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使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

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DOI：

10.3791/54902

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2017年4月11日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

本文内容

摘要

近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。

摘要

LINC复合体被认为是从细胞骨架向细胞核传递机械力的关键结构。Nesprin-2G是LINC复合体的一个关键组分，它将肌动蛋白细胞骨架与核周间隙中的膜蛋白（SUN结构域蛋白）连接起来。这些膜蛋白进一步与细胞核内的核纤层蛋白（lamins）相连。最近，研究人员将一种福斯特共振能量转移（FRET）力探针克隆到微型Nesprin-2G中（即Nesprin-TS，张力传感器），并用于在活体NIH3T3成纤维细胞中测量跨越Nesprin-2G的张力。本文描述了在NIH3T3成纤维细胞中利用Nesprin-TS测量LINC复合体力学信号的实验流程。为了从Nesprin-TS中提取FRET信息，本文还概述了如何将原始光谱图像进行光谱解混，以分离出受体和供体荧光通道。使用开源软件ImageJ对图像进行预处理，并转换为比值成像图像。最后，展示了Nesprin-TS的FRET数据，并提供了在不同实验组之间比较数据的策略。

引言

近年来，基于基因编码的力敏感FRET传感器已成为测量活细胞中张力的重要工具，有助于揭示机械力如何作用于蛋白质1,2,3,4。利用这些工具，研究人员可借助常规荧光显微镜对活细胞内的细胞内力进行非侵入性成像。这类传感器由一对FRET荧光蛋白（供体和受体荧光蛋白，通常为蓝色供体和黄色受体）通过一段弹性肽连接而成3。与C端或N端标记不同，该传感器被插入蛋白质的内部位点，用于测量跨蛋白质传递的机械力，其功能类似于分子应变仪。当传感器所受机械张力增加时，FRET对之间的距离增大，导致FRET效率降低3。因此，FRET信号与张力呈负相关关系。

这些基于荧光的传感器已针对黏着斑蛋白（vinculin3 和 talin4）、细胞骨架蛋白（α-actinin5）以及细胞间连接蛋白（E-Cadherin6,7、VE-Cadherin8 和 PECAM8）进行开发。在这些生物传感器中，最常用且表征最充分的弹性连接子被称为 TSmod，其由一段重复的 40 个氨基酸序列 (GPGGA)8 构成，该序列源自蜘蛛丝蛋白 flagelliform。研究表明，TSmod 可表现为线性弹性纳米弹簧，对 1 至 5 pN 的拉伸力具有 FRET 响应性3。通过使用不同长度的 flagelliform 序列，可调节 TSmod 的 FRET-力敏感性的动态范围9。除 flagelliform 外，spectrin 重复序列5 和 villin 头结构域肽段（称为 HP35）4 也已被用作类似力生物传感器中 FRET 配对之间的弹性肽段4。最后，最近一项研究显示，TSmod 还可用于检测压缩力10。

我们最近通过将TSmod插入此前开发的截短型Nesprin-2G蛋白（称为mini-Nesprin2G）中，构建了一种用于核质骨架连接蛋白（LINC复合物）Nesprin-2G的力传感器（图2C），该蛋白的功能与内源性Nesprin-2G相似11。LINC复合物包含多种蛋白，从细胞核外延伸至核内，将细胞质骨架与核纤层连接起来。Nesprin-2G是一种结构蛋白，可同时与细胞质中的肌动蛋白骨架以及核周间隙中的SUN蛋白结合。利用我们的生物传感器，我们证实Nesprin-2G在NIH3T3成纤维细胞中受到肌动球蛋白依赖性的张力作用2。这是首次直接测量到作用于核LINC复合物蛋白上的力，该传感器有望成为研究力学信号在力学生物学中对细胞核作用的重要工具。

以下方案详细介绍了如何使用Nesprin-2G张力传感器，包括在哺乳动物细胞中表达Nesprin张力传感器（Nesprin-TS），以及对表达Nesprin-TS的细胞进行FRET图像的采集与分析。本方案采用配备光谱检测器的倒置共聚焦显微镜，详细描述了如何通过光谱分离法和比率型FRET成像来测量敏化发射FRET信号。所得的比率型图像可用于进行相对定量的力学比较。尽管本方案主要聚焦于成纤维细胞中Nesprin-TS的表达，但其方法可轻松适用于其他哺乳动物细胞，包括细胞系和原代细胞。此外，本方案中关于图像采集和FRET分析的部分也可直接推广至其他基于FRET的力生物传感器，这些传感器已被开发用于研究其他蛋白质的力学特性。

