啮齿类动物心肌梗死（MI）的死后评估基于对染色心脏切片上梗死区域的定量分析。本文介绍了一种准确量化梗死面积的方法，该方法通过对收获的大鼠心脏从基底部到心尖部进行系统性取样，并对三色染色的组织学切片进行图像分析。
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本文内容
摘要
摘要
心肌梗死定义为由于长时间缺血导致的心肌细胞死亡；缺血性损伤之后会引发炎症反应和瘢痕形成（纤维化）。在初始急性期过后，左心室（LV）发生慢性重构，改变心脏的结构与功能。在小型动物中进行永久性冠状动脉结扎已被广泛用作心肌梗死慢性模型的参考方法。梗死区心壁变薄逐渐发展为透壁性纤维化。尽管通常会对梗死面积进行组织学评估，但目前尚缺乏量化方法的标准化。事实上，许多重要的方法学细节，如所分析切片的数量、取样及定量方法，通常未被详细描述，从而限制了不同研究之间的比较。过于频繁地仅基于乳头肌水平的单一切面进行定量分析。鉴于当前正在研究多种旨在减少梗死扩展和心室重构的新策略，建立准确的心脏取样方案的标准化显得尤为重要。本文介绍了一种通过系统性取样收获的大鼠心脏，并对从心底至心尖获取的三色染色组织切片进行图像分析，以精确量化梗死面积的方法。此外，我们还提供了证据表明，通过计算扩张指数（EI），可在评估梗死面积时充分考虑左心室在重构过程中的变化。
引言
心肌梗死（MI）是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。冠心病是其主要原因；MI 通常继发于冠状动脉事件（如血管闭塞）所导致的缺血。若在发病最初 6 小时内未进行再灌注治疗，缺血将引发不可逆的心肌坏死。在临床患者中，MI 的诊断依赖于多种诊断工具，包括临床体征、心电图、血浆生物标志物水平检测、超声心动图、磁共振成像（MRI）以及组织学分析1。根据心肌坏死发生时间与冠状动脉闭塞时间的相对关系，急性 MI 和慢性 MI 被划分为两种不同的损伤阶段。急性期发生在发病最初 7 天内，其特征为心肌细胞丢失、显著的炎症反应以及成纤维细胞的募集。亚急性期出现在 1 至 4–6 周之间，以心肌组织修复和瘢痕形成为主要特征。慢性期则表现为梗死区域扩展、心室壁变薄以及心室扩张。左心室的广泛重构会逐渐导致严重的心力衰竭2。
通过永久性结扎左前降支动脉（LAD）诱导心肌梗死，是慢性心肌梗死的标准啮齿类动物模型。冠状动脉结扎模拟了冠状动脉闭塞。梗死范围取决于结扎部位。在啮齿类动物模型中，心肌缺血性损伤的经典表征方法包括生物标志物血浆水平（如肌钙蛋白I和T3）、超声心动图、磁共振成像（MRI）以及组织学分析4,5。生物标志物水平与心肌细胞死亡程度相关。超声心动图用于评估由节段性室壁运动异常引起的心左室功能损害。此外，无创成像技术如MRI或高分辨率超声心动图可评估室壁运动减低程度、灌注减少的瘢痕区域体积与存活心肌，以及室壁变薄情况。左心室（LV）尺寸可用于精确评估梗死面积。最后，通过收获心脏组织切片进行特异性染色，可在死后对存活与坏死心肌进行定量分析，从而验证梗死面积（IS）。另一重要指标是梗死扩展指数（EI）6的评估。EI与透壁性心肌梗死相关，通常在术后最初3天内开始出现，其特征为室壁厚度进行性减小、左心室腔扩大以及左心室形态的继发性改变。
为了评估新型治疗方法（尤其是基于细胞、基质和基因递送的再生策略）的治疗效果，准确评估啮齿类动物的心肌梗死（MI）具有至关重要的意义。当仅通过乳头肌水平的一个横断面来测量梗死面积（IS）时，由于左前降支（LAD）结扎后梗死发展存在较大变异性，可能导致结果偏差；例如，心尖部的梗死可能被遗漏。值得注意的是，已有研究报道了更为准确的小鼠7-9或大鼠10心肌梗死面积测定方法。然而，仅测量IS不足以准确量化左心室（LV）重构，或治疗干预所引起的重构减轻（或预防）程度。事实上，IS通常表示为在心脏横断面上测定的左心室总体积的百分比。尽管该方法适用于急性心肌梗死的评估，但在重构过程中左心室壁变薄的情况仍未能得到充分评估11,12。对梗死面积和结构变化进行全面的形态计量学定量，应包括多个参数的测量，如心内膜和心外膜的长度与直径，以及梗死区和健康心肌区域的面积。本文介绍一种在慢性大鼠模型中准确评估心肌梗死及心室重构的方法学方案。
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方案
所有动物均按照欧洲动物护理公约的规定接受了人道护理。手术操作在获得瑞士弗里堡州兽医办公室许可，并经瑞士联邦兽医办公室批准后，依照瑞士动物保护法进行。
1. 心脏采集
注意：所有外科手术均在异氟烷麻醉下进行。为减轻动物痛苦，已采取多种措施。特别是，所有动物在麻醉前均接受皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。诱导手术的操作方案如下 心肌 梗死此前已在其他文献中描述过13.
