使用线性琼脂糖通道研究 Drosophila 幼虫爬行行为

摘要

Drosophila 幼虫是研究神经对行为控制的有力模型系统。本文介绍了使用线性琼脂糖通道诱导持续直线爬行的方法，以及在重复爬行行为过程中量化幼虫结构动态变化的技术。

摘要

Drosophila 幼虫爬行正成为研究感觉运动行为神经调控的有力模型。然而，幼虫在平坦开放表面上的爬行行为十分复杂， 包括：暂停、转向和蜿蜒移动。这种运动行为的多样性阻碍了对单个爬行步态周期中发生事件的详细分析。为克服这一障碍，研究人员制备了线性琼脂糖通道，将幼虫行为限制为直线、持续且节律性的爬行。理论上，由于琼脂糖通道和 Drosophila 幼虫身体均为光学透明，因此可在完整且自由运动的幼虫中监测由基因编码的荧光探针标记的幼虫结构的运动。过去，研究人员已将幼虫置于线性通道中，对其整体、体节及肌肉水平的爬行行为进行了分析¹。未来，通道中的幼虫爬行可用于钙成像以监测神经元活动。此外，这些方法可适用于任何基因型的幼虫以及由研究人员自行设计的任意通道。因此，下述实验方案在利用 Drosophila 幼虫作为运动控制研究模型的各类研究中具有广泛适用性。

引言

本方法的总体目标是详细研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的爬行行为。关于运动行为的实验在运动控制理论的发展与验证中发挥了重要作用²。传统上，运动行为主要在水生动物（例如，水蛭、七鳃鳗、蝌蚪）中进行研究³。这些动物运动行为的周期性特点，使得研究人员能够探究节律生成机制、分析驱动运动的生物物理事件，并监测伴随运动出现的神经放电模式。

使用 果蝇 用于运动研究的幼虫模型系统相较于其他模式生物具有一系列独特优势：遗传操作简便、发育过程特征明确、一龄和二龄幼虫身体光学透明，以及正在进行的全神经系统透射电子显微镜重建工作^4-6。然而， 果蝇 幼虫在平坦开阔表面上的运动较为复杂，包括停顿、转向和蜿蜒爬行⁷. 本文介绍了一种利用线性琼脂糖通道进行引导的方法 果蝇 幼虫运动行为，表现为幼虫进行持续、直线且有节律的爬行活动。

与在平坦开放表面研究幼虫行为相比，在琼脂糖通道中研究Drosophila幼虫行为具有多项优势。首先，该方法可使研究人员从幼虫行为谱的多种运动中特异性地选择出爬行行为。其次，通过调节通道宽度与幼虫体长的相对比例，可调控幼虫的爬行速度。第三，根据幼虫在通道内的装载方式和方向，可从背侧、腹侧或侧面对幼虫进行观察。这种幼虫方向的灵活性使得在爬行过程中目标结构能够持续可见。第四，该方法适用于多种显微镜和物镜系统。例如，直线形通道可用于体视显微镜下的低分辨率成像，也可用于转盘共聚焦显微镜的高分辨率成像¹。第五，该方法可与任何遗传背景下的光遗传学或热遗传学神经元操控技术联合使用。最后，由于幼虫身体（一龄和二龄）以及琼脂糖通道均具有良好的光学通透性，因此该方法可用于研究由基因编码的荧光探针标记的幼虫结构在爬行过程中的动态运动或荧光强度变化。

所述方法适用于一龄和二龄幼虫的详细运动学研究 果蝇 幼虫行为。本文通过分析幼虫向前爬行过程中中枢神经系统（CNS）荧光强度的动态变化，展示通道的应用，并为神经元钙成像提供前期基础。

