用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

摘要

本方案描述了如何制备由明胶和I型胶原组成的二维混合基质，以及I型胶原的三维凝胶栓，用于研究线性侵袭体。这些方案可用于研究线性侵袭体的形成、基质降解活性，以及原代细胞和癌细胞系的侵袭能力。

摘要

细胞黏附、迁移和侵袭参与多种生理和病理过程。例如，在转移灶形成过程中，肿瘤细胞必须穿越解剖屏障，侵入并迁移通过周围组织，以到达血管或淋巴管。这一过程需要细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在细胞水平上，许多细胞（包括大多数癌细胞）能够形成以F-肌动蛋白为基础的结构——侵袭性突起（invadosomes），其具有降解ECM的能力。侵袭性突起是突出的肌动蛋白结构，可募集并激活基质金属蛋白酶（MMPs）。ECM的分子组成、密度、结构排列和刚度在调控侵袭性突起的形成与激活中起关键作用。体外实验中，明胶降解实验是观察和定量侵袭性突起降解活性的标准方法。然而，明胶是变性的I型胶原，并非生理性的基质成分。一种新型的利用I型胶原纤维的实验方法已被开发并用于证明：这种生理性基质是诱导侵袭性突起形成的强效因子。沿胶原纤维形成的侵袭性突起因其在线性纤维上的排列方式而被称为线性侵袭性突起（linear invadosomes）。此外，对线性侵袭性突起的分子分析表明，盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1）是介导其形成的受体。这些数据明确表明，使用具有生理相关性的基质对于理解细胞与ECM之间复杂相互作用的重要性。

引言

细胞外基质（ECM）的重塑发生在生理和病理过程中，例如血管生成和肿瘤细胞侵袭。在生理条件下，多种细胞类型（主要来源于造血谱系）能够降解细胞外基质成分。例如，巨噬细胞能够穿越解剖屏障以到达组织，而破骨细胞则通过降解骨基质来维持钙稳态。更广泛地说，机体中所有基质都会不断更新，以维持其物理和化学特性。在肿瘤组织中，肿瘤微环境的组成发生改变。例如，在乳腺癌和肺癌中，I型胶原蛋白过度表达并在肿瘤周围积聚。此外，这种积聚与转移风险增加相关^1,2。癌症转移依赖于肿瘤细胞降解细胞外基质并侵入邻近组织的能力。

细胞的侵袭活性归因于富含肌动蛋白的特化结构，称为侵袭性突起（invadosomes）。该术语包括分别存在于正常细胞和癌细胞中的足体（podosomes）和侵袭伪足（invadopodia）。例如， 巨噬细胞、内皮细胞以及癌细胞（例如 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系）。 体外，侵袭体可组织形成不同的形态：点状、聚集体或玫瑰花结状³经典上，侵袭体由一个含多种蛋白质的F-actin核心构成，例如支架蛋白Tks5和皮层肌动蛋白（cortactin），其周围环绕着黏附斑分子，如整合素（integrins）和纽蛋白（vinculin）。⁴最近研究表明，Tks5 和 RhoGTPase Cdc42 可作为功能性侵袭体的最小分子标志⁵这些结构能够通过募集并激活特定的金属蛋白酶蛋白（如MT1-MMP和MMP-2）来降解细胞外基质（ECM）⁶在之前的一项研究中，我们报道了I型胶原原纤维与其特异性受体——盘状结构域受体1（DDR1）之间的相互作用，可导致一类新型侵袭体的形成，这类侵袭体被命名为线性侵袭体。线性侵袭体沿I型胶原原纤维形成⁷这些结构能够通过募集并激活MT1-MMP/MMP2来降解I型胶原纤维。此外，其形成依赖于Tks5和Cdc42。⁵. 体外我们证实了线性侵袭体的存在，并揭示了DDR1在其形成与活性中的作用⁸ 采用不同的策略，这些策略包含多种基质成分的组合，包括：i) 荧光标记明胶包被的盖玻片，ii) 荧光标记I型胶原纤维包被的盖玻片，以及iii) 三维I型胶原凝胶塞。由于使用了不同的基质，我们能够研究并表征线性侵袭体的形成及其降解活性。^7,8.