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方案

1. 获取Nesprin-2G传感器DNA及其他质粒DNA

  1. 从商业来源获取Nesprin-2G TS（张力传感器）、Nesprin-2G HL（无头型）对照、mTFP1、venus和TSmod。使用标准的大肠杆菌（E. coli）菌株（如DH5-α）扩增所有DNA质粒并进行纯化，具体操作如前所述12,13。

2. 用Nesprin-2G及其他质粒DNA转染细胞

  1. 在标准细胞培养箱中（温度 37 °C，CO2 浓度 5%），将 NIH 3T3 成纤维细胞培养至 6 孔细胞培养板中细胞融合度达到 70–90%。细胞生长培养基使用添加了 10% 胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
  2. 在细胞培养超净台中，吸除培养基，并用约 1 mL 低血清细胞培养基冲洗每个孔。向每孔中加入 800 µL 低血清细胞培养基，然后将 6 孔板放回培养箱中。
  3. 用移液器将 700 µL 低血清细胞培养基加入 1.5 mL 离心管中，再加入 35 µL 脂质载体溶液，配制成 "脂质混合物"。通过反复移液混匀。在管壁上标记 "L." 以标识。
  4. 准备六个 1.5 mL 离心管，分别标记为 1 至 6 号。向每管中加入 100 µL 低血清细胞培养基。
    1. 根据第 1 步获得的质粒 DNA 浓度，向 1 和 2 号管中各加入 2 µg Nesprin 2G-TS；向 3 和 4 号管中各加入 2 µg Nesprin-HL；向 5 号管中加入 1 µg mTFP；向 6 号管中加入 1 µg mVenus。移取不同类型 DNA 时，不得重复使用同一移液器吸头。
  5. 从标记为 "L" 的管中吸取 100 µL 脂质混合物，分别加入已标记的 1–6 号管中，通过反复移液混匀。每管使用新的洁净移液器吸头。室温孵育 10–20 分钟。
  6. 将每管中的 200 µL 混合液分别加入 6 孔板中细胞融合度为 70–90% 的对应孔中。在每孔边缘标记所加入的相应 DNA 名称。将 6 孔板放入培养箱中孵育 4–6 小时。
  7. 吸除培养基，加入 1–2 mL 低血清细胞培养基进行冲洗。吸除低血清培养基后，向每孔加入 2 mL 胰蛋白酶，并将 6 孔板放回培养箱中孵育 5–15 分钟。
  8. 在细胞于培养箱中解离的同时，在细胞培养超净台中用浓度为 20 µg/mL 的纤连蛋白磷酸盐缓冲液（PBS）溶液对 6 个玻璃底成像培养皿进行包被处理。静置包被约 20 分钟。
  9. 待细胞完全解离后，加入 2 mL DMEM 以中和胰蛋白酶活性。
  10. 将每孔中的细胞悬液转移至对应标记的 15 mL 离心管中，在水平转子离心机中以 90 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，用移液器将每管中的细胞沉淀重悬于 1,000 µL DMEM 中。
  11. 吸除玻璃培养皿中的纤连蛋白溶液，用移液器将每种细胞悬液各 1,000 µL 分别加入对应的玻璃底培养皿中。
  12. 待细胞沉降至玻璃底培养皿底部（约 15 分钟）后，向每孔中再加入 1 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，并放回细胞培养箱中。让细胞贴壁并表达传感器至少 18–24 小时。
    注意：本实验使用商业化的阳离子脂质转染试剂进行细胞转染（参见 材料表）。此外，也可通过使用携带毒素抗性基因的质粒构建稳定表达细胞系（例如，Nesprin-TS 和 -HL 的 pcDNA 质粒可在 DNA 共享数据库网站获取（参见 材料表），其携带遗传霉素抗性基因）。对于难以转染的细胞，还可采用病毒转导方法（如慢病毒、逆转录病毒或腺病毒）实现传感器的表达。
  13. 除 Nesprin-TS 外，还需按照步骤 2.1–2.12 所述方法，对其他细胞共转染 Nesprin HL 作为零力对照；TSmod 也可作为零力对照使用，其 FRET 信号应与 Nesprin-HL 相似。
  14. 对细胞共转染 mTFP1 和 venus 以生成光谱指纹图谱（参见步骤 4）。
    注意：mTFP1 和 venus 的表达水平通常高于 Nesprin-TS，因此可能需要减少转染 DNA 用量，以获得与 Nesprin-TS 相当的表达水平。