方案

1. 幼虫的制备

1. 在记录行为前一周，建立杂交组合（至少25只处女蝇和5只雄蝇）。所有杂交及后代均在25 °C条件下培养。
   注意：培养条件的温度可以调整，但需要根据发育速度的变化对下述时间线进行相应调整。
2. 记录前5天的早晨，将果蝇放入装有琼脂/果汁盖的收集笼中，并在琼脂/果汁盖中央加入一小滴（0.5–1 ml）酵母糊。
   1. 制作收集笼时，将孔戳入一个6盎司的方形聚乙烯容器 果蝇 瓶
   2. 制备琼脂/果汁盖片：在锥形瓶中将18 g琼脂与600 ml水混合。另取一个锥形瓶，将20 g蔗糖与200 ml苹果汁混合，微波加热至固体完全溶解。将两溶液混合并搅拌，冷却至60 °C。加入20 ml 10%对羟基苯甲酸甲酯（溶于95%乙醇），搅拌均匀。取约7 ml混合液加入35 × 10 mm圆形培养皿的下半部分。室温下静置1小时，使琼脂/果汁凝固。4 °C保存。
   3. 制作酵母糊：按体积比1:1加入干酵母与水。4 °C保存。
3. 检查幼虫样本的健康状况。
   1. 在记录前的第4天和第3天早晨，取下笼盖并更换新的笼盖。每天在同一时间更换笼盖，以收集24小时内的卵和新孵化的幼虫。
   2. 每次取下瓶盖后，检查该杂交组合的产卵数量，预期产卵数为500至2,000枚。如有需要，可调整成虫数量。
      注意：部分卵应已孵化成幼虫，新孵化的幼虫将出现在酵母糊之外。
   3. 将每个菌帽老化24小时。重新检查菌帽，以确定幼虫是否健康。
      注意：大多数卵应已孵化为幼虫，且幼虫应已爬入酵母糊中。健康状况不良的表现包括大量未孵化的卵、远离酵母糊的死亡幼虫体，以及幼虫腹部出现明显黑色斑块（表明存在免疫反应）。若幼虫状态不佳，应更换培养笼，制备新的盖片/酵母糊，并核查基因型。
   4. 弃去旧的瓶盖。
4. 收集幼虫用于行为记录。
   1. 在记录前的第2天和第1天，取下瓶盖并更换新的瓶盖。
   2. 将每个取下的盖子做好标记，并置于25 °C保存。这将获得用于行为记录的不同发育阶段的幼虫。可用于通道实验的幼虫包括从刚孵化（孵化后0–4小时）到二龄幼虫（孵化后24–48小时）的各个阶段。保留盖子以备后续连续几天的记录使用。
   3. 48小时后弃去所有上清液。
   4. 如有需要，可重复步骤 1.4.1–1.4.3，最多额外进行 5 天。此后产生的受精卵数量较少。

2. 通道的制备

1. 准备线性通道PDMS（聚二甲基硅氧烷，一种硅基弹性体）铸造模具（图1A）。PDMS铸造模具可根据要求向Heckscher实验室索取。
   1. 使用异丙醇清洁铸造模具。用空气干燥，或用实验室擦拭纸吸干，也可使用压缩空气罐吹干。
   2. 将铸造模具放入一个10 cm培养皿盖或其他容器中。
2. 配制并倾倒琼脂糖溶液。
   1. 将3 g琼脂糖溶于100 ml水中，配制成3%的琼脂糖溶液，微波加热至完全溶解。
   2. 冷却至55 °C，使气泡上升至表面。
   3. 将琼脂糖混合液倒入含有铸造模具的培养皿中，液面刚好覆盖模具即可。静置至琼脂糖完全凝固。
3. 从铸造模具中取出琼脂糖通道，并用剃刀片修剪琼脂糖圆片的边缘。
   1. 将通道置于盛有水的10 cm培养皿中。可在4 °C下保存7天。

