使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

摘要

近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。

摘要

LINC复合体被认为是从细胞骨架向细胞核传递机械力的关键结构。Nesprin-2G是LINC复合体的一个关键组分，它将肌动蛋白细胞骨架与核周间隙中的膜蛋白（SUN结构域蛋白）连接起来。这些膜蛋白进一步与细胞核内的核纤层蛋白（lamins）相连。最近，研究人员将一种福斯特共振能量转移（FRET）力探针克隆到微型Nesprin-2G中（即Nesprin-TS，张力传感器），并用于在活体NIH3T3成纤维细胞中测量跨越Nesprin-2G的张力。本文描述了在NIH3T3成纤维细胞中利用Nesprin-TS测量LINC复合体力学信号的实验流程。为了从Nesprin-TS中提取FRET信息，本文还概述了如何将原始光谱图像进行光谱解混，以分离出受体和供体荧光通道。使用开源软件ImageJ对图像进行预处理，并转换为比值成像图像。最后，展示了Nesprin-TS的FRET数据，并提供了在不同实验组之间比较数据的策略。

引言

近年来，基于基因编码的力敏感FRET传感器已成为测量活细胞中张力的重要工具，有助于揭示机械力如何作用于蛋白质^1,2,3,4。利用这些工具，研究人员可借助常规荧光显微镜对活细胞内的细胞内力进行非侵入性成像。这类传感器由一对FRET荧光蛋白（供体和受体荧光蛋白，通常为蓝色供体和黄色受体）通过一段弹性肽连接而成³。与C端或N端标记不同，该传感器被插入蛋白质的内部位点，用于测量跨蛋白质传递的机械力，其功能类似于分子应变仪。当传感器所受机械张力增加时，FRET对之间的距离增大，导致FRET效率降低³。因此，FRET信号与张力呈负相关关系。

这些基于荧光的传感器已针对黏着斑蛋白（vinculin³ 和 talin⁴）、细胞骨架蛋白（α-actinin⁵）以及细胞间连接蛋白（E-Cadherin^6,

方案

1. 获取Nesprin-2G传感器DNA及其他质粒DNA

1. 从商业来源获取Nesprin-2G TS（张力传感器）、Nesprin-2G HL（无头型）对照、mTFP1、venus和TSmod。使用标准的大肠杆菌（E. coli）菌株（如DH5-α）扩增所有DNA质粒并进行纯化，具体操作如前所述^12,13。

2. 用Nesprin-2G及其他质粒DNA转染细胞

1. 在标准细胞培养箱中（温度 37 °C，CO₂ 浓度 5%），将 NIH 3T3 成纤维细胞培养至 6 孔细胞培养板中细胞融合度达到 70–90%。细胞生长培养基使用添加了 10% 胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 在细胞培养超净台中，吸除培养基，并用约 1 mL 低血清细胞培养基冲洗每个孔。向每孔中加入 800 µL 低血清细胞培养基，然后将 6 孔板放回培养箱中。
3. 用移液器将 700 µL 低血清细胞培养基加入 1.5 mL 离心管中，再加入 35 µL 脂质载体溶液，配制成 "脂质混合物"。通过反复移液混匀。在管壁上标记 "L." 以标识。
4. 准备六个 1.5 mL 离心管，分别标记为 1 至 6 ....

结果

按照上述方案，从DNA文库中获取质粒DNA并将其转化至E. coli细胞中。从LB/氨苄青霉素平板上筛选出表达传感器DNA的E. coli菌落，并在液体LB培养基中进行扩增。载体扩增后，使用标准的商业化DNA提取试剂盒将质粒DNA纯化至TRIS-EDTA缓冲液中。使用分光光度计对纯化的DNA进行定量，使其浓度达到µg/mL的标准浓度（图1A，第1-2天）。

使用 NIH3T3 成纤维细胞，在 6 孔塑料细胞培养皿中将细胞培养至 70-90% 汇合度。为将质粒 DNA 导入 NIH3T3 细胞，采用脂质介导的质粒转染法。使用 commercially available transfection reagent（参见材料表）作为 DNA 的脂质载体。将两份重复的 Nesprin-TS 和 Nesprin-HL 传感器分别转染至 4 个细胞孔中（

讨论

上述内容概述了一种对活细胞中核LINC复合物蛋白Nesprin-2G所受机械张力进行活细胞成像的方法及其实验演示。在此项工作之前，已有多种技术被用于对细胞核施加应变并测量其整体材料特性，例如微吸管抽吸法、磁珠细胞计量法和显微激光消融法^16,17,18 。然而，直到我们最近的研究之前，尚无研究直接证明拉伸力能够直接传递到活细胞中的LINC复合物蛋白上²。

此前，我们的实验室已证明，Nesprin-2G 的一种修饰版本（称为 mini-Nesprin2G）可被设计用于表达一种名为 TSmod 的 FRET 力探针（图 2C）²。TSmod 此前已被证实可用于在活细胞及多种承重蛋白中动态测量张力^3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	从 https://www.addgene.org/68127/ 获取
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	从 https://www.addgene.org/68128/ 获取
mTFP1 DNA	Addgene	54613	从 https://www.addgene.org/54613/ 获取
mVenus DNA	Addgene	27793	从 https://www.addgene.org/27793/ 获取
TSmod DNA	Addgene	26021	从 https://www.addgene.org/26021/ 获取
感受态细胞	Bioline	BIO-85026
液体LB培养基	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
固体LB细菌培养板	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
氨苄青霉素	Sigma	A9518
分光光度计	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
石英比色皿	Biorad	1702504	SmartSpec Plus专用比色皿
DNA提取试剂盒	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6孔细胞培养皿	Falcon-Corning	353046	多孔6孔聚苯乙烯培养皿
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）细胞培养液	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
牛血清	Life Technologies	16170-078
低血清细胞培养液	Gibco	31985-070	低血清培养基，"OptiMEM"
脂质载体溶液	Invitrogen	11668-019	脂质试剂，"Lipofectamine 2000"
1.5 mL无菌塑料管	Denville	c2170
胰蛋白酶	Gibco	25200-056	0.25%胰蛋白酶-EDTA (1x)
玻璃底显微镜观察皿	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm培养皿，带20 mm底部孔，#1.5玻璃
纤连蛋白	ThermoFisher	33016015	人纤连蛋白，血浆来源
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Gibco	14190-144	杜氏磷酸盐缓冲盐水
15 mL无菌离心管	Greiner bio-one	188261
摆动转子离心机	Thermo electron	Centra CL2	摆动转子Thermo Electron 236
细胞培养生物安全柜	Forma Scientific	1284
温控细胞培养孵育箱	ThermoFisher	3596
倒置LED宽场荧光显微镜	Life technologies	EVOS FL
透明HEPES缓冲成像培养基	Molecular Probes	A14291DJ
胎牛血清	Life technologies	10437-028
带458 nm和515 nm激光源的温控倒置共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 710-w/光谱META检测器
外延生长培养基	New England Biolabs	B9020s
NIH 3T3成纤维细胞	ATCC	CRL-1658