最后，为了更好地理解侵袭性细胞的生物学特性，采用了二维和三维培养系统中细胞外基质（ECM）成分的组合，以模拟肿瘤微环境组成的复杂性。以下是用于在二维和三维培养系统中用明胶/Ⅰ型胶原蛋白包被盖玻片的实验方案。

方案

注意：固定之前的所有步骤均须在无菌层流罩中完成。

1. 二维矩阵

注意：使用二维基质来确定形成侵袭性细胞突起的细胞百分比以及每个细胞的基质降解面积。

图1：实验方案。制备明胶和I型胶原基质的实验流程概要。可单独制备明胶基质，也可制备明胶与I型胶原的混合基质。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 明胶基质
   注意：荧光明胶基质用于定量基质降解，非荧光明胶用于促进I型胶原纤维的黏附。荧光明胶基质 также 用于 podosome 和 invadopodia 的研究（参见 图1).
   1. 在无菌超净工作台内，将一块聚四氟乙烯薄膜（20 cm × 15 cm）置于工作区域，并用70%乙醇消毒。
   2. 等分试样 20 µL 1 mg/mL 明胶液滴呈线状排列，间距约 1 cm；参见 图1 用于液滴的有序排列。
   3. 覆盖每个 20 µL 含灭菌玻璃盖玻片（直径12 mm）的明胶液滴
   4. 室温孵育20分钟。如果明胶具有荧光性，需避光保存。
   5. 等分试样 40 µL 在步骤1.1.3中盖玻片排成的直线正下方约1 cm处，沿直线排列0.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS，1×）液滴，每个液滴间距约1 cm。
      注意：戊二醛是一种有毒的固定剂。使用时需佩戴手套，避免吸入。
   6. 使用宝石镊子将每张明胶包被的盖玻片转移至戊二醛液滴中。
      注意：在 Parafilm 上残留少量明胶液滴是正常现象。请勿将此残留物用于其他实验。
   7. 室温孵育40分钟。对于荧光盖玻片，需避光保存。
   8. 取一个24孔细胞培养板，向每孔中加入 500 µL 无菌1x PBS。将盖玻片有明胶的一面朝上放入每个孔中。
   9. 用1×PBS洗涤两次，每次5分钟。
      注意：此步骤中，盖玻片可用于实验，或保存于1x PBS中 4 °C非荧光盖玻片可保存一周，荧光盖玻片可保存48小时。
2. I型纤维状胶原基质
   注意：采用纤维状 I 型胶原基质以研究线性侵袭体的形成及其相关的基质降解。通过结合使用荧光标记的 I 型胶原与非荧光明胶盖玻片，可实现侵袭体标志物与胶原纤维的共定位。例如， 远红外通道显示F-actin，红色通道显示胶原蛋白I，绿色通道显示Tks5，Hoechst染料用于细胞核染色）。另一方面，采用非荧光标记的胶原蛋白I与非荧光标记的明胶盖玻片组合，以最大化可染色的侵袭体标记物数量（例如， 远红外通道显示F-actin，红色通道显示cortactin，绿色通道显示Tks5，Hoechst染料用于细胞核染色。最后，采用非荧光标记的I型胶原与荧光标记的明胶盖玻片相结合的方法，以定量分析与明胶相关的降解情况。例如， 远红外通道中的F-肌动蛋白，红色通道中的Tks5，绿色通道中的标记物，以及用于细胞核染色的Hoechst染料（见图1）。Hoechst染料用于细胞核染色，同时结合对所用细胞系定期进行的PCR检测，还可用于检测支原体污染。
   1. 荧光标记的胶原蛋白 I
      1. 使用从大鼠尾腱中提取的市售I型胶原蛋白，溶于0.02 N乙酸溶液中。取出制备所需量的I型胶原蛋白 500 µL 每盖玻片加入终浓度为 0.4 mg/mL 的 I 型胶原溶液。
      2. 加入5-羧基罗丹明琥珀酰亚胺酯，终浓度为 10 µg/mL，根据 I 型胶原溶液的终体积计算（n × 500 µL).
      3. 用移液器反复吹打混匀溶液，室温避光孵育5分钟。
      4. 用含钙和镁的1×Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）定容至终体积，直接使用。
   2. 纤维状 I 型胶原盖玻片
      1. 使用在步骤1.1中预先制备的非荧光或荧光明胶盖玻片。
      2. 在含有钙和镁的1×DPBS中配制荧光标记或非荧光标记的I型胶原蛋白溶液，终浓度为0.4 mg/mL。
      3. 添加 500 µL 每张盖玻片加入24孔细胞培养板中的荧光或非荧光I型胶原溶液。
      4. 37 °C孵育4小时 37 °C 用于I型胶原蛋白的聚合。
      5. 孵育后，通过倾斜培养板并从孔壁侧面（而非直接在盖玻片上）用移液器吸除多余的I型胶原，以避免损伤基质。
         注意：该基质不能储存，去除多余胶原蛋白 I 后应立即接种细胞。

