使用线性琼脂糖通道研究 Drosophila 幼虫爬行行为

摘要

Drosophila 幼虫是研究神经对行为控制的有力模型系统。本文介绍了使用线性琼脂糖通道诱导持续直线爬行的方法，以及在重复爬行行为过程中量化幼虫结构动态变化的技术。

摘要

Drosophila 幼虫爬行正成为研究感觉运动行为神经调控的有力模型。然而，幼虫在平坦开放表面上的爬行行为十分复杂， 包括：暂停、转向和蜿蜒移动。这种运动行为的多样性阻碍了对单个爬行步态周期中发生事件的详细分析。为克服这一障碍，研究人员制备了线性琼脂糖通道，将幼虫行为限制为直线、持续且节律性的爬行。理论上，由于琼脂糖通道和 Drosophila 幼虫身体均为光学透明，因此可在完整且自由运动的幼虫中监测由基因编码的荧光探针标记的幼虫结构的运动。过去，研究人员已将幼虫置于线性通道中，对其整体、体节及肌肉水平的爬行行为进行了分析¹。未来，通道中的幼虫爬行可用于钙成像以监测神经元活动。此外，这些方法可适用于任何基因型的幼虫以及由研究人员自行设计的任意通道。因此，下述实验方案在利用 Drosophila 幼虫作为运动控制研究模型的各类研究中具有广泛适用性。

引言

本方法的总体目标是详细研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的爬行行为。关于运动行为的实验在运动控制理论的发展与验证中发挥了重要作用²。传统上，运动行为主要在水生动物（例如，水蛭、七鳃鳗、蝌蚪）中进行研究³。这些动物运动行为的周期性特点，使得研究人员能够探究节律生成机制、分析驱动运动的生物物理事件，并监测伴随运动出现的神经放电模式。

使用 果蝇 用于运动研究的幼虫模型系统相较于其他模式生物具有一系列独特优势：遗传操作简便、发育过程特征明确、一龄和二龄幼虫身体光学透明，以及正在进行的全神经系统透射电子显微镜重建工作^4-6。然而， 果蝇 幼虫在平坦开阔表面上的运动较为复杂，包括停顿、转向和蜿蜒爬行⁷. 本文介绍了一种利用线性琼脂糖通道进行引导的方法 果蝇 幼虫运动行为，表现为幼虫进行持续、直线且有节律的爬行活动。

与在平坦开放表面研究幼虫行为相比，在琼脂糖通道中研究Drosophila幼虫行为具有多项优势。首先，该方法可使研究人员从幼虫行为谱的多种运动中特异性地选择出爬行行为。其次，通过调节通道宽度与幼虫体长的相对比例，可调控幼虫的爬行速度。第三，根据幼虫在通道内的装载方式和方向，可从背侧、腹侧或侧面对幼虫进行观察。这种幼虫方向的....

方案

1. 幼虫的制备

1. 在记录行为前一周，建立杂交组合（至少25只处女蝇和5只雄蝇）。所有杂交及后代均在25 °C条件下培养。
   注意：培养条件的温度可以调整，但需要根据发育速度的变化对下述时间线进行相应调整。
2. 记录前5天的早晨，将果蝇放入装有琼脂/果汁盖的收集笼中，并在琼脂/果汁盖中央加入一小滴（0.5–1 ml）酵母糊。
   1. 制作收集笼时，将孔戳入一个6盎司的方形聚乙烯容器 果蝇 瓶
   2. 制备琼脂/果汁盖片：在锥形瓶中将18 g琼脂与600 ml水混合。另取一个锥形瓶，将20 g蔗糖与200 ml苹果汁混合，微波加热至固体完全溶解。将两溶液混合并搅拌，冷却至60 °C。加入20 ml 10%对羟基苯甲酸甲酯（溶于95%乙醇），搅拌均匀。取约7 ml混合液加入35 × 10 mm圆形培养皿的下半部分。室温下静置1小时，使琼脂/果汁凝固。4 °C保存。
   3. 制作酵母糊：按体积比1:1加入干酵母与水。4 °C保存。
3. 检查幼虫样本的健康状况。
   1. 在记录前的第4天和第3天早晨，取下笼盖并更换新的笼盖。每天在同一时间更换笼盖，以收集24小时内的卵和新孵化的幼虫。
   2. 每次取下瓶盖后，检查该杂交组合的产卵数量，预期产卵数为500至2,000枚。如有需要，可调整成虫数量。
      注意：部分卵....

结果

本文介绍了一种利用琼脂糖通道引导黑腹果蝇（Drosophila）幼虫行为，并测量幼虫结构在爬行周期中动态变化的方法。在直线通道中的幼虫能够持续进行节律性爬行（图3）。由于幼虫和通道均为光学透明，因此该方法可与在特定目标结构中表达荧光探针的幼虫联合使用。我们记录了在所有神经元中表达GFP的幼虫（elav-Gal4/+; UAS-myr-GFP/+），并监测了其在爬行周期中腹神经索荧光强度的动态变化。结果显示，中枢神经系统（CNS）的移动时间几乎与幼虫头部和尾部的移动同步（图4A-B）。当肌肉收缩波沿身体纵轴传播时，中枢神经系统随之进出焦平面，导致腹神经索的荧光信号发生变化（图4）。为了定量分析多只幼虫在多个步态周期中腹神经索荧光强度的变化，我们将数据呈现在极坐标图中（图4C）。极坐标图显示，腹神经索荧光强度在步态周期中的动态变化遵循一种可重复的模式。

讨论

构建了一种微流控装置，用于制备可容纳线性琼脂糖通道的结构 果蝇 幼虫（图1）。当 果蝇 将幼虫置于这些线性琼脂糖通道中后，其行为模式仅限于爬行，从而便于详细观察幼虫结构在爬行周期中的动态变化。

当幼虫完成一系列节律性步态时，即为一次成功的记录（图3）。如果未出现该情况，请检查是否存在气泡等通道内障碍物，并评估幼虫的健康状况。成功记录的另一个关键因素是幼虫的方位应调整至最佳，以便清晰观察目标结构。若幼虫方位不正确，或爬出通道，可直接移除盖玻片并重新制备样本。根据我们的经验，约20%的幼虫在初次装载后无需调整即可获得高质量的行为记录。

过去，研究人员曾测量幼虫在爬行行为过程中口钩、肠道和腹部节段等结构的位置变化。为了可视化这些结构在爬行步态周期中的运动情况，生成了极坐标图。本文中，测量了神经索的荧光强度，并利用极坐标图来展示爬行步态周期中荧光动态的变化（图4）。使用极坐标图呈现数据具有多个优势：.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 盎司方形果蝇培养瓶	Scimart	DR-103
琼脂	sigma	A1296
蔗糖	sigma	S9378
苹果汁			非浓缩还原型
Tegosept	Fisher	T2300	对羟基苯甲酸甲酯
35 × 10 mm 圆形培养皿	Fisher	351008
酿酒酵母
PDMS 铸模模具	FlowJem		可向作者申请获取
异丙醇	Fisher	A417-1
实验室擦拭纸	Fisher	06-666-11
压缩空气罐	Fisher	18-431
10 cm 培养皿	BioPioneer	GS82-1473-001
琼脂糖	Fisher	50-444-176
剃刀刀片	Fisher	12-640
镊子	FST	11241-40
22 × 40 盖玻片，#1.5	Fisher	50-365-605
Fiji（版本 1.51d）	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com