用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

摘要

本方案描述了如何制备由明胶和I型胶原组成的二维混合基质，以及I型胶原的三维凝胶栓，用于研究线性侵袭体。这些方案可用于研究线性侵袭体的形成、基质降解活性，以及原代细胞和癌细胞系的侵袭能力。

摘要

细胞黏附、迁移和侵袭参与多种生理和病理过程。例如，在转移灶形成过程中，肿瘤细胞必须穿越解剖屏障，侵入并迁移通过周围组织，以到达血管或淋巴管。这一过程需要细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在细胞水平上，许多细胞（包括大多数癌细胞）能够形成以F-肌动蛋白为基础的结构——侵袭性突起（invadosomes），其具有降解ECM的能力。侵袭性突起是突出的肌动蛋白结构，可募集并激活基质金属蛋白酶（MMPs）。ECM的分子组成、密度、结构排列和刚度在调控侵袭性突起的形成与激活中起关键作用。体外实验中，明胶降解实验是观察和定量侵袭性突起降解活性的标准方法。然而，明胶是变性的I型胶原，并非生理性的基质成分。一种新型的利用I型胶原纤维的实验方法已被开发并用于证明：这种生理性基质是诱导侵袭性突起形成的强效因子。沿胶原纤维形成的侵袭性突起因其在线性纤维上的排列方式而被称为线性侵袭性突起（linear invadosomes）。此外，对线性侵袭性突起的分子分析表明，盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1）是介导其形成的受体。这些数据明确表明，使用具有生理相关性的基质对于理解细胞与ECM之间复杂相互作用的重要性。

引言

细胞外基质（ECM）的重塑发生在生理和病理过程中，例如血管生成和肿瘤细胞侵袭。在生理条件下，多种细胞类型（主要来源于造血谱系）能够降解细胞外基质成分。例如，巨噬细胞能够穿越解剖屏障以到达组织，而破骨细胞则通过降解骨基质来维持钙稳态。更广泛地说，机体中所有基质都会不断更新，以维持其物理和化学特性。在肿瘤组织中，肿瘤微环境的组成发生改变。例如，在乳腺癌和肺癌中，I型胶原蛋白过度表达并在肿瘤周围积聚。此外，这种积聚与转移风险增加相关^1,2。癌症转移依赖于肿瘤细胞降解细胞外基质并侵入邻近组织的能力。

细胞的侵袭活性归因于富含肌动蛋白的特化结构，称为侵袭性突起（invadosomes）。该术语包括分别存在于正常细胞和癌细胞中的足体（podosomes）和侵袭伪足（invadopodia）。例如， 巨噬细胞、内皮细胞以及癌细胞（例如 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系）。 体外，侵袭体可组织形成不同的形态：点状、聚集体或玫瑰花结状³经典上，侵袭体由一个含多种蛋白质的F-actin核心构成，例如支架蛋白Tks5和皮层肌动蛋白（cortactin），其周围环绕着黏附斑分子，如整合素（integrins）和纽蛋白（vinculin）。⁴最近研究表明....

方案

注意：固定之前的所有步骤均须在无菌层流罩中完成。

1. 二维矩阵

注意：使用二维基质来确定形成侵袭性细胞突起的细胞百分比以及每个细胞的基质降解面积。

图1：实验方案。制备明胶和I型胶原基质的实验流程概要。可单独制备明胶基质，也可制备明胶与I型胶原的混合基质。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 明胶基质
   注意：荧光明胶基质用于定量基质降解，非荧光明胶用于促进I型胶原纤维的黏附。荧光明胶基质 также 用于 podosome 和 invadopodia 的研究（参见 图1).
   1. 在无菌超净工作台内，将一块聚四氟乙烯薄膜（20 cm × 15 cm）置于工作区域，并用70%乙醇消毒。<....

结果

使用两种基质（明胶和I型胶原蛋白）的组合图1 和 4），我们已发现一种新型的侵袭性细胞器，称为线性侵袭体。对这些基质进行标记，可观察到线性侵袭体沿I型胶原纤维的形成过程及其降解能力（图5）。随后可使用前述宏（步骤4.2）对侵袭结构的数量进行定量，也可通过ImageJ软件测定降解活性，具体方法如Martin所述 等 和 Diaz 等^9,10. 混合基质可通过将DDR1定义为线性侵入体形成与功能所必需的受体，实现对线性侵入体的表征（图6).

为了理解细胞的侵袭能力，我们还开发了一种三维I型胶原塞侵袭实验（图3和

讨论

传统上，侵袭性突起（invadosomes）的研究通常在体外（in vitro）进行，且未考虑细胞所处的微环境及其接种基质的影响。目前常用的基质类型包括明胶、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白或高密度纤维状胶原蛋白（HDFC）^7,11；然而，这些基质往往不能真实反映细胞在体内所处的微环境，缺乏生理相关性。本文采用了一种新型基质，由明胶与纤维状I型胶原蛋白共同组成。利用I型胶原蛋白纤维，我们发现了一类新型的侵袭性突起，称为线性侵袭性突起（linear invadosomes），其特异性地在具有生理结构的I型胶原蛋白上形成⁷。通过对I型胶原蛋白进行标记，可观察到线性侵袭性突起沿纤维的分布，并利用Tks5和cortactin等细胞标志物对其形成进行定量分析。借助这种混合基质，我们鉴定出一种新的受体——盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1），其参与了线性侵袭性突起的形成过程⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶溶液	Sigma	G1393	储存液为 20 mg/ml，使用浓度为 1 mg/ml
猪皮来源明胶 Oregon Green 488 标记物	Molecular probe life technologies	G13186	5 mg 溶于无菌水中，配制成 1 mg/ml
显微镜盖玻片	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12 mm，No.1
0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中含 2.5% 戊二醛	Electron microscopy science	15960	用无菌水稀释至 0.5%
1× PBS，pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	所有固定前步骤均使用此 PBS
大鼠尾胶原 I 型	Corning	354236
5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯	Life technologies	C-6125
含钙和镁的 1× DPBS	Gibco by life technologies	14040-091
16% 多聚甲醛溶液	Electron microscopy science	15710	用 1× PBS 稀释至 4%
Triton X-100	Sigma	T9284
10× PBS 缓冲液，pH 7.4	Ambion	AM9625	用水稀释至 1×，用于固定后的各步骤
Tks5 抗体	Santa Cruz	sc-30122	侵袭体标志物，稀释比例：1/100
Cortactin 4F11 抗体	Millipore	5180	侵袭体标志物，稀释比例：1/100
DDR1 抗体	Cell signaling	5583	线性侵袭体受体
稀释比例：1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	丝状肌动蛋白标志物，稀释比例：1/200
Hoechst	Sigma	33258	细胞核标志物，稀释比例：1/200
FluoProbes 二抗	Interchim	FP-488 FP-547H 或 FP-647H
牛血清白蛋白	Sigma	A2153	用 1× PBS 稀释至 4%
Fluoromount G 封片介质	Interchim	FP 483331
ImageJ 软件	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
细胞培养小室	Corning	353097	孔径 8.0µm，24 孔板
氢氧化钠（NaOH）	Sigma	221465