2. 细胞接种、培养时间及固定

1. 根据细胞类型，使用适当的培养基制备细胞，并将细胞加入至每孔终体积为 500 µL。
2. 为表征细胞系形成线性侵袭体及其降解基质的能力，将细胞接种于 I 型胶原基质上，分别培养 4 小时、12 小时和 24 小时，以确定线性侵袭体形成的动力学及其相关的降解活性。
   注意：表 1 列出了实验室中已测试的细胞系示例。

   细胞系	每张盖玻片接种细胞数	用于 线性侵袭体定量的基质接触时间	用于 线性侵袭体降解活性 定量的基质接触时间
   MDA MB 231	40,000	4 h	12 h
   HUH7	40,000	12 h	24 h
   HEP 3B	40,000	12 h	24 h
   SNU 398	40,000	12 h	24 h
   NIH 3T3 src	30,000	4 h	12 h
   A431	50,000	6 h	24 h
   A549	40,000	12 h	24 h
   RAW	40,000	12 h	12 h
   PAE	40,000	12 h	12 h

   表 1：细胞接种与孵育时间参考表。 本表列出了用于研究线性侵袭体的部分细胞系，包括每种细胞系在基质上的接种数量、观察线性侵袭体所需的时间以及观察其相关基质降解所需的时间。线性侵袭体寿命较短，为在尽可能多的细胞中观察到线性侵袭体，细胞与 I 型胶原基质的接触时间应较短。另一方面，为充分观察到明胶降解现象，细胞与 I 型胶原基质的接触时间需比表中所列时间更长。
3. 移除细胞培养基后，加入 500 µL 含 4% 多聚甲醛的 1X PBS 溶液，固定盖玻片 10 分钟。
4. 用 1X PBS 洗涤两次。
5. 置于 4 °C 避光保存。

3. 免疫荧光

1. 用新鲜配制的溶液对细胞进行透化处理，持续 10 min 含0.2% Triton X-100的1x PBS溶液。此溶液不可重复使用。
2. 用1×PBS洗涤盖玻片两次。
3. 在实验台上放置一块石蜡膜（20 cm × 15 cm）。
4. 在1×PBS中加入4%牛血清白蛋白（BSA）配制一抗稀释液，具体操作如下所述 材料表.
5. 等分试样 50 µL 一滴一滴地将一抗溶液以约1厘米的间隔排成一行。
6. 将每张盖玻片置于液滴上。
7. 室温避光孵育40分钟。
8. 孵育结束后，用1×PBS洗涤两次。
9. 将二抗、鬼笔环肽（phalloidin）和 Hoechst 染料用含 4% BSA 的 1x PBS 溶液稀释。
10. 等分试样 50 µL 在盖玻片第一排下方约1 cm处，以之前相同的方式滴加混合液液滴。
11. 将每张盖玻片置于液滴上。
12. 室温避光孵育30分钟。
13. 孵育后，用1×PBS洗涤两次。
14. 用蒸馏水洗涤一次，以去除盐分。
15. 使用聚合型封片剂将盖玻片封固在玻璃载片上。
16. 将盖玻片在室温下避光干燥过夜，然后进行显微镜观察。