3. 验证转染效率

  1. 转染完成后约 18–24 小时，使用倒置荧光显微镜通过比较视野中荧光细胞数量与总细胞数量来评估转染效率（通常为 5–30%）。
    1. 使用配备激发波长约为 462 nm（mTFP1）或 525 nm（venus）、发射滤光片中心波长约为 492 nm（mTFP1）或 525 nm（venus）的荧光显微镜。
      注：也可使用 GFP 滤光片组，其可同时捕获 mTFP1 和 venus 的发射信号，从而确认转染效率。
  2. 转染后 48 小时内对活细胞进行成像。
    1. 或者，用含钙镁的 PBS 配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 5 分钟，随后置于 PBS 中保存，并在 48 小时后观察8。
      注：超过 48 小时后，信号质量和强度会下降。固定细胞可保存其状态，包括所表达的 FRET 信号8；然而，固定后的细胞只能在 PBS 中成像，因为封片介质可能影响 FRET14。固定细胞仅可与其它固定细胞进行比较，因为表达水平可能存在变化。
      注意：多聚甲醛具有毒性，操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

4. 为光谱解混采集 mTFP1 和 Venus 荧光蛋白的光谱指纹

  1. 在细胞培养超净台中，将细胞培养基更换为添加了10%胎牛血清的成像培养基（HEPES缓冲）。
  2. 将观察培养皿置于温度可控（37 °C）的共聚焦显微镜载物台上。
  3. 将转染了mTFP1的细胞的玻璃观察皿置于60倍油镜下，物镜数值孔径为1.4。
    注意：在激光扫描显微镜的60倍物镜上使用镜油，以使其折射率与玻璃基底接近。镜油应滴加在物镜镜头顶部，并直接接触玻璃盖玻片。
  4. 使用458 nm激发光源和中心波长为500 nm的发射带通滤光片，定位表达mTFP1的细胞。
  5. 当视野中出现荧光细胞时，选择光谱检测模式（本文所用软件中的“"Lambda Mode"”），并采集光谱图像（图3-1）；采集波长范围应覆盖458 nm以上，以10 nm为增量步长（图3-3）。在细胞上选择一个明亮的荧光区域（ROI）（半径为20像素）。
    注意：表达mTFP1的ROI区域的光谱形状在细胞内应保持相对恒定。若光谱形状变化显著，需重新调整激光强度和增益设置，以提高信噪比。
  6. 通过点击“"save spectra to database."”将该荧光ROI区域的平均归一化强度添加至光谱数据库中。
  7. 优化激光功率和增益，以获得良好的信噪比。不同设备的设置参数可能有所不同。以未转染的非荧光细胞作为背景参照，逐步提高增益和功率，使细胞荧光明亮，但不超过探测器的动态范围（即避免达到饱和点）。背景细胞在平均信号后应无明显可检测的荧光。
  8. 对转染venus的细胞重复上述过程，但需注意以下例外情况：
    1. 定位表达venus的细胞时，确保激发波长为515 nm，且带通滤光片的中心波长接近530 nm。
    2. 在“"Spectral Mode,"”中，使用515 nm激发波长，而非458 nm。

5. 采集未混合图像

  1. 将采集模式切换为 "光谱解混"。
  2. 将venus和mTFP1的光谱特征添加到解混通道中（图3，箭头-2）。
  3. 将激发激光重新设置为458 nm氩离子激光源。
  4. 将Nesprin-TS观察皿置于60倍油镜上方。
  5. 聚焦于一个荧光表达足够明亮的细胞后，调节增益和激光功率以优化信噪比。
    注意：由于Nesprin-TS的FRET效率接近20%，解混后的venus图像应明显比解混后的mTFP1图像暗。通过迭代确定合适的激光功率和增益设置后，所有后续图像采集均须保持这些参数不变。
  6. 至少采集15–20个亮度相对相近的Nesprin-TS细胞图像，并避免出现过度的像素饱和（图像处理过程中会去除所有饱和像素）。
  7. 使用相同的成像参数，对Nesprin-HL细胞重复上述图像采集过程。

6. 图像处理与比率图像分析

  1. 使用开源的 ImageJ（FIJI）软件（http://fiji.sc/），通过 BioFormats Reader 打开原生格式图像。
  2. 对图像进行预处理，并根据先前建立的方案15计算比值图像。

