刺激（VNS）后未检测到差异图 2C).
不同刺激条件下迷走神经刺激后脾脏中角质形成细胞趋化因子/人黑素瘤生长相关蛋白（KC/GRO）的水平
在原始方案中，我们发现 KC/GRO 在 VNS 作用下显著下调（假手术组为 597.4 ± 17.8 pg/mg，VNS 组为 416.4 ± 29.7 pg/mg，p < 0.001）（图 3A）。当采用 6 小时时间点并注射 2 mg/kg LPS 时，假手术组与 VNS 组动物之间未观察到差异（图 3B），而 VNS 对 TNFα 仍具有显著作用。然而，当 6 小时时间点不注射 LPS 时，我们观察到 VNS 后 KC/GRO 显著上调（假手术组为 59.37 ± 4.29 pg/mg，VNS 组为 141.22 ± 10.56 pg/mg，p < 0.001）（图 3C）。如预期，大多数其他细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12 和 IFNγ）水平极低（即使可检测到），在假手术组与 VNS 刺激组动物之间无明显差异。
图1： 进行迷走神经刺激所需材料的图片。A） i) 计算机，ii) 数据采集系统，以及 iii) 刺激电极装置。B） 置于迷走神经下方的电极特写。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：假手术组（SHAM）与迷走神经刺激（VNS）处理动物脾脏提取物中TNFα和IL-1β的水平。动物根据以下条件接受假手术（SHAM）或迷走神经刺激（VNS）手术：A）腹腔注射15 mg/kg LPS后恢复1小时，B）腹腔注射2 mg/kg LPS后恢复6小时，以及C）未注射LPS，恢复6小时。细胞因子水平通过包被促炎细胞因子抗体的酶标板测定，并以每毫克组织中的皮克（pg/mg）表示。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。星号表示VNS组与SHAM组小鼠之间的统计学差异（每组n = 8）。Student's t-检验 * p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。请点击此处查看此图的高清版本。
图3：假手术（SHAM）与迷走神经刺激（VNS）处理的 naïve 小鼠脾脏提取物中KC/GRO的水平。 动物根据以下条件接受假手术（SHAM）或迷走神经刺激（VNS）手术：A） 腹腔注射15 mg/kg LPS后1小时恢复，B） 腹腔注射2 mg/kg LPS后6小时恢复，以及C） 未注射LPS，恢复6小时。KC/GRO水平通过包被促炎细胞因子的检测板测定，并以每毫克组织中的皮克（pg/mg）表示。数据以均值±标准误（SEM）表示。星号表示VNS组与SHAM组小鼠之间的统计学差异（每组n = 8）。Student's t-检验 *** p <0.001。
讨论
自21世纪初被发现以来，胆碱能抗炎通路（CAP）的机制已得到深入研究。目前我们对该通路已有较为清晰的认识，特别是其靶器官——脾脏，在其中去甲肾上腺素（NE）、记忆性T细胞、乙酰胆碱（Ach）和巨噬细胞协同作用，高效地抑制炎症介质的释放2。我们最近还发表了关于小鼠功能性前列腺素系统重要性的研究数据，尤其是PGE2，它显然是CAP激活后脾脏中释放乙酰胆碱所必需的关键组分3。
这种实验技术称为迷走神经刺激，可在实验室中轻松实施，但必须遵守有关动物和手术操作的一些重要规程。我们采用正弦波刺激信号，这种信号应为"电荷平衡"刺激，以避免在神经中积聚可能造成神经损伤的电荷（与单相刺激相对）。在刺激神经时，无法将传入信号与传出信号区分开来，而这一点只能通过迷走神经切断实验在其他目的下实现。已知实验中使用的刺激持续时间和频率会影响炎症刺激后的细胞因子释放，但不会影响健康对照组的心率，也不会产生明显副作用。
首先，实验人员必须始终牢记，动物的处理、手术及术后恢复必须遵循动物护理的伦理规范。另一个要点是，手术操作的练习至关重要。分离迷走神经是一个较为困难的步骤，若发生血管损伤，可能导致动物死亡。随着经验的积累，手术可在15至20分钟内完成，从而缩短动物的麻醉时间，有利于其术后恢复。
关于选择合适的假手术动物，也可展开讨论。在本方案中，我们选用的动物仅接受了颈部水平的手术操作，但未将电极置于迷走神经下方。选择该方案的原因在于，仅将电极置于神经下方即可在一定程度上对神经产生机械刺激（此前已有观察报道）19，从而可能掩盖在极低炎症水平下发生的作用机制。若使用非常高剂量的LPS，则最佳的假手术对照可能是将电极置于神经下方，因为此时假手术的影响不会干扰或掩盖电刺激对细胞因子爆发的显著效应。
我们已制定本实验方案，以应对本研究领域中遇到的各种问题。正如我们在先前发表的论文中所讨论的，我们探讨了前列腺素系统在CAP中可能发挥的作用。由于存在酶促代谢过程，我们认为原方案中1小时的术后恢复时间不适合我们的实验需求。因此，我们将手术后的恢复时间延长至6小时。基于这一调整，我们还必须对LPS的剂量进行滴定，以符合伦理标准。我们选择了6小时的恢复时间，认为这一时长已足够满足实验目的。同时，我们将LPS剂量从原来的15 mg/kg逐步降低至0 mg/kg。在2 mg/kg剂量下，我们仍可观察到迷走神经刺激（VNS）对细胞因子的作用（图2），而当剂量进一步降低时，该作用则消失。
尽管已知迷走神经刺激（VNS）在脾脏中的主要作用是通过激活记忆性T细胞，进而激活巨噬细胞——即介导细胞因子减少的细胞，本文还表明，VNS似乎可直接诱导介质的释放（目前尚不清楚这些介质来源于何种细胞，有待进一步研究），从而招募参与炎症初级反应的其他细胞类型。事实上，在强烈炎症诱导后（15 mg/kg LPS），VNS显著降低了KC/GRO水平； 即， 原始方案）可在无炎症情况下激活KC/GRO的快速释放。趋化因子KC/GRO是一种与IL-8相关的蛋白质，具有强烈的趋化特性，已知在白细胞发育中发挥重要作用。例如， 驱动成熟和活化）、转运（例如， 中性粒细胞的趋化与募集，以及功能15例如，中性粒细胞是先天免疫系统吞噬系统的重要组成部分。它们在抵御入侵病原体的宿主防御中起着第一道防线的作用，同时也是炎症介导损伤的重要效应分子。16有趣的是，在我们尝试改进该方案时，偶然观察到脾脏中其他细胞类型直接参与迷走神经功能的现象。
