方法文章

研究内质网和线粒体相互作用通过原位接近连接分析在固定细胞

DOI：

10.3791/54899

⸱

2016年12月10日

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

本文内容

摘要

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这里，我们描述一个过程中固定的细胞可视化和高灵敏度量化内质网和线粒体之间的内源的相互作用。该协议提供在原位接近连接测定在线粒体相关膜界面靶向1,4,5-三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75 /电压依赖性阴离子通道/亲环三维复杂的优化。

摘要

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内质网 （ER） 和线粒体膜之间的结构相互作用，在称为线粒体相关膜 （MAM） 的域中，是细胞信号传导和细胞命运的关键枢纽。特别是，这些细胞器间接触位点允许钙通过电压依赖性阴离子通道 （VDAC）/葡萄糖调节蛋白 75 （GRP75）/肌醇 1,4,5-三磷酸受体 （IP3R） 钙通道复合物从 ER 转移到线粒体。虽然在生理和病理条件下对这个亚细胞区室进行了深入研究，但没有简单而灵敏的方法来量化细胞中 ER-线粒体接触的内源量。同样，MAM 是高度动态的结构，没有合适的方法可以在没有蛋白质过表达的情况下跟踪 ER-线粒体相互作用的修饰。在这里，我们报告了一种基于使用原位邻近连接测定的优化方案，通过使用线粒体外膜 （VDAC1） 和 ER 膜 （IP3R1） 的蛋白质之间的紧密接近来可视化和量化固定细胞中的内源性 ER-线粒体相互作用在 MAM 界面。也可以使用 GRP75/IP3R1 和亲环蛋白 D/IP3R1 对抗体进行类似的原位邻位连接实验。与其他成像程序相比，该测定具有多项优势，因为它具有高度特异性、敏感性并且适用于多种条件测试。因此，使用这种原位邻近连接测定应该有助于更好地了解 ER-线粒体相互作用的生理调节，以及它们在病理环境中的作用。

引言

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线粒体和内质网（ER）是不是在细胞中独立的细胞器，但它们在结构上和功能上相互作用在定义为线粒体相关的内质网的膜（MAM）的接触位点。事实上，MAMS对应其中ER的膜和线粒体紧密并列的区域，使从两侧的蛋白质之间的相互作用。然而，这些细胞器的膜不这些区域内熔合，因此它们保持它们的独立的实体。该MAMS起到钙（Ca 2+）关键作用，磷脂转移从ER到线粒体，影响能量代谢和细胞存活1-3。

内质网和线粒体之间的关系在20世纪70年代用电子显微镜首次观察。自那时以来，透射电子显微镜4,5，电子断层扫描6,7或ER和特定线粒体-荧光团的免疫定位S /荧光蛋白8人经典用于研究ER-线粒体相互作用。为MAM的分析的另一个有用的工具是基于使用亚细胞分离的。它允许MAM馏分的隔离通过耦合到Percoll密度梯度9差动超速离心。然而，最终产物含有丰富的MAM馏分，而不是纯的级分。总之，这些策略没有特别敏感和/或定量的，它们是不容易适合于大的筛选。可替代地，使用药物诱导的荧光间细胞器的接头遗传方法已经出现，但它们不允许细胞器相互作用的分析在蛋白10的内源表达水平。

根据Szabadkai的发现的IP3受体/ GRP75 / VDAC络合物在MAM 11中 ，我们开发了一个定量的方法来分析ER-线粒体相互作用。我们使用原位接近ligati上测定来检测和量化VDAC1和IP3R1之间的相互作用，在固定单元12参与在MAM接口的钙 -channeling复杂二细胞器表面蛋白。简言之，我们在线粒体外膜（小鼠抗VDAC1初级抗体）与IP3R1在ER膜（兔抗IP3R1初级抗体）（图1，分图a）探测VDAC1。然后，根据该测定，我们增加既抗小鼠和抗兔IgG（小鼠和兔接近结扎分析探针），其偶联至互补寡核苷酸的扩展。如果两个目标蛋白质是在低于40纳米的距离，寡核苷酸可以与随后加入的接头的寡核苷酸杂交以允许环状DNA模板（图1，图b）的形成。此环形DNA分子连接并放大，产生共价连接到邻近探针之一的单链DNA产物（图1，分图c） 6，接近结扎和扩增可以完成，从而导致后续检测由于德克萨斯红标记的寡核苷酸探针（图1，图d的杂交）。每个荧光点代表VDAC1 / IP3R1之间的相互作用，因而允许在单个细胞中原位 ER-线粒体相互作用的定量。