4. 定量分析

图2：线性侵袭体定量分析。 该宏程序需要F-肌动蛋白和Tks5染色的共聚焦图像（格式：1,024 × 1,024）。（A）首先，打开F-actin图像并创建掩膜。（B）然后，打开Tks5图像并进行阈值处理，随后运行宏程序。（C）分析结果将显示在两个表格中。每个细胞中线性侵袭体的数量以及其他信息（如线性侵袭体占据细胞面积的百分比）将出现在“摘要”表中；每个线性侵袭体的大小将出现在“结果”表中。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 形成线性侵袭足细胞的百分比
   1. 计数形成线性侵袭足的细胞，每个盖玻片约计数100个细胞（使用技术重复三组）。每组n至少量化300个细胞，n = 3。
   2. 通过三次独立实验的平均值计算形成线性侵袭足的细胞百分比，共量化900个细胞。
2. 每个细胞中线性侵袭足的大小与数量
   注意：使用共聚焦显微镜对F-肌动蛋白和Tks5染色进行连续成像。该宏程序适用于1,024 x 1,024的图像格式。
   1. 使用ImageJ软件并加载配套的宏程序。
3. 每个细胞的降解面积
   1. 每种实验条件使用三个盖玻片。
   2. 每个盖玻片采集30张荧光明胶与Hoechst染色细胞核的图像。
   3. 使用ImageJ软件，操作步骤参照Martin KH et al.⁹中的描述。

5. 三维胶原侵袭实验

图3：侵袭实验示意图。 侵袭实验方案的总结。将I型胶原与琥珀酰亚胺酯染料交联，并在37 °C下聚合1小时。将细胞以无血清培养基加入I型胶原凝胶上方，然后将插入式培养小室置于含10% FBS的培养基中。在对照组中，于细胞接种后1小时固定胶原凝胶；在实验组中，于细胞接种后3天固定胶原凝胶，以测定细胞的侵袭能力。请点击此处查看该图的放大版本。

1. Ⅰ型胶原蛋白凝胶制备
   1. 首次实验时设置4 h、12 h、24 h、48 h和72 h的时间点，以根据细胞类型确定细胞侵袭进入凝胶的动力学。每次实验均需增加1 h时间点作为参考，此时无细胞侵袭发生。
   2. 在冰上、无菌超净工作台内配制Ⅰ型胶原蛋白溶液。每3个Boyden小室插件需准备500 µL溶液。
   3. 吸取1 mg市售大鼠尾Ⅰ型胶原蛋白，配制成终浓度为2 mg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液。
   4. 加入5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯，终浓度为1 µg/mL，按Ⅰ型胶原蛋白溶液的终体积（本例中为500 µL）计算所需用量。
   5. 充分混匀后，在冰上、避光条件下于无菌超净工作台内孵育5 min。
   6. 加入50 µL冰浴、过滤后的10X PBS和6.25 µL冰浴的1 M氢氧化钠（NaOH）。
   7. 根据公式443.75 - x µL（x为所用Ⅰ型胶原蛋白体积）加入无菌水。
   8. 每个Boyden小室插件中加入100 µL溶液。
   9. 37 °C孵育1 h，使胶原蛋白充分聚合。
   10. 在新培养板孔中加入含胎牛血清（FBS）的细胞培养基，并将插件放入其中。
   11. 在无FBS培养基中，将30,000个细胞接种于Ⅰ型胶原蛋白凝胶表面。
   12. 细胞在37 °C培养后，用含4%多聚甲醛的1x PBS固定Ⅰ型胶原蛋白凝胶30 min。
   13. 按步骤3进行免疫荧光染色，但以下步骤除外：使用含0.2% Triton X-100的1x PBS透化30 min（而非10 min）；一抗和二抗孵育时间均为1.5 h（而非分别为40 min和30 min）。对F-肌动蛋白或细胞核进行染色以定位细胞。
   14. 免疫荧光染色后，用手术刀沿插件膜边缘切割，并小心将Ⅰ型胶原蛋白凝胶转移至玻璃底培养皿中。确保凝胶顶部与玻璃接触。保持插件膜附着在凝胶底部，以维持凝胶完整性。
       注：Ⅰ型胶原蛋白凝胶在玻璃底培养皿中保持完整。玻璃底部与其周围塑料之间的深度等于凝胶厚度。
   15. 在Ⅰ型胶原蛋白凝胶上加盖盖玻片，并用可聚合封片剂封固，防止凝胶干燥。
   16. 使用倒置共聚焦显微镜对Ⅰ型胶原蛋白凝胶成像；凝胶顶部与培养皿的玻璃底部接触。
       1. 从Ⅰ型胶原蛋白凝胶顶部到底部采集z轴层扫图像，以观察细胞侵袭情况。根据细胞侵入成像视野的深度确定z轴扫描厚度。使用40X油镜，以512 x 512像素格式采集图像，z轴步长为0.25 μm。
          注：作为参考，MDA-MB-231细胞接种后第3天的平均z轴扫描厚度为30 µm。