该领域所有开创性工作均集中于脾脏——胆碱能抗炎通路（CAP）的作用靶器官，以及该通路在脓毒症或外周系统性炎症反应中的免疫调节作用。尤为重要的是，这些研究采用的是迷走神经的急性刺激方法，例如本文所展示的方法。该方法可用于特定器官的分子分析，或用于慢性炎症动物模型功能研究中短期效应的分析（手术后最多24至48小时）。
然而，迷走神经走行路径广泛，这也意味着复合动作电位（CAP）可能在治疗涉及不同受支配器官的慢性炎症性疾病方面具有重要应用价值13在此背景下，最受关注的器官之一是肠道，研究重点为炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以及术后诱发的麻痹性肠梗阻17此外，CAP调节在涉及肝脏、肾脏和肺部的许多其他炎症性疾病中的重要性也正在被研究。18然而，本方案在此情境下无法应用，因为迷走神经激活的长期效应需要重复刺激，而重复刺激显然只能通过植入式装置实现。 体内 植入电极。为此，动物需接受手术，将刺激套管电极放置于迷走神经周围20还需要注意的是，后一种技术在人类或体型较大的动物中描述得更为频繁。另一种刺激迷走神经的方法是机械性的，因为非侵入性和经皮迷走神经刺激在内毒素血症小鼠模型中已显示出免疫抑制作用。21然而，该技术的主要问题在于结果的可重复性，以及如何在动物模型的长期评估中确保迷走神经以相同的方式受到刺激。目前已开发出用于人类的设备，例如经耳迷走神经刺激或经颈迷走神经刺激装置，可递送电脉冲，且受试者耐受性良好。21它们主要用于治疗癫痫和偏头痛，并已显示出具有前景的疗效，可能为未来的门诊及外源性治疗提供方向。
总之，由于迷走神经在体内具有广泛的神经支配，人们正在多种炎症性疾病中研究胆碱能抗炎通路（CAP）的调控，以期发现具有潜在治疗靶点价值的有趣分子机制特性。本文介绍了一种急性刺激迷走神经的方法，该方法通过适度的炎症刺激并延长神经刺激（VNS）与分析之间的时间间隔（例如，允许酶促代谢过程的发生），从而能够在有限的炎症反应中研究CAP。
阐明迷走神经刺激作用的分子机制及其在治疗炎症性疾病中的高效应用具有重要意义，尤其从临床角度来看更是如此。事实上，该方法具有诸多优势。由于神经信号传递极为迅速，该疗法起效快且效果显著；例如，对细胞因子水平的影响在不到1小时的时间内即可观察到。4 此外，可采用机械性、非侵入性和经皮的神经刺激方式，为未来开发可门诊使用且易于实施的治疗手段带来了希望。最后，与常规治疗不同，迷走神经刺激利用的是机体自身的内源性通路。因此，与所有药物治疗不同，该方法不向体内引入任何外源性物质，从而避免了潜在的不良反应。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞典研究理事会、瑞典风湿病协会、卡罗林斯卡学院基金会、斯德哥尔摩县议会、瓦伦堡基金会以及GV 80周年研究基金会资助。作者还要感谢Hannah Aucott对稿件的校对。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机 | Toshiba | - | 任何计算机实际上均可兼容 |
| MP-150 数据采集系统 | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge 软件 | Biopac Systems | ||
| 小鼠 C57Bl/6 | Charles River | ||
| 麻醉机 | Simtec Engineering | ||
| 医用氧气瓶 | AGA | 107563 | |
| 医用空气瓶 | AGA | 108639 | |
| 异氟烷 Vetflurane (1,000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| 生理盐水 | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | 使用时稀释10倍 |
| 注射器 (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| 23 G 针头 | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (蓝色) |
| 显微解剖镊（弯型） | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| 解剖剪刀 | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| 4-0 外科缝合线 | Ethicon | G667G | |
| 安乐死装置 | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon 无刺激屏障膜 | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-重检测，超敏试剂盒 | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| 刺激电极装置 | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis 剃毛器 | Agnthos | GT420 | |
| R70 | 来自瑞典斯德哥尔摩 Lantmannen 的啮齿类动物饲料 |
参考文献
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