使用套管技术进行小鼠主动脉移植模型的建立——教学视频

摘要

我们介绍了一种在小鼠中采用套管技术的原位主动脉移植模型。这是一种非常快速的吻合方法，可用于血管疾病的研究。

摘要

采用套管技术进行原位主动脉移植可减少对主动脉的损伤，失败率仅为10-20%。在小鼠中使用套管法吻合主动脉所需时间短且操作简便，平均仅需20分钟，便于开展同系或异系移植研究。以下文章描述了我们实验室所使用的主动脉移植操作步骤。小鼠通过面罩吸入1.5%体积浓度的异氟烷与100%氧气的混合气体进行麻醉。随后，将肾动脉至主动脉分叉之间的主动脉段从下腔静脉分离，充分游离，并在近端和远端使用单股丝线结扎夹闭。在切除主动脉前，经下腔静脉注射含肝素的生理盐水溶液。然后在夹闭段之间切断主动脉，并用含肝素的生理盐水冲洗管腔。采用单丝缝线的套管技术将腹主动脉移植至原位。

引言

如先前一项研究所指出，小鼠主动脉移植模型受到了广泛关注，该模型能够区分移植物本身引起的特异性血管反应与动脉生成环境相关的某些系统性因素^1,2,3。其中一个重要因素在于存在多种基因敲除和转基因小鼠。将这些小鼠应用于该模型，有助于识别和确定与退行性血管疾病（如动脉粥样硬化和动脉瘤形成）发展相关的新病理生理通路^4,5。

值得注意的是，在移植过程中，移植物血管可能发生固有的缺血/再灌注损伤。因此，术后期间出现移植物完整性方面的特定问题或意外的炎症反应是可能的，这些情况或许会引发退行性血管疾病中的病理生理学改变^3,4,5,6,7。套管吻合术是一种替代性的端对端动脉吻合方法，适用于直径小于1毫米的血管，在大鼠肾移植和心脏移植中已成功应用，并由Dambrin et al.^8,9,10,11进一步改良后应用于小鼠主动脉移植。

采用袖状移植技术可最大限度地减少主动脉损伤，因其平均操作时间仅需20分钟，技术失败率极低。我们先前的研究结果已证实同基因移植物具有优异的功能性和结构特性 体内 采用袖状技术移植后¹. Dambrin 等 描述在经过短暂的学习曲线后，成功率超过78%¹⁰。血栓等并发症较为罕见，例如Engelbrecht 等 在大鼠肾移植中采用套管技术未观察到血栓形成⁸.

采用套管吻合的鼠类主动脉移植模型是一种快速且简便的研究移植血管中同种/异种移植物反应的工具。本视频展示了我们实验室进行的主动脉移植操作过程。该移植模型可能有助于阐明血管退行性疾病的潜在病理机制，并可为进一步评估分子和药物干预措施提供帮助¹²。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得亚琛工业大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为 AZ 84-02.04.2012.A234。

注意：本实验操作以CD1背景的成年雄性野生型小鼠为例进行演示。手术前后均应将小鼠饲养在专门的实验动物设施中，确保其能够正常获取食物，并接受专业的兽医监测与治疗。若动物从外部机构购买，需在手术前给予一周的适应性饲养。

1. 供体的准备

1. 使用无菌材料和器械以在手术期间维持无菌条件，避免感染。
2. 通过面罩给予每只小鼠体积分数为1.5%的异氟烷与100%氧气的混合气体进行麻醉。将小鼠仰卧位放置于平台，并用胶带固定四肢于手术台上。通过夹捏后肢检查其反射，以确认小鼠已充分麻醉。在眼睛上涂抹眼用软膏，防止手术过程中角膜干燥。
3. 使用脱毛凝胶或剃须刀去除腹部所有毛发。在无菌条件下进行手术操作。用氯己定和无菌水交替擦洗腹部进行消毒。
4. 使用剪刀或手术刀经腹正中切口取出供体主动脉。手动将肠管向右侧牵开。使用无粉手套轻轻手动将肠管推至一侧。
   1. 将肠管置于用生理盐水浸湿的纱布上，以保持其湿润。
   2. 使用镊子进行钝性分离，仔细将腹主动脉从周围组织中解剖出来。
   3. 使用镊子分离位于肾动脉之间至其与下腔静脉分叉处的主动脉节段。
   4. 使用11-0单股缝线仔细结扎该节段的所有细小分支。
   5. 在取出主动脉前，向下腔静脉内注射0.5毫升（mL）含50 U肝素的生理盐水溶液。
   6. 在主动脉节段取出后，使供体动物完全放血。
   7. 用生理盐水充分冲洗移植物，然后立即转移至盛有冰冻生理盐水的容器中。