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图1:由内质网线粒体相互作用检测的示意图原位接近结扎分析。 一）针对VDAC1和针对IP3R1可以在MAM接口绑定到其表位接近兔第一抗体的小鼠初级抗体， 二）除了一对接近结扎探针的针对小鼠和兔IgG。这些探针已附加的DNA链，可以形成用于连接寡核苷酸的结扎模板。 三）结扎后所形成的环状DNA链可以通过使用德克萨斯红标记的寡核苷酸扩增和d）通过显微镜观察作为荧光点。 请点击此处查看该图的放大版本。

原位接近连接测定实验相似可以与GRP75 / IP3R1对抗体，以及亲环D（CypD）来执行/ IP3R1抗体，考虑到CypD被证明与在MAM接口的IP3受体/ GRP75 / VDAC复合物相互作用12-14。

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方案

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1.溶液的制备

  1. 通过稀释5.5毫升37％甲醛的14.5毫升的PBS制备于PBS（低盐）10％的甲醛。制备1M甘氨酸，pH 8.0的，溶解在50ml的PBS将3.8g甘氨酸;稀释此溶液，得到在1×PBS中的100mM甘氨酸。
  2. 制备0.1％的Triton-X100在1×PBS中。通过使用3.0M的氯化钠和0.30柠檬酸三钠在25℃在去离子水缓冲液中制备具有pH为7.0制备20倍盐水柠檬酸钠（SSC）。这稀释缓冲1X和使用去离子水0.01X。

2.细胞固定

注意:我们使用在这项研究中的HuH7肝细胞癌细胞系，但这种方法也适用于其他的粘附细胞培养物。

  1. 板的HuH7细胞（在DMEM 1g / L的葡萄糖进行培养，补充有10％胎牛血清和0.01％青霉素 - 链霉素的库存）以每未涂覆35毫米玻璃底培养皿150,000个细胞。当原电池工作文化，用胶原蛋白涂层的菜肴。
  2. 次日，除去培养基。清洗细胞用1毫升PBS和吸出的。通过加入1ml的甲醛10％固定细胞，并孵育在搅拌下室温（RT）10分钟。
  3. 停止用1ml的1M甘氨酸使反应并通过旋转混合。除去停止反应溶液并通过加入1ml 1×PBS中洗细胞;通过旋转和吸搅动。 1毫升的100mM甘氨酸添加到细胞中，并孵育它们在室温下搅拌15分钟，然后吸出。
    注:该协议可以在这里停了下来，下面的步骤可以推迟到另一天。在这种情况下，加入1ml的100mM甘氨酸和，保持在4℃，如果必要的。

3.细胞透

  1. 加入1ml 0.1％的Triton-X100的在1×PBS中，在室温下孵育在搅拌下15分钟，然后吸出。上一次电池文化性工作时20分钟 - 在该温育时间可以提高到15ES（ 如初级小鼠肝细胞）。加入1 ml 1X PBS洗细胞;吸出。

4.封锁

  1. 添加40微升的封闭溶液以每个样品（由试剂盒提供）;这个体积可以以覆盖样品增加。在湿度室中孵育30分钟的菜在37℃。
  2. 点击过的菜封闭液。试图获得平等的残液量为每张幻灯片，因为这会影响可重复性。不要让样品干！

5.一级抗体

  1. 稀释在1×PBS中的一抗，并添加溶液的培养皿（VDAC1小鼠抗体:1/100，IP3R1兔抗体:1/500）。可替代地，GRP75或CypD抗体（在1/500同时使用小鼠抗体）可以用来代替VDAC1。
  2. 在4℃的湿度室中孵育过夜。洗载玻片使用的Tris缓冲盐水两次含0.01％吐温（TBS-T）。
6。接近结扎分析探针

  1. 接近结扎分析探针由试剂盒。根据初级抗体的物种选择探针。
  2. 在抗体稀释液5:准备两个接近结扎分析探针1。使混合物静置在室温20分钟。添加稀释接近连接测定探头的解决方案。孵育在预加热的湿度室中的菜肴1小时，在37℃。用TBS-T洗碗两次。

7.结扎

  1. 使用在原位检测试剂德克萨斯红套件。
  2. 稀释5倍结扎股票（由试剂盒提供）1:5的高纯度水拌匀。稀释1倍连接液（由试剂盒提供）连接酶1:40和旋涡。等待添加连接酶，直到立即除了样品之前。
  3. 添加该溶液至每个样品（40微升为35毫米的玻璃底菜）孵育玻片在预热的湿度湛误码率在37℃，30分钟。用TBS-T洗载玻片两次。

8.放大

注意:小心，光敏感的试剂。

  1. 稀释5倍放大股票（由试剂盒提供）1:5的高纯度水。使用冷冻块中删除从冷冻聚合酶（-20℃）。稀释聚合酶（试剂盒提供）1:80在1倍放大的解决方案和旋涡。立即用混合前添加聚合酶。
  2. 添加该溶液至每个样品（40微升为35毫米的玻璃底菜）。孵育在预加热的湿度室100分钟的幻灯片在37℃。挖掘出幻灯片的扩增聚合酶溶液。