结果

使用两种基质（明胶和I型胶原蛋白）的组合图1 和 4），我们已发现一种新型的侵袭性细胞器，称为线性侵袭体。对这些基质进行标记，可观察到线性侵袭体沿I型胶原纤维的形成过程及其降解能力（图5）。随后可使用前述宏（步骤4.2）对侵袭结构的数量进行定量，也可通过ImageJ软件测定降解活性，具体方法如Martin所述 等 和 Diaz 等^9,10. 混合基质可通过将DDR1定义为线性侵入体形成与功能所必需的受体，实现对线性侵入体的表征（图6).

为了理解细胞的侵袭能力，我们还开发了一种三维I型胶原塞侵袭实验（图3和

讨论

传统上，侵袭性突起（invadosomes）的研究通常在体外（in vitro）进行，且未考虑细胞所处的微环境及其接种基质的影响。目前常用的基质类型包括明胶、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白或高密度纤维状胶原蛋白（HDFC）^7,11；然而，这些基质往往不能真实反映细胞在体内所处的微环境，缺乏生理相关性。本文采用了一种新型基质，由明胶与纤维状I型胶原蛋白共同组成。利用I型胶原蛋白纤维，我们发现了一类新型的侵袭性突起，称为线性侵袭性突起（linear invadosomes），其特异性地在具有生理结构的I型胶原蛋白上形成⁷。通过对I型胶原蛋白进行标记，可观察到线性侵袭性突起沿纤维的分布，并利用Tks5和cortactin等细胞标志物对其形成进行定量分析。借助这种混合基质，我们鉴定出一种新的受体——盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1），其参与了线性侵袭性突起的形成过程⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶溶液	Sigma	G1393	储存液为 20 mg/ml，使用浓度为 1 mg/ml
猪皮来源明胶 Oregon Green 488 标记物	Molecular probe life technologies	G13186	5 mg 溶于无菌水中，配制成 1 mg/ml
显微镜盖玻片	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12 mm，No.1
0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中含 2.5% 戊二醛	Electron microscopy science	15960	用无菌水稀释至 0.5%
1× PBS，pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	所有固定前步骤均使用此 PBS
大鼠尾胶原 I 型	Corning	354236
5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯	Life technologies	C-6125
含钙和镁的 1× DPBS	Gibco by life technologies	14040-091
16% 多聚甲醛溶液	Electron microscopy science	15710	用 1× PBS 稀释至 4%
Triton X-100	Sigma	T9284
10× PBS 缓冲液，pH 7.4	Ambion	AM9625	用水稀释至 1×，用于固定后的各步骤
Tks5 抗体	Santa Cruz	sc-30122	侵袭体标志物，稀释比例：1/100
Cortactin 4F11 抗体	Millipore	5180	侵袭体标志物，稀释比例：1/100
DDR1 抗体	Cell signaling	5583	线性侵袭体受体
稀释比例：1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	丝状肌动蛋白标志物，稀释比例：1/200
Hoechst	Sigma	33258	细胞核标志物，稀释比例：1/200
FluoProbes 二抗	Interchim	FP-488 FP-547H 或 FP-647H
牛血清白蛋白	Sigma	A2153	用 1× PBS 稀释至 4%
Fluoromount G 封片介质	Interchim	FP 483331
ImageJ 软件	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
细胞培养小室	Corning	353097	孔径 8.0µm，24 孔板
氢氧化钠（NaOH）	Sigma	221465