内质网与线粒体相互作用的研究方法 原位 固定细胞中的邻近连接测定

摘要

在此，我们介绍一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体之间内源性相互作用的方法。该方案采用了一种优化的 原位 靶向线粒体相关膜界面处的三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75/电压依赖性阴离子通道/亲环素D复合物的邻近连接 assay

摘要

内质网（ER）与线粒体膜之间的结构相互作用，发生在被称为线粒体相关膜（MAM）的特定区域，是细胞信号传导和细胞命运调控的关键枢纽。特别是，这些细胞器间的接触位点可通过电压依赖性阴离子通道（VDAC）/葡萄糖调节蛋白75（GRP75）/肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）钙离子通道复合物，介导钙离子从内质网向线粒体的转移。尽管该亚细胞结构在生理与病理条件下均受到广泛关注，目前仍缺乏简单且灵敏的方法用于定量检测细胞中内源性内质网-线粒体接触水平。此外，MAM具有高度动态性，尚无合适方法可在不依赖蛋白过表达的前提下，实时追踪内质网与线粒体相互作用的动态变化。本文报道了一种基于使用 原位 利用邻近连接技术，在固定细胞中通过检测线粒体外膜蛋白（VDAC1）与内质网膜蛋白（IP3R1）在MAM界面的紧密邻近关系，实现对内源性内质网-线粒体相互作用的可视化与定量分析。类似 原位 邻近连接实验也可使用 GRP75/IP3R1 和 cyclophilin D/IP3R1 抗体对进行。该检测方法相较于其他成像技术具有多项优势，具有高度特异性、灵敏性，并适用于多条件检测。因此，该方法的使用可 原位 邻近连接实验有助于更深入地理解内质网-线粒体相互作用的生理调控机制，以及其在病理条件下的作用。

引言

线粒体和内质网（ER）并非细胞中相互独立的细胞器，它们在结构和功能上通过特定的接触位点相互作用，这些位点被称为线粒体相关内质网膜（MAM）。事实上，MAM 是指内质网膜与线粒体膜紧密靠近的区域，允许两侧蛋白质之间的相互作用。然而，这些细胞器的膜在这些区域内并不发生融合，因而保持各自独立的结构。MAM 在钙离子（Ca²⁺）和磷脂从内质网向线粒体的转移过程中发挥关键作用，影响能量代谢和细胞存活^1-3。

内质网与线粒体之间的关联最早在20世纪70年代通过电子显微镜观察到。自那时以来，透射电子显微镜^4,5、电子断层扫描^6,7或针对内质网和线粒体特异性荧光染料/荧光蛋白的免疫定位技术⁸被经典地用于研究内质网与线粒体之间的相互作用。另一种用于MAM分析的有用工具基于亚细胞组分分离技术。该方法可通过差速超速离心结合Percoll梯度分离出富含MAM的组分⁹。然而，最终产物仅含有富集的MAM组分，而非纯化的组分。总体而言，这些策略的灵敏度和/或定量能力有限，且难以适用于大规模筛选。此外，近年来出现了利用药物可诱导的细胞器间荧光连接子的遗传学方法，但这类方法无法在蛋白质内源性表达水平上分析细胞器间的相互作用¹⁰。

基于Szabadkai发现的位于MAM处的IP3R/GRP75/VDAC复....

方案

1. 溶液的配制

1. 通过将 5.5 ml 的 37% 甲醛稀释于 14.5 ml 的 PBS（低盐）中，制备 10% 甲醛溶液。通过将 3.8 g 甘氨酸溶解于 50 ml PBS 中，制备 1 M 甘氨酸溶液（pH 8.0）；再将该溶液稀释，获得含 100 mM 甘氨酸的 1×PBS 溶液。
2. 制备含 0.1% Triton-X100 的 1×PBS 溶液。使用去离子水缓冲液（25 °C 时 pH 为 7.0）配制含 3.0 M 氯化钠和 0.30 M 枸橼酸三钠的 20×Saline Sodium Citrate（SSC）溶液。用去离子水将该缓冲液稀释为 1× 和 0.01× 浓度。

2. 细胞固定

注意：本研究中使用了HuH7肝癌细胞系，但该方法适用于其他贴壁细胞培养。

1. 将HuH7细胞（培养于含1 g/L葡萄糖的DMEM培养基中，添加10%胎牛血清和0.01%青霉素-链霉素储备液）以每孔150,000个细胞的密度接种于未包被的35 mm玻璃底培养皿中。进行原代细胞培养时，应使用胶原蛋白包被的培养皿。
2. 次日，移除培养基，加入1 ml PBS洗涤细胞后吸除。加入1 ml 10%甲醛固定细胞，在室温（RT）条件下振荡孵育10分钟。
3. 加入1 ml 1 M甘氨酸终止反应，并通过旋转混匀。移除终止液后，加入1 ml 1....

