大鼠慢性心肌梗死的组织学定量分析

摘要

啮齿类动物心肌梗死（MI）的死后评估基于对染色心脏切片上梗死区域的定量分析。本文介绍了一种准确量化梗死面积的方法，该方法通过对收获的大鼠心脏从基底部到心尖部进行系统性取样，并对三色染色的组织学切片进行图像分析。

摘要

心肌梗死定义为由于长时间缺血导致的心肌细胞死亡；缺血性损伤之后会引发炎症反应和瘢痕形成（纤维化）。在初始急性期过后，左心室（LV）发生慢性重构，改变心脏的结构与功能。在小型动物中进行永久性冠状动脉结扎已被广泛用作心肌梗死慢性模型的参考方法。梗死区心壁变薄逐渐发展为透壁性纤维化。尽管通常会对梗死面积进行组织学评估，但目前尚缺乏量化方法的标准化。事实上，许多重要的方法学细节，如所分析切片的数量、取样及定量方法，通常未被详细描述，从而限制了不同研究之间的比较。过于频繁地仅基于乳头肌水平的单一切面进行定量分析。鉴于当前正在研究多种旨在减少梗死扩展和心室重构的新策略，建立准确的心脏取样方案的标准化显得尤为重要。本文介绍了一种通过系统性取样收获的大鼠心脏，并对从心底至心尖获取的三色染色组织切片进行图像分析，以精确量化梗死面积的方法。此外，我们还提供了证据表明，通过计算扩张指数（EI），可在评估梗死面积时充分考虑左心室在重构过程中的变化。

引言

心肌梗死（MI）是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。冠心病是其主要原因；MI 通常继发于冠状动脉事件（如血管闭塞）所导致的缺血。若在发病最初 6 小时内未进行再灌注治疗，缺血将引发不可逆的心肌坏死。在临床患者中，MI 的诊断依赖于多种诊断工具，包括临床体征、心电图、血浆生物标志物水平检测、超声心动图、磁共振成像（MRI）以及组织学分析¹。根据心肌坏死发生时间与冠状动脉闭塞时间的相对关系，急性 MI 和慢性 MI 被划分为两种不同的损伤阶段。急性期发生在发病最初 7 天内，其特征为心肌细胞丢失、显著的炎症反应以及成纤维细胞的募集。亚急性期出现在 1 至 4–6 周之间，以心肌组织修复和瘢痕形成为主要特征。慢性期则表现为梗死区域扩展、心室壁变薄以及心室扩张。左心室的广泛重构会逐渐导致严重的心力衰竭²。

通过永久性结扎左前降支动脉（LAD）诱导心肌梗死，是慢性心肌梗死的标准啮齿类动物模型。冠状动脉结扎模拟了冠状动脉闭塞。梗死范围取决于结扎部位。在啮齿类动物模型中，心肌缺血性损伤的经典表征方法包括生物标志物血浆水平（如肌钙蛋白I和T³）、超声心动图、磁共振成像（MRI）以及组织学分析^4,5。生物标志物水平与心肌细胞死亡程度相关。超声心动图用于评估由节段性室壁运动异常引起的心左室功能损害。此外，无创成像技术如MRI或高分辨率超声心动图可评估室壁运动减低程度、灌注减少的瘢痕区域体积与存活心肌，以及室....

方案

所有动物均按照欧洲动物护理公约的规定接受了人道护理。手术操作在获得瑞士弗里堡州兽医办公室许可，并经瑞士联邦兽医办公室批准后，依照瑞士动物保护法进行。

1. 心脏采集

注意：所有外科手术均在异氟烷麻醉下进行。为减轻动物痛苦，已采取多种措施。特别是，所有动物在麻醉前均接受皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。诱导手术的操作方案如下 心肌 梗死此前已在其他文献中描述过¹³.

1. 在麻醉条件下（气管插管动物，2.5% 异氟烷，通过足垫夹捏反射确认麻醉效果）对心肌梗死动物进行胸骨切开术。
   1. 使用手术剪切开皮肤，然后切开肌肉组织。剪断左右两侧肋骨，随后打开胸腔。
   2. 清除前次手术（左前降支结扎术）后残留的粘连组织。剪断主动脉并取出心脏。将组织置于 1 M KCl（溶于 PBS）中，随后用 PBS 洗涤。

2. 组织制备

1. 将梗死的心脏纵向放入丙烯酸大鼠心脏模具中，在 -20 °C 下保存 1 小时。
2. 使用剃刀在基质中对心脏进行横向切割。确保每片厚度为 2 mm。每个心脏大约切取 5 - 7 片（根据重塑程度而定）；此方法称为系统性取样。
3. 此步骤中，可选择性进行2,3,5-三苯....

结果

结扎LAD六周后，从Lewis大鼠中取出心脏，从心尖至心底获取2 mm厚的组织切片。采用TTC染色法以显示梗死区域（呈白色）和健康心肌组织（呈红色）（图2）。根据LAD结扎部位的不同，梗死面积有所差异。大面积心肌梗死表现为从心尖至心底的透壁性梗死（图2A）；较小的梗死则表现为从心尖至心脏中段可见白色梗死组织（图2B）；对于小范围非透壁性梗死，仅在心尖处的一至两个切片中观察到纤维化组织（图2C）。

每张心脏切片均切成5-µm的薄片，并用马松-戈德纳三色染色法染色。在体视显微镜下采集心脏整个横截面的图像（图3）。健康组织呈红色，结缔组织呈绿色。通过图像分析软件可轻松区分不同颜色区域。

讨论

方案中的关键步骤

在慢性心肌梗死大鼠模型中，通过系统性取样采集心脏组织，并对从心尖至心底获取的三色染色组织切片进行图像分析，可准确评估纤维化组织。成功实施该方案有两个关键步骤：首先，使用氯化钾（KCl）采集心脏，可使心肌保持在松弛状态，这对于比较不同心脏的梗死区域尺寸至关重要；其次，切片在Bouin溶液中过夜固定，是获得清晰鲜明三色染色效果的关键步骤。

修改与故障排除

染色缺失可能源于布因溶液固定切片过程中出现的问题，例如孵育时间不足或布因溶液已过期。TTC 染色为可选步骤，可用于快速但非定量地显示梗死面积。需要注意的是，在将心脏组织包埋于 OCT 包埋剂或石蜡之前，可先对同一心脏进行 TTC 染色。

技术的局限性

本方法允许在石蜡包埋和冷冻保存的心脏切片之间进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 毫米丙烯酸大鼠心脏基质	72-5015	Harvard Apparatus
Inspira 高级容控呼吸机	Harvard Apparatus	557058
Insyte 14 G 导管	BD	381267
O.C.T. 包埋剂	BDHA361603E	VWR
氯化三苯基四氮唑（TTC）	T8877-10G	Sigma Aldrich
梅氏苏木精	MHS32-1L	Sigma Aldrich
酸性品红 CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
ponceau 木红 CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
橙黄 G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
亮绿 CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
氯化钾（KCl）	P9333-500G	Sigma Aldrich
二甲苯	10315083	HoneyWell
无水乙醇	10303990	HoneyWell
2-甲基丁烷	M32631-1L	Sigma Aldrich
体视显微镜	SM2800	Nikon
甲醛	99340	Reactolab
包埋盒	K113.1	Carl Roth
Bersoft 图像测量软件		Bersoft.com	授权软件