- 在麻醉条件下（气管插管动物，2.5% 异氟烷，通过足垫夹捏反射确认麻醉效果）对心肌梗死动物进行胸骨切开术。
- 使用手术剪切开皮肤，然后切开肌肉组织。剪断左右两侧肋骨，随后打开胸腔。
- 清除前次手术（左前降支结扎术）后残留的粘连组织。剪断主动脉并取出心脏。将组织置于 1 M KCl（溶于 PBS）中，随后用 PBS 洗涤。
2. 组织制备
- 将梗死的心脏纵向放入丙烯酸大鼠心脏模具中，在 -20 °C 下保存 1 小时。
- 使用剃刀在基质中对心脏进行横向切割。确保每片厚度为 2 mm。每个心脏大约切取 5 - 7 片（根据重塑程度而定）；此方法称为系统性取样。
- 此步骤中，可选择性进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色（保持心脏切片从基底部到心尖的方向）。
- 在37 °C下用1% TTC的PBS溶液孵育50分钟。用4%多聚甲醛（PFA）孵育20分钟至1小时。将切片置于两块载玻片之间，使用2 mm间隔片固定，在体视显微镜下耦合相机以15倍放大倍数拍摄图像。
警告！ 多聚甲醛具有毒性。
- 在37 °C下用1% TTC的PBS溶液孵育50分钟。用4%多聚甲醛（PFA）孵育20分钟至1小时。将切片置于两块载玻片之间，使用2 mm间隔片固定，在体视显微镜下耦合相机以15倍放大倍数拍摄图像。
- 冷冻切片（1st 选项
- 将每张切片置于塑料模具（10 × 10 × 5 mm）中，加入冷冻切片包埋介质（最佳切割温度介质，OCT），保持切片方向（将组织尖端朝向的一侧向下放置于模具底部）。在液氮冷却条件下，用2-甲基丁烷蒸气冷冻10–15分钟。最后，将组织于-80 °C保存。
- 石蜡包埋（2nd 选项
- 将每张切片放入包埋盒中（保持方向，将切片顶端朝下的面置于包埋盒底部），然后置于4% PFA中固定24小时。随后放入组织处理机中过夜。
- 在70%乙醇中孵育2小时。在95%乙醇中孵育2小时。在100%乙醇中孵育3小时。在二甲苯中孵育4小时。在石蜡（于60 °C烘箱中熔化）中孵育5小时。最后，将每张心脏切片包埋于石蜡中制备成组织块。
- 将每张切片放入包埋盒中（保持方向，将切片顶端朝下的面置于包埋盒底部），然后置于4% PFA中固定24小时。随后放入组织处理机中过夜。
3. 马松-戈德纳三色染色法
- 使用手动切片机从石蜡包埋块中制备组织切片（厚度：5 µm），或使用设定为 -18 °C 的冷冻切片机从 OCT 包埋块中制备组织切片（厚度：7 µm）。
- 对每只大鼠每个心脏部位的切片中选取一张进行 Masson-Goldner 三色染色（参见附录）。
注意：对于石蜡切片，请从此步骤开始。- 将切片置于 60 °C 烤箱中烘烤融化。在通风橱内，用二甲苯脱蜡两次，每次 10 分钟。随后依次在 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水中各浸泡 3 分钟进行水化。
注意：对于冷冻切片，请从此步骤开始。 - 用 Bouin 溶液固定过夜。然后用流动自来水冲洗 10 - 15 分钟，再用蒸馏水冲洗。将切片置于 Mayer 苏木精染液中孵育 3 分钟。
- 取出切片，置于蒸馏水中漂洗 5 分钟。随后放入酸性品红-ponceau 染液中孵育 5 分钟，再用 1% 乙酸溶液冲洗 1 分钟。
- 接着将切片置于磷钼酸-橙黄 G 染液中孵育 1 分钟，用 1% 乙酸溶液冲洗 1 分钟，再放入亮绿染液中孵育 10 分钟，最后再次用 1% 乙酸溶液冲洗 1 分钟。
- 依次在 70% 乙醇（30 秒）、95% 乙醇（30 秒）和 100% 乙醇（5 分钟）中脱水。在组织切片上滴加一滴树脂封片剂，加盖盖玻片，静置干燥。
- 将切片置于 60 °C 烤箱中烘烤融化。在通风橱内，用二甲苯脱蜡两次，每次 10 分钟。随后依次在 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水中各浸泡 3 分钟进行水化。
4. 梗死面积分析
- 在体视显微镜（15倍放大）连接相机的条件下，从每张载玻片获取一幅图像。使用相同设置拍摄一把标尺的照片。
- 使用图像分析软件测量梗死区中部的瘢痕厚度、室间隔厚度、左心室（LV）腔面积、梗死面积以及左心室组织面积。
- 使用标尺图片设置比例尺（图1A).