3. 将幼虫装入通道以记录行为

注意：若将通道储存于 4 °C，请在用于行为记录前使其恢复至室温。

1. 使用干净的剃须刀片从步骤 2 中制备的通道中切出单个通道（图 2A）。
2. 使用一对镊子将步骤 2 中切出的通道凹槽面朝上放置在玻璃盖玻片上（图 2B）。盖玻片的尺寸和厚度取决于成像所用的具体显微镜。
3. 使用精细镊子从步骤 1 中制备的琼脂/果汁帽中选取一条幼虫，并将其放入切好的通道中（图 2C）。
   1. 切勿挤压幼虫。使用镊子尖端轻轻夹取。也可使用细尖的画笔操作幼虫。
      注意：这一点非常重要，因为幼虫对触碰极为敏感。若操作不当，伤害性刺激反应可能在实验开始的最初几秒内主导其行为。
   2. 通过短暂地将幼虫浸入水中进行清洗。
   3. 将幼虫放置到切好的通道后， 使用镊子尖端轻轻引导幼虫进入通道凹槽。
      注意：对于大多数应用，幼虫的宽度应与通道宽度相匹配。不同发育阶段幼虫的平均宽度如下：孵化后 0 小时 - 140 µm，孵化后 24 小时 - 180 µm，孵化后 48 小时 - 320 µm，孵化后 72 小时 - 500 µm，孵化后 96 小时 - 750 µm⁸。通道的宽度规格包括：100、150、200、250 和 300 µm，所有通道深度均为 150 µm 。
   4. 使用镊子尖端或画笔调整幼虫在通道内的位置。幼虫可朝任意方向放置：腹面朝上、腹面朝下或腹面侧向，具体取决于需要成像的结构。
4. 使用镊子轻轻将通道翻转，使幼虫现在位于盖玻片上。在通道两端滴加一至两滴水，使通道内充满水（图 2D）。
   1. 轻轻抬起通道边缘以去除任何气泡。
   2. 调整幼虫的方向。可通过轻轻推动通道（而非推动盖玻片）使幼虫滚动。若此方法无法改变方向，则取下盖玻片并重新调整幼虫位置。此时幼虫已准备好进行成像。
   3. 将通道/盖玻片置于倒置显微镜下进行成像。若使用正置显微镜，则只需将通道/盖玻片翻转即可。

4. 测量行为记录中的目标特征

1. 对于感兴趣的结构（例如，尾部，中枢神经系统），测量一个感兴趣的特征（例如荧光强度、位置随时间的变化
   注意：头部和尾部等结构可进行人工标注。例如，头部可依据其内含的深色H形口钩进行识别，尾部可依据其后端气管 spiracles 进行识别。本文重点关注神经索。使用神经元GAL4品系 elav-GAL4 驱动 UAS-myr-GFP 转基因elav>GFP)^9,10 用荧光标记中枢神经系统（CNS）。中枢神经系统包含两个前部脑叶，其连接于神经索，神经索向后延伸至尾部图3).
2. 测量神经索的像素强度（f_(NC)) 在每个时间点（t）。下文描述了一种手动注释方法，但此步骤可实现自动化。
   1. 在 Fiji（或类似软件）的“Analyze”菜单中使用 "设置测量参数 ..." 对话框用于报告平均灰度值和切片位置。
   2. 在视频的第一帧中，手动在神经索中央绘制一个方框（图3此步骤也可通过图像分割和配准算法实现自动化。
   3. 使用 "测量" 在“分析”菜单中使用命令来报告选定区域中像素的平均强度。这将生成一个 "结果" 窗。
   4. 在下一帧中，使用方向键手动重新定位方框，但不进行缩放。使用 "测量" 再次执行命令。更新后的结果将显示在 "结果" 窗口。对每个感兴趣的帧重复此步骤。
   5. 保存 "结果" 使用“文件”菜单中的“另存为...”命令。结果将被导出为 .xls 文件。

5. 分析测量结果

1. 标准化每一样本 f_(NC) 将值转换为介于 0 和 1 之间的值（z_(t)).
   1. 在电子表格（或其他程序）中打开 Results.xls 文件。该文件包含两列，分别表示帧编号和平均荧光强度。
   2. 新建一列并使用该公式 z_(t) = f_(NC[t])-分钟_(f[NC])/max_(f[NC])-分钟_(f[NC]) 以生成对应于每个时间点的标准化荧光值。
2. 确定记录中每次步态的步幅周期。
   注意：步态周期是向前（和向后）爬行时重复性全身运动的基本单位。按照惯例，前进步态周期始于（并结束于）尾部、头部以及肠道或中枢神经系统等内部器官的前向运动。¹.
   1. 手动检查行为记录，并记录起始时间（i每步的（）i_{（步周期[n]）}).
      注意：在下述示例中，以中枢神经系统向前运动作为步态周期的起始（图3).
   2. 对于每一步，计算其周期：Δt_{（步态周期）=} i_{（步态周期 [n+1]）}-i_{（步态周期 [n]）}.
3. 计算记录中每个时间点所占步态周期的百分比。
   1. 在电子表格文件中新增一列，用于表示自步态周期开始以来经过的时间c）。每次步态周期开始时，将步态周期起始后的时间重置为零（c_{（步周期[n]）} = 0）。相应调整启动后的时间。
   2. 在电子表格文件中新增一列，用于表示已 elapsed 的步态周期百分比（% 步态周期). 将调整后的时间除以步幅周期，再乘以100，转换为已 elapsed 步态周期的百分比： % 步态周期 = (c_{（步态周期[n]）})/ (Δt_{（步态周期）}*100).