结果

根据我们使用该方案的经验，我们可安全地推荐此方法用于固定细胞中内质网-线粒体相互作用的可视化与定量分析。代表性图像 原位 使用多对抗体，通过邻近连接实验可视化显示人肝癌HuH7细胞系中内质网与线粒体的相互作用。如图所示 图2 通过荧光显微镜观察，每个红色荧点代表两种靶蛋白之间的相互作用，细胞核呈蓝色。作为阴性对照，仅使用一种一抗时未检测到信号 （图2，a图），验证双重识别需求的必要性 原位 邻近连接实验信号生成。传统上，我们使用 VDAC1/IP3R1 抗体组合来分析内质网-线粒体相互作用 （图2，b面板）. 类似 原位 邻近连接实验也可使用 GRP75/IP3R1 或 CypD/IP3R1 抗体组合进行（图2，c和d面板（分别），因为GRP75是一种在MAM界面偶联VDAC和IP3R的分子伴侣¹¹ 且已证明CypD可与VDAC/GRP75/IP3R Ca

讨论

综上所述，我们的研究表明 原位 邻近连接技术确实是用于在固定细胞中追踪和定量内源性内质网-线粒体相互作用的一种有效策略，无需使用细胞器特异性的荧光染料或荧光蛋白。针对VDAC1/IP3R1抗体的特异性应用已优化用于研究HuH7细胞中的内质网-线粒体相互作用。然而，根据细胞类型的不同，也可选用其他VDAC和IP3R亚型。在此情况下，需在开展邻近连接实验前通过免疫荧光验证所用抗体的特异性，并确定其最佳工作稀释比例。我们还注意到，当使用新的邻近连接试剂盒或新批次抗体时，必须系统性地调整抗体的稀释度。我们选择使用 原位 检测可使用Texas red试剂，但也可选用其他波长的试剂，或使用HRP/Novared试剂盒进行明场检测。我们采用此方法分析了石蜡包埋肝组织样本中的内质网-线粒体相互作用。¹⁶，从而将内质网-线粒体相互作用呈现为红褐色斑点，克服了肝脏组织具有显著自发荧光而难以开展工作的难题。

与传统成像方法相比^6,7,17，该 原位 邻近连接实验¹⁸ 避免使用可能引发某.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲醛	Sigma	F-8775
甘氨酸	Sigma	G-8898
吐温-100	Sigma	T8532
35 mm 玻璃底培养皿	MatTeK 公司	P35G-0-14-C
封闭液	Sigma	DUO-92004 或 DUO-92002	包含于 Duolink PLA 探针试剂盒中，Sigma
VDAC1 抗体	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 抗体	Santa Cruz	sc28614
CypD 抗体	Abcam	ab110324
Grp75 抗体	Santa Cruz	sc13967
TBS 10x	euromedex	ET220	稀释至 1x 使用
吐温 100x	euromedex	2001-B	用 TBS 稀释至 0.01%
PLA 探针 小鼠 MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink，Sigma
PLA 探针 兔 PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink，Sigma
Duolink 红色检测试剂	Sigma	DUO-92008	Duolink，Sigma
连接溶液	Sigma	DUO-92008	Duolink 红色检测试剂的一部分，Sigma
连接酶	Sigma	DUO-92008	Duolink 红色检测试剂的一部分，Sigma
扩增溶液	Sigma	DUO-92008	Duolink 红色检测试剂的一部分，Sigma
聚合酶	Sigma	DUO-92008	Duolink 红色检测试剂的一部分，Sigma
Duolink 封片介质	Sigma	DUO80102	Duolink，Sigma
软件
Blob-finder 软件			BlobFinder 是一款免费分发的软件，可用于对荧光显微镜图像中的细胞进行定量分析。该软件由乌普萨拉大学图像分析中心开发，开发工作得到了欧盟 FP6 计划 ENLIGHT 项目和 Olink Bioscience 的支持。可从以下网址免费下载：http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ 软件			可从以下网址免费下载：http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html