- 点击 测量 然后选择 设置转换因子. 在校准条上画一条线。右键点击图片，然后点击 末端校准. 记录柱状图数值，然后单击 好的.
- 从染色的心脏图片中选择左心室（LV）图1B）。使用 多个片段 工具。逐点选择左心室，然后右键单击 复制/粘贴 任何地方
- 使用以下方法测量瘢痕和室间隔厚度 单段测量工具 (图1C).
- 自动检测左心室腔、梗死区域及左心室面积 自动面积测量工具 在 RGB 模式下（图1D).
- 点击该工具。激活 仅限边界 和 连续的 在RGB模式下。最后，单击目标区域以进行检测。如有必要，使用精确工具。
- 使用标尺图片设置比例尺（图1A).
- 以梗死面积与左心室（LV）面积的比值计算梗死大小。
- 按以下公式计算扩张指数：[左心室腔面积 / 整个左心室面积] / [梗死区厚度 / 室间隔厚度]，其中整个左心室面积包含左心室腔和左心室组织面积。
- 最后，计算一个 "平均值" 每个心脏的计算方法如下：[梗死切片扩张指数的平均值] × [梗死切片数量 / 切片总数]。
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结果
结扎LAD六周后，从Lewis大鼠体内取出心脏，从心尖至心底获取2 mm厚的组织切片。采用TTC染色法以显示梗死区域（呈白色）和健康心肌组织（呈红色）（图2）。根据LAD结扎部位的不同，梗死面积有所差异。大面积心肌梗死表现为从心尖至心底的透壁性梗死（图2A）；较小的梗死表现为从心尖至心脏中段可见白色梗死组织（图2B）；而对于小范围非透壁性梗死，仅在心尖处的一至两个切片上观察到纤维化组织（图2C）。
对每份心脏切片进行5 µm的薄切，采用马松-戈尔纳三色染色法（Masson-Goldner trichrome）染色。在体视显微镜下获取心脏完整横切面的图像（图3）。健康组织呈红色，结缔组织呈绿色。通过图像分析软件可轻松区分不同颜色区域。
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讨论
方案中的关键步骤
在慢性心肌梗死大鼠模型中，通过系统性取样采集心脏组织，并对从心尖至心底获取的三色染色组织切片进行图像分析，可准确评估纤维化组织。成功实施该方案有两个关键步骤：首先，使用氯化钾（KCl）采集心脏，可使心肌保持在松弛状态，这对于比较不同心脏的梗死区域尺寸至关重要；其次，切片在Bouin溶液中过夜固定，是获得清晰鲜明三色染色效果的关键步骤。
修改与故障排除
染色缺失可能源于布因溶液固定切片过程中出现的问题，例如孵育时间不足或布因溶液已过期。TTC 染色为可选步骤，可用于快速但非定量地显示梗死面积。需要注意的是，在将心脏组织包埋于 OCT 包埋剂或石蜡之前，可先对同一心脏进行 TTC 染色。
技术的局限性
本方法允许在石蜡包埋和冷冻保存的心脏切片之间进...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会［SNF 310030-149986 至 MNG］、弗里堡大学和弗里堡医院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 毫米丙烯酸大鼠心脏基质 | 72-5015 | Harvard Apparatus | |
| Inspira 高级容控呼吸机 | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Insyte 14 G 导管 | BD | 381267 | |
| O.C.T. 包埋剂 | BDHA361603E | VWR | |
| 氯化三苯基四氮唑（TTC） | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| 梅氏苏木精 | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| 酸性品红 CI 42685 | F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| ponceau 木红 CI 16150 | P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| 橙黄 G CI 16230 | O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| 亮绿 CI 42095 | L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| 氯化钾（KCl） | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| 二甲苯 | 10315083 | HoneyWell | |
| 无水乙醇 | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-甲基丁烷 | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| 体视显微镜 | SM2800 | Nikon | |
| 甲醛 | 99340 | Reactolab | |
| 包埋盒 | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft 图像测量软件 | Bersoft.com | 授权软件 |
参考文献
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