6. 生成极坐标图以表示目标结构在爬行周期中的动态变化

1. 在 MATLAB 中，使用“主页”选项卡中的“导入数据”对话框导入更新后的 Results.xls 文件。
2. 创建一个包含步态周期百分比值（% 步态周期）的新数组 "Theta"。（"Theta = Var1"，其中 Var1 表示 % 步态周期）。
3. 创建一个包含归一化荧光值（z_(t)）的新数组 "Rho"。（"Rho = Var2"，其中 Var2 表示 z_(t)）。
4. 使用 'polarplot' 命令绘制极坐标图，以步态周期百分比作为角度，荧光值作为半径（"polarplot(Theta, Rho)"）。

结果

本文介绍了一种利用琼脂糖通道引导黑腹果蝇（Drosophila）幼虫行为，并测量幼虫结构在爬行周期中动态变化的方法。在直线通道中的幼虫能够持续进行节律性爬行（图3）。由于幼虫和通道均为光学透明，该方法可与在特定目标结构中表达荧光探针的幼虫联合使用。我们记录了在所有神经元中表达绿色荧光蛋白GFP的幼虫（elav-Gal4/+; UAS-myr-GFP/+），并监测了其在爬行周期中腹神经索荧光强度的动态变化。结果显示，中枢神经系统（CNS）的移动时间几乎与幼虫头部和尾部的移动同步（图4A-B）。当肌肉收缩波沿身体纵轴传播时，中枢神经系统随之进出焦平面，导致腹神经索的荧光信号发生变化（图4）。为了定量分析多只幼虫在多个步态周期中腹神经索荧光强度的变化，我们将数据呈现在极坐标图上（图4C）。极坐标图显示，腹神经索荧光强度在步态周期中的动态变化遵循一种可重复的模式。

讨论

构建了一种微流控装置，用于制备可容纳线性琼脂糖通道的结构 果蝇 幼虫（图1）。当 果蝇 将幼虫置于这些线性琼脂糖通道中后，其行为模式仅限于爬行，从而便于详细观察幼虫结构在爬行周期中的动态变化。

当幼虫完成一系列节律性步态时，即为一次成功的记录（图3）。如果未出现该情况，请检查是否存在气泡等通道内障碍物，并评估幼虫的健康状况。成功记录的另一个关键因素是幼虫的方位应调整至最佳，以便清晰观察目标结构。若幼虫方位不正确，或爬出通道，可直接移除盖玻片并重新制备样本。根据我们的经验，约20%的幼虫在初次装载后无需调整即可获得高质量的行为记录。

过去，研究人员曾测量幼虫在爬行行为过程中口钩、肠道和腹部节段等结构的位置变化。为了可视化这些结构在爬行步态周期中的运动情况，生成了极坐标图。本文中，测量了神经索的荧光强度，并利用极坐标图来展示爬行步态周期中荧光动态的变化（图4）。使用极坐标图呈现数据具有多个优势：...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 盎司方形果蝇培养瓶	Scimart	DR-103
琼脂	sigma	A1296
蔗糖	sigma	S9378
苹果汁			非浓缩还原型
Tegosept	Fisher	T2300	对羟基苯甲酸甲酯
35 × 10 mm 圆形培养皿	Fisher	351008
酿酒酵母
PDMS 铸模模具	FlowJem		可向作者申请获取
异丙醇	Fisher	A417-1
实验室擦拭纸	Fisher	06-666-11
压缩空气罐	Fisher	18-431
10 cm 培养皿	BioPioneer	GS82-1473-001
琼脂糖	Fisher	50-444-176
剃刀刀片	Fisher	12-640
镊子	FST	11241-40
22 × 40 盖玻片，#1.5	Fisher	50-365-605
Fiji（版本 1.51d）	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com