2. 受体的准备

1. 通过面罩使用体积分数为1.5%的异氟烷与100%氧气的混合气体对受体动物进行麻醉，随后去除毛发并进行消毒（第1节）。使用手术刀从剑突至骨盆做正中切口，并牵开腹壁。在术中为眼睛涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
2. 将肠管用生理盐水浸湿的纱布包裹，并轻柔地向动物右侧推移。
3. 使用镊子游离肾下腹主动脉，近端至肾动脉之间，远端至分叉处。
4. 使用11-0单丝缝线仔细结扎该节段的所有细小分支。
5. 使用6-0单股丝线夹闭腹主动脉的近端和远端部分。
6. 在两个夹闭点之间的中点切断腹主动脉，并用肝素化生理盐水冲洗断端，以保持管腔通畅。
7. 将移植物置于原位，先将供体血管端插入受体血管，然后使用11-0单丝缝线缝合，注意正确对齐供体与受体，避免腹主动脉发生扭转（图1）¹⁰。
8. 在检查吻合口后，小心松开结扎线。先松开远端夹闭。这可在松开近端高压侧之前，使管壁在低压下保持贴合。
9. 立即灌注移植物，并观察是否有可见脉搏。轻柔清除残留的丝线。供体与受体腹主动脉之间的最佳重叠长度为1–2 mm。
10. 将腹腔内容物还纳至腹腔内，使用连续的3-0聚乙醇酸缝线关闭整个切口。
11. 在终止麻醉前，给予小鼠布托啡诺（0.05 mg/kg体重，皮下注射（SC））。
12. 在动物完全清醒前不得无人看护。根据机构监管机构批准的方案，术后三天内每日三次皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg体重）进行疼痛管理。
13. 对于组织取材，按上述方法麻醉受体小鼠，经心脏穿刺用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注血管，随后灌注4%多聚甲醛/PBS（pH = 7.4）。轻柔取出移植物。在4%多聚甲醛/PBS中固定过夜后，进一步处理标本并包埋于石蜡中。

结果

小鼠在15-30分钟内从麻醉中恢复，未观察到身体功能障碍，但血栓形成的风险有所升高。术后随访期间采用超声分析。研究中使用的野生型小鼠其管腔尺寸未出现变化。因此，未观察到狭窄或动脉瘤样结构的形成。移植动物未表现出血管壁斑块的发育（图2）。

传统的染色方法（如免疫组织化学）可用于确定斑块、平滑肌细胞的分布模式以及巨噬细胞的聚集情况。在本研究中，组织学和免疫组织化学染色在移植后6周进行，以检测移植物的完整性。组织学染色（苏木精-伊红（HE））和免疫组织化学染色（平滑肌肌动蛋白（SMA）和巨噬细胞标记物（MAC2））（图3）显示，平滑肌细胞的分布模式未发生改变，内皮细胞层完整，内膜中无细胞聚集。这些结果表明，在移植的血管中未检测到明显的病变或细胞活化（图3）。

图1：套管技术。腹主动脉采用套管技术进行移植。在此手术中，将供体主动脉置于解剖学原位，并在供血血管上进行浅层缝合。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：术中及超声图像。移植后6周的术中（尸检）移植物观展示例（A），其三维超声图像（B）和B型超声图像（C）。术后随访采用超声检查进行。图像显示移植物通畅，管腔尺寸无变化。此外，未观察到狭窄或动脉瘤样结构形成。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：组织学与免疫组织化学图像。移植后 6 周动物的组织学与免疫组织化学代表性图像。组织学检查（苏木精-伊红染色，HE，100 倍放大，比例尺 = 50 µm）和免疫组织化学染色（平滑肌肌动蛋白 SMA（红色）或巨噬细胞 MAC2（绿色），200 倍放大，比例尺 = 25 µm）均未在移植的主动脉中发现显著病变。细胞核经 DAPI 复染（蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在本研究之前，已有多种小鼠移植模型被深入分析^{3,6,7,10,13,14}。我们选用了由 Dambrin et al. 改进的套管法主动脉移植模型，因其符合我们的标准，且与传统的端对端缝合方法相比，套管吻合具有更高的可靠性^1,10。

该技术具有多种优势，可显著缩短阻断时间，从而最大限度地减少手术期间对主动脉的损伤。此外，该技术血栓发生率较低，并避免了供体与受体血管管径之间可能存在的不匹配问题。上述特点使该技术非常适合用于研究小鼠主动脉移植中的血管疾病。

在一项后续研究中，移植术后8周进行了超声检查，未检测到显著变化。这证实了手术过程中对主动脉造成的任何损伤均极小的假设¹。

本文介绍的移植手术方法可确保移植物的完整性和功能均不受影响。因此，可以认为这种实验性移植模型可作为未来在基因工程小鼠中研究退行性血管疾病的有价值的工具。

我们认为，该视频指南可作为教学材料，用于展示这种简单的动脉-动脉模型的应用，并将有助于进一步深入探讨血管病理学中的诸多重要问题。这种极为快速的吻合方法可用于研究基因工程小鼠中的血管疾病，也可作为结合移植的动脉瘤模型的一种改良方法。

手术过程中存在几个关键环节。缝合操作本身是最关键的步骤。外科医生必须注意通过正确对齐供体与受体，避免主动脉发生任何扭转。在检查吻合口无误后，需小心地移除血管夹。应首先松开远端血管夹，使血管壁在低压下贴合，然后再松开近端的高压侧血管夹。若未按此顺序松开血管夹，则可能导致出血。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
哈尔西持针器	精细科学工具公司	12001-13
杜蒙特#5镊子	精细科学工具公司	11254-20
莱克瑟-婴儿剪刀	精细科学工具公司	14079-10
卡斯特罗维霍显微持针器	精细科学工具公司	12060-01
范纳斯剪刀	爱施康，德国	型号 OC498R
卡斯特罗维霍缝合镊	盖德，德国	19015
6-0黑色丝线（丝线）	德克纳特尔，美国北卡罗来纳州研究三角园	18020-60- FST
11-0单丝线（Ethilon）	爱惜康，德国诺德施泰特	EH7438G
3-0聚乙醇酸缝线（Serafit）	塞拉格-威斯纳，德国纳伊拉	60203214
异氟烷	任意通用品牌
肝素	任意通用品牌
0.9%生理盐水	任意通用品牌
丁丙诺啡	任意通用品牌
贝潘廷眼鼻膏	拜耳，德国
显微镜	蔡司	Opmi MDO/S5
蒸发器	艾克迈耶	TEC3
超声仪	Vevo，加拿大	770,2100