9.最后经洗涤

  1. 洗于1×SSC洗涤缓冲液将载玻片2分钟。洗在0.01X SSC洗涤缓冲液将载玻片2分钟。让菜在黑暗中在室温下干燥。

10.准备成像

  1. 使用含有DAPI（水相和不固化）安装介质的最小体积，以确保没有气泡得到盖玻片下抓装入滑动。指甲油可以用来密封边缘。 （:594纳米，发射:624纳米，放大倍数:63X激励）使用荧光或共聚焦显微镜分析前，等待约15分钟。
  2. 成像后，存放载玻片在黑暗中在-20℃。

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结果

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基于使用此协议我们的经验，我们可以放心地推荐为固定细胞ER-线粒体相互作用的可视化和量化这种方法。的在的HuH7肝癌细胞原位接近连接测定-可视ER-线粒体的相互作用，用几对抗体的代表性图像，被示出。如在图2中由荧光显微镜所示，每个红点代表两个目标蛋白质之间的相互作用，以及细胞核显示为蓝色。作为阴性对照，只使用一个一级抗体导致了无信号（图2，图a），验证双重识别要求用于原位接近连接测定信号产生。经典地，我们分析使用VDAC1 / IP3R1对抗体（图2，图b）的ER-线粒体相互作用。 原位接近结扎法experimen类似TS也可以与GRP75 / IP3R1或CypD / IP3R1对抗体（ 图2，板c和d，分别）的执行中，由于GRP75是分子伴侣在MAM接口11耦合VDAC和IP3受体和CypD被证明与交互该VDAC / GRP75 / IP3R...

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讨论

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总的来说，我们的研究表明， 原位 邻近连接测定确实是一种相关策略，可以跟踪和量化固定细胞中内源性 ER-线粒体相互作用，而无需使用细胞器特异性荧光团或荧光蛋白。VDAC1/IP3R1 抗体的特异性用途已适用于研究 HuH7 细胞中的 ER-线粒体相互作用。然而，根据细胞类型，可以使用 VDAC 和 IP3R 的替代亚型。在这种情况下，抗体需要在邻近连接测定实验之前通过免疫荧光进行验证，以确保特异性并找到正确的工作稀释度。我们还注意到，在使用新的邻近连接检测试剂盒或新的抗体批次时，需要系统地调整抗体的稀释度。我们选择使用原 位 检测德克萨斯红试剂，但也可以使用其他波长的试剂或使用 HRP/Novared 试剂盒进行明场检测。我们使用此选项来分析石蜡包埋的肝脏样本中的 ER-线粒体相互作用16，从而能够将 ER-线粒体相互作用可视化为红褐色点，从而克服了在呈现明显自发荧光的肝组织上工作的困难。

与传统的成像方法6,7,17相比， 原位 邻近连接测定18 避免使用可能诱...

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披露

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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我们感谢所有在我们的实验室谁促成了优化和验证协议的人。这项工作是由INSERM和国家研究机构（ANR-09-JCJC-0116和ANR-11-BSV1-033-02）的支持。 ET博士学位由高等教育和研究的法国文化部的一个研究奖学金期间的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甲醛SigmaF-8775
甘氨酸SigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm 玻璃底培养皿MatTeK 公司P35G-0-14-C
封闭溶液SigmaDUO-92004 或 DUO-92002在 Duolink PLA 探针中提供，Sigma
VDAC1 抗体Abcamab14734
IP3R1-H80 抗体Santa Cruzsc28614
CypD 抗体Abcamab110324
Grp75 抗体Santa Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220稀释得到 1x
Tween 100xeuromedex2001-B在 TBS 中稀释得到 0.01%
PLA 探针 小鼠 MINUSSigmaDUO-92004Duolink， Sigma
PLA 探针 兔 PLUSSigmaDUO-92002Duolink， Sigma
Duolink 检测试剂 红色SigmaDUO-92008Duolink， Sigma
连接溶液SigmaDUO-92008部分 Duolink 检测试剂 红色， Sigma
连接酶SigmaDUO-92008Duolink 检测试剂的一部分 红色，Sigma
扩增溶液SigmaDUO-92008Duolink 检测试剂的一部分 红色，Sigma
聚合酶SigmaDUO-92008Duolink 检测试剂的一部分 红色，Sigma
Duolink 封固剂SigmaDUO80102Duolink，Sigma
Softwares
Blob-finder 软件BlobFinder 是一款免费分发的软件，可以根据荧光显微镜图像对细胞进行计算。该软件可以从乌普萨拉大学图像分析中心免费下载，该中心开发了该软件，该工作得到了欧盟 FP6 项目、ENLIGHT 和 Olink Bioscience 的支持。http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ 软件可从以下网址免费下载： http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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VDAC1 IP3R1 GRP75 IP3R1 D IP3R1

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