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结果

按照上述方案，从DNA文库中获取质粒DNA并将其转化至E. coli细胞中。从LB/氨苄青霉素平板上筛选出表达传感器DNA的E. coli，并在液体LB培养基中进行扩增。载体扩增后，使用标准的商业化DNA提取试剂盒将质粒DNA纯化至TRIS-EDTA缓冲液中。利用分光光度计对纯化的DNA进行定量，使其浓度达到µg/mL的标准浓度（图1A，第1-2天）。

使用 NIH3T3 成纤维细胞，在 6 孔塑料细胞培养皿中将细胞培养至 70-90% 汇合度。为将质粒 DNA 导入 NIH3T3 细胞，采用脂质介导的质粒转染法。使用 commercially available transfection reagent（参见材料表）作为 DNA 的脂质载体。将两份重复的 Nesprin-TS 和 Nesprin-HL 传感器分别转染至 4 个细胞孔中（

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讨论

上述内容概述了一种对活细胞中核LINC复合物蛋白Nesprin-2G所受机械张力进行活细胞成像的方法及其实验演示。在此项工作之前，已有多种技术被用于对细胞核施加应变并测量其整体材料特性，例如微吸管抽吸法、磁珠细胞计量法和显微激光消融法16,17,18 。然而，直到我们最近的研究之前，尚无研究直接证明拉伸力能够直接传递到活细胞中的LINC复合物蛋白上2。

此前，我们的实验室已证明，Nesprin-2G 的一种修饰版本（称为 mini-Nesprin2G）可被设计用于表达一种名为 TSmod 的 FRET 力探针（图 2C）2。TSmod 此前已被证实可用于在活细胞及多种承重蛋白中动态测量张力3...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由托马斯·F·和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金（资助编号：DEC）和美国国立卫生研究院资助项目 R35GM119617（资助编号：DEC）支持。共聚焦显微镜成像在弗吉尼亚联邦大学纳米材料表征核心（NCC）设施完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Nesprin-TS DNAAddgene68127从 https://www.addgene.org/68127/ 获取
Nesprin-HL DNAAddgene68128从 https://www.addgene.org/68128/ 获取
mTFP1 DNAAddgene54613从 https://www.addgene.org/54613/ 获取
mVenus DNAAddgene27793从 https://www.addgene.org/27793/ 获取
TSmod DNAAddgene26021从 https://www.addgene.org/26021/ 获取
感受态细胞BiolineBIO-85026
液体LB培养基ThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
固体LB细菌培养板Sigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
氨苄青霉素SigmaA9518
分光光度计Biorad273 BR 07335SmartSpec Plus
石英比色皿Biorad1702504SmartSpec Plus专用比色皿
DNA提取试剂盒Macherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
6孔细胞培养皿Falcon-Corning353046多孔6孔聚苯乙烯培养皿
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）细胞培养液Gibco11995-065DMEM(1x)
牛血清Life Technologies16170-078
低血清细胞培养液Gibco31985-070低血清培养基，"OptiMEM"
脂质载体溶液Invitrogen11668-019脂质试剂，"Lipofectamine 2000"
1.5 mL无菌塑料管Denvillec2170
胰蛋白酶Gibco25200-0560.25%胰蛋白酶-EDTA (1x)
玻璃底显微镜观察皿In Vitro ScientificD35-20-1.5-N35 mm培养皿，带20 mm底部孔，#1.5玻璃
纤连蛋白ThermoFisher33016015人纤连蛋白，血浆来源
磷酸盐缓冲盐水（PBS）Gibco14190-144杜氏磷酸盐缓冲盐水
15 mL无菌离心管Greiner bio-one188261
摆动转子离心机 Thermo electronCentra CL2摆动转子Thermo Electron 236
细胞培养生物安全柜Forma Scientific1284
温控细胞培养孵育箱ThermoFisher3596
倒置LED宽场荧光显微镜Life technologiesEVOS FL
透明HEPES缓冲成像培养基Molecular ProbesA14291DJ
胎牛血清Life technologies10437-028
带458 nm和515 nm激光源的温控倒置共聚焦显微镜 Zeiss LSM 710-w/光谱META检测器
外延生长培养基New England BiolabsB9020s
NIH 3T3成纤维细胞ATCCCRL-1658

参考文献

  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247(2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

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FRET Nesprin 2G ImageJ NIH 3T3

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